Изтриването на Alox15 подобрява бъбречната дисфункция и инхибира фиброзата чрез повишен PGD2 в бъбрека
Mar 12, 2022
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
Въведение
Полиненаситените мастни киселини (PUFA) и техните метаболити са свързани с възпалението и неговото разрешаване в няколко органа [1]. Оксилипините, които се произвеждат чрез окисление на PUFA, са важни за биологичната активност на PUFA като липидни медиатори [1, 2]. Биосинтезата на оксилипини се медиира от няколко ензима, като липоксигеназа (LOX), циклооксигеназа (COX) и цитохром P450 (CYP) [3]. Тези ензими произвеждат няколко липидни метаболита, като простагландини, левкотриени и липоксини, които всички са силно включени в регулирането на възпалението [1, 4]. Например, ALOX15, основен подтип на LOX, има двоен аспект на провъзпалителни и противовъзпалителни свойства чрез своите метаболити [5]: ALOX15 е силно експресиран в еозинофили, бронхоалвеоларни епителни клетки и алвеоларни макрофаги при непатологични състояния [5, 6 ] и насърчава тежестта на астма [7], белодробно увреждане [8] и сърдечна недостатъчност [9], като има предвид, че противодейства на възпалението при артрит [10] и исхемичен мозък [11]. Освен това, липидните медиатори и техните ензими влияят на органната фиброза, както и на възпалението. Специфични липидни медиатори участват в патогенезата на фиброзата на белия дроб [12], черния дроб [13] и сърцето [14]. По същия начин, гореспоменатият ALOX15 също е свързан с патогенезата на фиброза като дермална фиброза [15].
Едно от често срещаните хронични заболявания е хроничното заболяване на бъбреците(ХБН), което засяга приблизително 8–16 процента от общата популация във всички етапи заедно [16]. Въпреки че патогенезата на ХБН е сложна и варира в зависимост от основното заболяване,бъбректъканта обикновено става дисфункционална, което води до краен стадийбъбречна недостатъчностпричинени от хронично възпаление и последваща фиброза [17]. Както бе споменато, липидните медиатори, получени от PUFAs, са силно свързани с възпалението и произтичащата от него фиброза. Например, липоксините и резолвините инхибират бъбречната фиброза [18, 19], но тези ефекти все още не са изследвани в модела на ХБН с увреденабъбречна функция.Освен това, изчерпателни липидомни профили при ХБНбъбректъкани все още не са докладвани. По този начин ролята на липидните метаболитни ензими и техните продукти в патогенезата на ХБН остава слабо разбранаТова проучване имаше за цел да изясни участието на ензимите, метаболизиращи мастните киселини, и техните продукти вбъбречнаувреждане на 5/6 нефректомирани (Nx) CKD моделни мишки. Това проучване разкри, че нивата на транскрипция и протеинова експресия на Alox15 са повишени при ХБНбъбреци, и Alox15−/− мишки демонстрират подобрениебъбрекдисфункция и фиброза в модела на ХБН. Освен това, PGD2, който е повишеният липиден метаболит в ХБНбъбрецина Alox15−/− мишки, инхибира епително-мезенхимния преход (EMT) в проксималните тубулни култивирани клетки. Следователно, инхибирането на Alox15 и/или приложението на PGD2 може да бъде нова терапевтична цел на ХБН и фиброза.
Ключови думи:хронично бъбречно заболяване; липоксигеназа; ALOX15; Медиаторни липидомици; Полиненаситени мастни киселини; бъбречна
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ
Материали и методи
Животни и експериментиТова проучване използва 8-седмични мъжки мишки C57BL/6 J (CLEA Япония), които са били аклиматизирани за 1 седмица преди провеждането на всички експерименти. Освен това, Alox15-/- мишки са генерирани на фона на C57BL/6 J (Jackson Laboratory), а моделът 5/6 Nx е установен съгласно предишно проучване [20]. Взехме кръвни проби за оценка набъбречна функцияибъбректъканни проби за имуноблотинг и полимеразна верижна реакция на 8 седмици след 5/6 Nx и за хистологичен анализ на 40 седмици след 5/6 Nx. Всички експерименти отговарят на насоките за изследване на животни на TMDU и Комитетът за грижа и използване на животните на TMDU одобри нашия протокол за изследване (номер на одобрение: A2019-117C4).
LC-MS/MS-базирани медиаторни липидомициПроведохме LC-MS/MS анализ, както е описано по-рано [21, 22]. Подробности за процедурата са описани в Допълнителни методи,Други експериментални методиОписахме други експериментални методи в Допълнителни методи.
Резултати
Нивото на иРНК на Alox15 се е повишило в 5/6 Nx бъбрекКоличествените промени на оксилипиновите ензими в ХБНбъбрекбяха изследвани чрез прилагане на C57BL/6 мишки за фиктивна операция или 5/6 Nx, както е описано по-рано [20]. За да анализираме експресията на основните оксилипинови ензими, експресирани в бъбрека (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 и Cyp2c44) [23, 24], ние екстрахирахмебъбрекмостри. Сред ензимите Alox15 в 5/6 Nxбъбрециимаше значително повишено ниво на иРНК (P=0.0004) в сравнение с това при фалшивабъбреци(Фиг. 1). Обратно, нивата на тРНК на другите основни ензими не се променят значително в този модел на CKD.
Нивото на протеин на Alox15 е повишено в бъбречните проксимални тубулни клеткиВ 5/6 Nxбъбрецинивата на ALOX15 протеин също са повишени (P=0.0078), както се очаква от повишени транскрипционни нива (Фиг. 2а). За да се определи кои типове клетки са повишили нивото на протеин Alox15 в CKDбъбрек,ние изследвахме локализацията на Alox15 mRNA чрез in situ хибридизация. In situ хибридизация към иРНК разкри, че високото ниво на експресия на Alox15 е локализирано прибъбречнатубулни клетки в модела 5/6 Nx, но не и в гломерулите (фиг. 2b). Хистологичните характеристики предполагат, че Alox15 mRNA е силно експресирана в проксималните тубули.
Alox15−/− мишките са резистентни към бъбречно увреждане и фиброза в модела 5/6 NxВ 5/6 Nx CKDбъбрецинивата на транскрипция и протеинова експресия на ALOX15 бяха повишени. Затова проучихме дали и как ALOX15 играе роля при ХБН по отношение набъбрекдисфункция и бъбречна фиброза. За тази цел Alox15-/- мишки бяха приложени към модела 5/6 Nx CKD. Интересно е, че нивата на серумния Cre и уреен азот в кръвта (BUN) са по-ниски при Alox15−/− 5/6 Nx мишки
отколкото тези при мишки от див тип (WT) (фиг. 3а), което показва, че изчерпването на Alox15 показва защитен ефект при патогенезата на ХБН. Съответно, NGAL (aбъбречно уврежданемаркер) протеиновата експресия е потисната при Alox15-/- мишки в сравнение с тази при WT мишки (Фиг. 3b). В допълнение, мишка Alox15−/−бъбреципоказаха намалени нива на мРНК на Col1a1, Fn и Acta2 (SMA) (Фигура 3c), и също така показаха намалена експресия на фибронектин и SMA протеин (Фигура 3d). Освен това, мишка Alox15−/−бъбреципоказват ясно потиснати интерстициални фиброзни промени, показани в трихромното оцветяване на Masson (фиг. 3e). Следователно делецията на Alox15 се подобрявабъбрекдисфункция и фиброза при животински модел с ХБН.
Липидомиката на медиатора разкрива променен метаболизъм на PUFA в Alox15−/− бъбреци с ХБНКакто е споменато в раздела Въведение на тази статия, биологичните ефекти на Alox15 са свързани с липидните медиатори, генерирани от Alox15. За изясняване на профила на липидните метаболити, произведени от Alox15 в ХБНбъбрек,ние разгледахме и сравнихме фалшивия и 5/6 Nxбъбрекпроби от LC-MS/MS-базирана медиаторна липидомика за определяне на профилите на липидния медиатор между WT мишки и Alox15-/- CKD мишки (допълнителна таблица 1). Таблица 1 показва липидни метаболити, които са значително различни между Alox15 plus / plus и Alox15−/− мишки при 5/6 Nx състояние. В допълнение, ние направихме карти на пътя на липидните медиатори с класификация по техните субстрати и техните метаболизиращи ензими (фиг. 4). Серия от получени от Alox15-PUFA метаболити, като 14-HDoHE, 17-HDoHE и 15-HEPA [5, 25–27], е значително повишена в модели на ХБН, които корелират добре до повишеното ниво на експресия на ALOX15 вбъбреци (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">бъбрецив сравнение с тези при WT CKD бъбреци, докато само PGD2 е значително увеличен при Alox15−/− CKD бъбреци (фиг. 6).
PGD2 потиска ЕМТ в култивирани бъбречни клеткиЕфектите на липидните метаболити, които са значително различни между Alox15 plus / plus и Alox15−/− мишки при 5/6 Nx състояние, бяха изследвани чрез прилагане на тези липиди към NRK-52E клетки, които бяха активирани от профибротичен цитокин TGF - 1. Ние оценихме експресията на mRNA на Cola1a и Acta2 (SMA) в отговор на TGF- 1, за да определим ефектите на тези липиди в културата (фиг. 7а). Сред тях PGD2 придава мощен антифибротичен ефект върху NRK-52E клетки в отговор на TGF- 1. Потискащият ефект на PGD2 върху експресията на COL1A1 и SMA е зависим от дозата с EC50 съответно от 7.12 μM и 6.48 μM (Фигура 7b). Освен това проведохме същите експерименти в HK-2 клетки, които са обезсмъртени епителни клетки на проксималните тубули от нормален възрастен човекбъбреци,и откри подобен резултат, т.е. инхибиране на COL1A1 и SMA по дозозависим начин, в отговор на лечение с PGD2 (фиг. 7с). Следователно, повишени нива на PGD2 в Alox15−/− CKDбъбрециможе да допринесе за антифиброзните ефекти при ХБН.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
15-PGDH, основен PGD2-метаболизиращ ензим, е намален в Alox15−/− бъбреци с ХБНЗа да се изясни механизмът на повишаване на PGD2 вбъбрецина Alox15−/− мишки модел на CKD, ние измерихме нивото на mRNA на PGD2 синтазата. PGD2 синтазата (PGDS) има две изоформи: липокалин PGDS (L-PGDS) и хематопоетична PGDS (H-PGDS) [28]. Нивата на L-PGDS и H-PGDS бяха значително повишени при 5/6 Nx условия в сравнение с тези при фалшиви условия вбъбрецина WT мишки (фиг. 8а, и двете P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, за които е известно, че са основни PGD2-метаболизиращи ензими [29, 30]. Докато нивата на иРНК на COX-1, COX-2 и AKR1C18 бяха непроменени, нивото на иРНК на 15-PGDH беше значително намалено при ХБНбъбрецина Alox15−/− мишки в сравнение с тези на WT мишки (фиг. 8b, P=0.0325), което потенциално води до повишаване на PGD2 при CKDбъбрецина мишки Alox15−/−.
Дискусия
Това проучване демонстрира, че при ХБНбъбрекпроби, нивата на транскрипция и протеин на Alox15 бяха повишени ибъбрекдисфункцията и фиброзата се подобряват при Alox15−/− мишки. В допълнение, LC-MS/MS-базирани медиаторни липидомици разкриха, че Alox15−/− CKD мишкабъбрециимат значително повишени нива на PGD 2 в сравнение с WT мишки. PGD2 инхибира ЕМТ на NRK-52E и HK-2 клетки; следователно, увеличаването на PGD2 може да допринесе за устойчивостта на Alox15−/− мишки къмбъбречно уврежданеи фиброза. Връзката междубъбречно заболяванеи липидните профили с използване на липидомици върху човешки серум или плазма са обстойно изследвани [31–33], но не и върхубъбректъкан. По подобен начин, въпреки че докладите за липидомика, използващи животински модели с ХБН, са малко [34–36], всички тези проучвания извършват липидомика върху плазмени проби от животински модел с ХБН; обаче, няма цялостна липидомикабъбреквсе още са докладвани тъкани от модела на CKD. Директната липидомика върху тъкан също е ефективна, както и плазмени проби, при идентифициране на функционални метаболити. Освен това метаболитните промени в тъканите, както и кръвните проби, са значително различни по орган [20]. В настоящото проучване, ние подробно анализирахме профила на липидни медиатори, получени от PUFA вбъбректъкани на животински модел с ХБН.
Това проучване се фокусира върху ALOX15, който е един от основните ензими, които метаболизират PUFA. В това проучване нивата на експресия на протеин и иРНК на ALOX15 са ясно повишени при ХБНбъбреци. Обърнахме внимание на типовете клетки, отговорни за експресията на ALOX15 при ХБНбъбреци,и чрез in situ хибридизация открихме повишена експресия на ALOX15 mRNA вбъбречнатубулни клетки в модела 5/6 Nx.
ALOX15 участва в хронични заболявания, като атеросклероза, и неговото заличаване в модели на животински заболявания подобрява тези заболявания [5]. По отношение на асоциирането на ALOX15 сбъбречно заболяване, протеинурията е намалена при мишки Alox15−/− при гломерулно увреждане чрез модел на индуцирана от стрептозотоцин диабетна нефропатия [37]. Този модел на мишка със захарен диабет обаче не показва никакъв спад вбъбречна функция; по този начин механизмът за това как ALOX15 се свързва с нарушенабъбречна функцияв моделите CKD остана неизяснен. В настоящото проучване, използвайки модела на мишка 5/6 Nx, открихме, че делецията на ALOX15 се подобрявабъбрекдисфункция ибъбречнафиброза в модел на ХБН. Към днешна дата само IL-4 и IL-13 в моноцитите са известни като регулаторни фактори, които директно повишават експресията на ALOX15 [5]. Въпреки това остава неясно какво увеличава ALOX15бъбречнатубулни клетки. Известно е, че различни цитокини и уремични токсини са повишени в плазмата и бъбреците при ХБН [38, 39]. Сред тях може да има нови регулатори на ALOX15. Необходими са допълнителни проучвания за изясняване на основните регулаторни фактори на ALOX15 при ХБН. В нашите проучвания за идентифициране на специфични интервенционни оксилипини, които свързват делецията на Alox15 с неговия ренопротективен ефект в модела 5/6 Nx, открихме, че PGD2 може да участва в резистентността къмбъбречно уврежданепричинени от изтриване на ALOX15. Като общо разбиране, за генериране на PGD2, COX-1 и
CCOX-2 произвежда PGG2 от арахидонови киселини, който след това се превръща в PGH2. Когато PGH2 се метаболизира от PGD2 синтаза (PGDS), се произвежда PGD2 [28]. PGDS има две генетично различни изоформи, а именно PGDS от липокалин тип (L-PGDS) и PGDS от хематопоетичен тип (H-PGDS) [28]. Въпреки че PGD2 е повишен в мишка Alox15−/− CKDбъбреци, нито L-PGDS, нито H-PGDS са увеличени при мишка с Alox15−/− CKDбъбреци, въпреки голямото увеличение на PGDS в мишка WT CKDбъбреци(фиг. 8а). Освен това, ние също така разкрихме, че нито COX-1, нито COX-2 са повишени в бъбреците на Alox15−/− CKD мишки (фиг. 8b). Тези резултати предполагат, че увеличението на PGD 2 в бъбреците на Alox15−/− CKD мишки не се дължи на увеличаване на синтазите, а поради повишената наличност на субстрат или инхибиране на разграждането, и всъщност ние разкрихме намаляване на {{ 7}}PGDH, един от основните ензими, метаболизиращи PGD2 [29], в Alox15−/− миши бъбреци с CKD (фиг. 8b). Необходимо е допълнително изследване, за да се изясни причината, поради която делецията на Alox15 води до намаляване на 15-PGDH.
Както бе споменато по-горе, PGD2 може да участва в резистентността къмбъбречно уврежданепричинени от загуба на ALOX15. В това проучване PGD2 инхибира EMT от TGF- 1 в NRK-52E и HK-2 клетки, представляващи проксимални тубулни клетки. PGD2 се свързва с два различни рецептора, свързани с G протеин, а именно DP1 и DP2, чиито функции са различни [28]. Въпреки това, в нашите in vitro експерименти, PGD2 е ефективен при концентрации, вариращи от 4 до 32 μM, които са относително високи, като се има предвид, че стойностите на Ki на DP1 и DP2 са съответно 1,7 nM и 2,4 nM [28]. Този резултат показва, че PGD2 може да упражнява антифиброзни ефекти не чрез G протеин-свързани рецептори, а чрез други пътища като PPAR, чрез които е известно, че 15-d-PGJ2, PGD2 метаболит надолу по веригата, упражнява своите ефекти [28]. В това проучване, което се фокусира върху липидните метаболитни ензими и техните метаболити, инхибирането на ALOX15 и/или приложението на PGD2 може да бъде обещаваща терапевтична цел за ХБН. За съжаление не е разработен специфичен инхибитор на ALOX15, който може да се използва в клиничната практика [40, 41]. Терапевтичното насочване към функционални метаболити надолу по веригата, като PGD2, вместо инхибиране на ензими, метаболизиращи мастни киселини, които засягат различни метаболити, може да бъде нова идеална терапия за ХБН.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА
