ЧАСТ Ⅰ: Роля на SIK1 в прехода на острото бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване
Mar 25, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 и др.
Заден план
Остра бъбречна травма(AKI), често срещано заболяване, характеризиращо се с намаляване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR) и повишаване на серумния креатинин [1], се счита за рисков фактор за развитието и прогресията на ХБН [2,3]. Наскоро AKI-CKD (Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване) преходът се превърна в една от горещите точки в изследването на бъбречните заболявания. Въпреки че се съобщава, че възпалението, ЕМТ и фиброзата играят жизненоважна роля в развитието на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход [4,5], точният молекулен механизъм на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преходът все още е неясен.
цистанче за лечение на бъбречни заболявания и предотвратяване на бъбречна недостатъчност
Индуцируема от сол киназа 1(SIK1) е член на семейството на AMP-активирани протеин кинази (AMPKs), които играят основна роля в регулирането на метаболизма, клетъчното оцеляване и растеж [6, 7]. Проучванията показват, че инхибирането на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)насърчава ЕМТ, което води до миграция и метастази на тумори[8-10]. Освен това се съобщава, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулира отрицателно TLR{0}}индуцираното активиране на NF-kB и атенюираните експресии на провъзпалителни цитокини [11]. В допълнение, появяващите се доказателства показват връзка между SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)и бъбречни заболявания [6,12]. Например, регулиране нагоре на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)обърна индуцираната от висока глюкоза пролиферация на мезангиални клетки и натрупването на екстрацелуларен матрикс (ECM) чрез инхибиране на експресията на FN и PAI-1, и двете от които участват във фиброзни разстройства, като гломерулосклероза [6,13]. По този начин спекулираме, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)може да участва в прогресията на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход, който се характеризира с ЕМТ, възпаление и бъбречна фиброза.
Пътят на WNT/-катенин е сложен, силно запазен сигнален път, който регулира различни биологични процеси, като развитие на органи, тъканна хомеостаза и канцерогенеза [14, 15]. Въпреки че е тих в нормалния бъбрек на възрастен, установено е, че се активира отново при различни бъбречни заболявания, включително остро бъбречно увреждане, диабетна нефропатия, интерстициална фиброза и кистозни бъбречни заболявания [16]. Освен това се съобщава, че заглушаването на пътя на WNT/-катенин подобрява бъбречната фиброза, като забавя прогресията на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)при I/R-индуцирано увреждане [17]. Но дали SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)може да участва в AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход чрез модулиране на WNT/-катенин пътя остава да бъде допълнително изяснен.
Появяващи се доказателства показват, че Snail и Twistl, EMT транскрипционните фактори, играят важна роля в патогенезата на бъбречната фиброза [18-20]. Съобщава се, че условната делеция на Twistl или Snail в проксималните тубулни епителни клетки инхибира ЕМТ, намалявайки интерстициалната фиброза при експериментално индуцирана бъбречна фиброза при мишки [21]. Като се има предвид, че Snail и Twist1 са значими молекули, разположени надолу по веригата на WNT/-catenin пътя, ние спекулирахме, че те също могат да играят жизненоважна роля в SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)медиирано AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход.
По този начин, в това проучване, ние имахме за цел да изясним ролята и механизма на SIK1 (Индуцируема от сол киназа 1) в AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход, който ще осигури нова терапевтична цел за клинична профилактика и лечение на бъбречна фиброза и ще осигури нов начин за забавяне на развитието на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход.
цистанче за лечение на бъбречни заболявания
Материали и методи
Пациенти и тъканни проби
Проучването е одобрено от Комитета по етика на клиничните изследвания на болницата на провинция Шандонг, свързана с университета Шандонг. Бяха събрани проби от човешки бъбрек от пациенти с AKI (Остра бъбречна травма), диагностицирани въз основа на бъбречна биопсия, а пробите от бъбреците в контролните групи са получени от параканцерозна тъкан на пациенти с бъбречни тумори, които са претърпели хирургична резекция. Тъканните проби бяха запазени в течен азот и информираното съгласие беше подписано от всички пациенти в съответствие с Декларацията от Хелзинки.
Изграждане на AAV9-Sik1(Индуцируема от сол киназа 1)
Рекомбинантен адено-асоцииран вирус (AAV9-Sik1) и адено-асоцииран вирус-отрицателна контрола (AAV9-NC) бяха конструирани от GENECHEM (Шанхай, Китай). Рекомбинантен AAV9-Sik1 адено-асоцииран вирусен вектор GV467 включва промотор, кодираща област на антитяло, кодираща област на EGFP зелен флуоресцентен протеин и кодираща област на 3FLAG етикет протеин. Способността на вектора AAV9 да трансдуцира бъбреците е потвърдена (допълнителен файл 1).
Животни и методи за моделиране
Моделирането и последващите експериментални програми са одобрени от Комитета за грижа и използване на животните към университета Шандонг. C57BL/6 мишки на възраст 4-6 седмици и с тегло 15-20 g бяха доставени от Центъра за експериментални животни към университета Шандонг и бяха разпределени на случаен принцип в 4 групи: контролна група (контролна), нормални мишки, третирани с AA група ( AA), AA мишки, третирани с AAV9-Sik1 група (AAV9-Sik1 плюс AA), AA мишки, третирани с AAV9-NC група (AAV9-NC плюс AA) . Мишките в АА групата бяха инжектирани с АА (10 mg/kg) интраперитонеално, докато мишките в контролната група бяха инжектирани с PBS. На 3-ти, 7-ми, 14-ти и 28-ми след инжектирането на AA, 24-часовата урина на мишки се събира в метаболитна клетка и супернатантата се съхранява при -20 градуса C след центрофугиране. Кръвта се центрофугира при 3000r в продължение на 10 минути и супернатантата се съхранява при -20 градуса. 24 часа протеин в урината, серумен креатинин (Scr) и уреен азот в кръвта (BUN) се измерват с автоматичния биохимичен анализатор. Серумните IL-1 и TNF- бяха открити чрез ELSA. След това мишките бяха умъртвени и претеглени. След това бъбреците се изрязват и претеглят. Всички проби от бъбреците бяха разделени на две части, едната от които беше фиксирана в 4 процента параформалдехид за хистологично оцветяване, докато другата беше съхранена при -80 градуса за PCR в реално време и Western blot откриване.
Хистология и имунохистохимия
След фиксиране в 4 процента параформалдехид, пробите от бъбреците бяха дехидратирани, прозрачни, поставени в парафин и нарязани на резени с дебелина 4 μm. Впоследствие предметните стъкла бяха депарафинизирани, хидратирани и оцветени. За бъбречен хистологичен анализ се използват HE оцветяване, PAS оцветяване и трихромно оцветяване на Masson съгласно инструкциите на производителя. За имунохистохимичен анализ срезовете се инкубират с първично антитяло срещу SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)(51045-1-AP, Proteintech, САЩ), E-cadherin (20874-1-AP, Proteintech, САЩ), -SMA (ab32575, Abcam, САЩ), COL1(bs-10423R, Bioss , Пекин, Китай) при 4 градуса през нощта. След инкубиране с вторичното антитяло се добавя DAB, последвано от ядрено противооцветяване с хематоксилин. Накрая изображенията бяха наблюдавани под микроскоп (Leica, Германия). Процентът на положително оцветяване за SIK1(Индуцируема от сол киназа 1), E-cadherin, -SMA и COLl се измерва с помощта на софтуер за количествено изображение-Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Клетъчна култура и лечение
Човешки проксимални тубулни епителни клетки (HK2) се култивират в среда DMEM (Gibco, САЩ), допълнена с 10 процента фетален волски серум (FBS) (Gibco, САЩ) и 1 процент пеницилин-стрептомицин (Sigma, САЩ) при 37 градуса С в овлажнена атмосфера, съдържаща 5 процента CO,. Аристолохинова киселина (AA) (Sigma, САЩ) се разтваря в DMSO до 1 mg/mL и клетките се третират с крайна концентрация при 10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L и 60 μmol/L, и контролната група е третирана със същото количество DMSO.
Лентивирусна векторна трансдукция и трансфекция на siRNA Лентивирусните shRNA конструкции целят SIK1(Индуцируема от сол киназа 1), -катенин и разбъркана shRNA, както и лентивирусен вектор за свръхекспресия за SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)и празен контролен вектор са конструирани от Cyagen (Гуанджоу, Китай). Целевите последователности са изброени както следва: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
ползи от desert cistanche: лечение на хронични бъбречни заболявания
Резултати
SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)беше регулиран надолу в AKI(Остра бъбречна травма)
Като се има предвид, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)играе значителна роля при увреждане на бъбреците, първо открихме експресията на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)в бъбречните тъкани на AKI(Остра бъбречна травма)пациенти и AKI(Остра бъбречна травма)мишки. Имунохистохимичното оцветяване разкрива, че не само при пациенти, но и при мишки, SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)експресията на бъбречните тубули при контрола е по-висока от тази при AKI(Остра бъбречна травма)група, което показва, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)беше регулиран надолу по време на AKI(Остра бъбречна травма)(Фиг.la,b). Освен това проведохме трихромно оцветяване с HE и Masson, за да анализираме хистопатологичните промени в бъбречни проби от AKI(Остра бъбречна травма)пациенти (фиг. 1в). В сравнение с контролата, подуване на бъбречните тубулни епителни клетки, вакуолна дегенерация и интерстициален оток се наблюдават в групата с AKI чрез HE оцветяване. Освен това, в сравнение с контролата, в групата с AKI чрез трихромно оцветяване на Masson се наблюдават по-специално сплескани тръбести клетки, отделена граница на четката и уголемени тръбни ленти. Взети заедно, всички тези открития показват, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)може да играе роля в тубулното нараняване.
Фигура 1 SIK1 беше регулиран надолу при AKI(Остра бъбречна травма).a Представителни имунохистохимични изображения на оцветяване на SIK1 в контрола и AKI(Остра бъбречна травма)пациенти. Мащаб =50 μm. Графиката показва количествения анализ на SIK1 в имунохистохимично оцветени срезове.b Представителни изображения на имунохистохимично оцветяване на SIK1 в контрола и AKI(Остра бъбречна травма)мишки. Мащаб =50 μm. Графиката показва количествения анализ на SIK1 в имунохистохимично оцветени срезове. c Представителни изображения на HE и трихромно оцветяване на Masson в бъбречни тъкани на AKI(Остра бъбречна травма)пациенти. Мащаб =10 μm. Данните са показани като средно±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)се регулира надолу при AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преходни мишки
За получаване на миши модел на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход, ние инжектирахме AA интраперитонеално в мишки. В сравнение с контролата, мишките, третирани с AA, показват повишено производство на възпалителни фактори, EMT и бъбречна фиброза (Фиг. 2a-d). В допълнение, бъбречният индекс, серумният Scr, BUN и 24-часовият протеин в урината се повишават при лечение с AA (фиг. 2e). Освен това, АА увреди бъбречната структура, което доведе до атрофия на бъбречните тубулни епителни клетки, разширяване на лимена и различна степен на отлагане на колагенови влакна в тубулоинтерстициума (фиг. 2f). Всичко по-горе показва, че индуцираната от AA AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преходният модел беше успешно установен. Да изследваме ролята на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)при AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване) преход, ние оценихме неговата експресия в пробите от бъбреци на мишки, инжектирани с AA. Намерихме SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)и p-SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)(Thr182) бяха намалени в зависимост от времето след инжектиране на AA (фиг. 2g), което показва потенциална роля за SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)при регулиране на AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход.
Фигура 2 SIK1 беше регулиран надолу при AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преходни мишки.ELISA анализ на IL-1 и експресия на TNF в различни групи мишки. b Уестърн блот и PCR анализ в реално време на експресия на маркери за възпаление и фиброза (Caspase1/p20/p10, FN и COL1); c Western blot и PCR анализ в реално време на експресия на EMT маркери (E-cadherin, Vimentin и -SMA). d Представителни изображения на имунохистохимично оцветяване на Е-кадхерин в различни групи мишки. Мащабна лента=50 μm. Графиката показва количествения анализ на Е-кадхерин в имунохистохимично оцветени срезове. e Бъбречният индекс, Scr, BUN и 24-часовите нива на протеин в урината в различни групи мишки. f Представително хистологично оцветяване (HE, PAS и трихромно оцветяване на Masson) изображения на бъбречни тъкани в различни групи мишки. Мащаб =50 μm. g Western blot анализ на SIK1 и p-SIK (Thr182) протеинови нива в C57BL/6 мишки. Данните са показани като средно±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Свръхекспресия на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)облекчени AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход
За уточняване на функцията на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)при AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход, ние инжектирахме AAV9-SikI в опашната вена на мишки за свръхекспресия на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1). Установихме, че след инжектиране с AAV9-Sik1, AA-индуцираната бъбречна дисфункция е значително подобрена, както се вижда от намалените нива на бъбречния индекс, Scr, BUN и 24-часов протеин в урината (фиг.3a). PCR в реално време разкри, че AAV9-Sik1(Индуцируема от сол киназа 1)облекчен AA-индуциран възпалителен отговор (фиг. 3b). В допълнение, AAV9-Sik1(Индуцируема от сол киназа 1)значително подобрява хистопатологичното увреждане, предизвикано от АА (фиг. 3с). Освен това, резултатите от имунохистохимичното оцветяване предполагат, че AAV9-Sik1(Индуцируема от сол киназа 1)облекчена интерстициална фиброза и ЕМТ в процеса на индуцирана от АА AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход (фиг.3d). Като цяло, тези резултати показват, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)играе защитна роля при индуцирана от АА AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход.
Cistanche ползи за здравето: подобряване на бъбречната функция
SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)беше регулиран надолу в третирани с AA HK2 клетки. Голям брой проучвания показват, че проксималните тубули на бъбрека са една от основните мишени на увреждане при AKI(Остра бъбречна травма)и увреждането на проксималния тубул може да играе важна патофизиологична роля в развитието на AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход. За допълнителна оценка дали SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)беше регулиран надолу in vitro, ние се фокусирахме върху HK2 клетки в това проучване. Чрез извършване на CCK8 анализи, ние избираме 10 μmol/L AA като оптимална концентрация за последващи експерименти (Допълнителен файл 2). Последователно, лечението с AA показва повишено възпаление, EMT и фиброза в HK2 клетки (фиг. 4a-c), което предполага ин витро индуцирано от AA увреждане на HK2 клетки. Впоследствие изследвахме протеиновите нива на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)и наблюдава значително намален SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)и p-SIK1(Thr182) в HK2 клетки в присъствието на AA (фиг. 4d). Освен това открихме местоположението на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)протеин в HK2 клетки преди и след излагане на AA чрез имунофлуоресцентно оцветяване. В нестимулираните клетки SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)се наблюдава както в ядрото, така и в цитоплазмата. Когато се третира с АА, експресията на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)беше намален и SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)постепенно се открива в ядрото (Допълнителен файл 3). Взети заедно, тези резултати изясняват, че SIK1 е участвал в AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки.
Фиг. 3 Свръхекспресията на SIK1 облекчава AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход.а. Бъбречният индекс, Scr, BUN и 24-часовите нива на протеин в урината в различни групи мишки. b PCR анализ в реално време на нивата на Caspase 1 и IL-1 mRNA в различни групи мишки. c HE, PAS и трихромното оцветяване на Masson бяха използвани за оценка на хистологичните промени и степента на тубулоинтерстициална фиброза. Мащабна лента=50 µm. d Представителни имунохистохимични изображения на оцветяване на E-cadherin, -SMA и COLI протеин в различни групи мишки. Мащабна лента=50 µm. Графиките показват количествения анализ на Е-кадхерин, -SMA и COL1 в имунохистохимично оцветени срезове. Данните са показани като средно ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
екстракт от цистанче: подобрява бъбречната функция
Свръхекспресия на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)подобрено AA-индуцирано HK2 клетъчно увреждане
За по-нататъшно изясняване на ролята на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)при AA-индуцирано HK2 клетъчно увреждане, ние конструирахме клетъчни линии, които стабилно повишават SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)чрез лентивирусна инфекция на HK2 клетки (допълнителен файл 4). Свръхекспресията на SIK1 доведе до значително повишен Е-кадхерин и потискане на Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI и Fspl в сравнение с контролните клетки, стимулирани само с AA (фиг. 4e, f). Освен това, свръхекспресия на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)инхибира способността за миграция на HK2 клетки, индуцирана от AA (Фигура 4g). Заедно тези открития показват, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)е защитен срещу AA-индуцирано увреждане в HK2 клетки.
Фигура 4 SIK1 се регулира надолу в третирани с АА HK2 клетки и свръхекспресията на SIK1 подобрява индуцираното от АА увреждане на HK2 клетките.а. ELISA откриване на нива на IL{{0}} и TNF- в супернатанта на HK2 клетки, третирани с 10 μmol/L AA за 0 h, 24 h, 48 h и 72 ч. b Уестърн блот анализ на каспаза 1/p20/p10, Е-кадхерин, ZO-1, виментин и -SMA протеинови нива в HK2 клетки, третирани с 10 μmol/L AA за 0 часа, 24 часа, 48 часа, и 72 часа, с най-голям ефект след 72 часа лечение. -актинът се използва като контрола. c PCR анализ в реално време на индикатори за ранна фиброза (COLI, PAI-1 и MMP9) нива на mRNA в HK2 клетки, третирани с 10 μmol/L AA за 72 часа. d Уестърн блот анализ на нивата на p-SIK1(Thr182) и SIK1 в HK2 клетки, третирани с 10 μmol/L AA за 0 h, 24 h, 48 h и 72 h. e Western blot анализ на Caspase1/p20/p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1 и COL1 в HK2 клетки, които са третирани с SIK1 вектор (SIK1 лентивирусен свръхекспресиращ вектор) в присъствието на 10 µmol/L AA или третирани с 10 µmol /L AA самостоятелно за 72 часа. f Представителни имунофлуоресцентни изображения на Е-кадхерин и виментин в HK2 клетки. Мащаб =50 μm. g Представителни резултати от миграция на HK2 клетки. Мащаб =50 μm. Данните са показани като средно±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
екстракт от Cistanche deserticola: лечение на бъбречни заболявания
SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулиран WNT/-катенин сигнален път in vivo и in vitro
Като се има предвид критичната роля на пътя на WNT/-катенин при AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)преход, проучихме дали SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулира WNT/-катениновия път. In vivo експерименти, ние наблюдавахме тази свръхекспресия на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)инхибира протеиновите нива на WNT1, p- -catenin (Y654) и ядрения -catenin при AA-индуцирана AKI-CKD(Остро бъбречно увреждане в хронично бъбречно заболяване)мишки (фиг.5а). За да проучим допълнително дали SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулира пътя на WNT/-catenin in vitro, ние заглушихме експресията на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)чрез shRNA в HK2 клетки (Допълнителен файл 5). В съответствие с in vivo резултатите, заглушаването на SIK1 доведе до значително повишени нива на -катенин, TCF4 и LEF1 иРНК нива (Фигура 5b). Освен това нокдаунът на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)повишава протеиновите нива на -катенин и p- -катенин (Y654) (фиг. 5в). В допълнение, нокдаунът на SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)насърчава ядрената транслокация на -катенин (фиг. 5d). Взети заедно, тези данни предполагат, че SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулира WNT/-катениновия път in vivo и in vitro.
Фигура 5 SIK1 регулира пътя на WNT/-катенин in vivo и in vitro.а. Western blot анализ на нивата на SIK1, WNT1, p- -катенин (Y654) и ядрен -катенин протеин в различни групи мишки. b PCR анализ в реално време на -катенин, TCF4 и LEF1 в HK2 клетки, третирани с SIK1 shRNA или Scramble shRNA. c Western blot анализ -катенин и p- -катенин (Y654) в HK2 клетки, третирани със SIK1 shRNA или Scramble shRNA.d Представителни имунофлуоресцентни изображения на -катенин в HK2 клетки. Мащабна лента=50 um. Данните са показани като средна стойност±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
WNT/-катенин сигнален път е включен в AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки
За да проучим дали пътят на WNT/-катенин играе роля в индуцираното от АА увреждане на HK2 клетките, тествахме нивата на експресия на WNT1, ядрения -катенин и p- -катенин (Y654) след лечение с АА. Резултатите от Western blot показаха, че WNT1, ядрен -катенин и p- -catenin (Y654) се увеличават значително след AA стимулация (Допълнителен файл 6a). Освен това, имунофлуоресцентното оцветяване разкри ядрената транслокация на -катенин (допълнителен файл 6b), което предполага, че AA стимулацията може да активира WNT/-катенин сигналния път. Като се има предвид -катенинът е централният компонент на пътя на WNT/-катенин, ние се чудим дали регулирането на -катенин регулира AA-индуцираното увреждане на HK2 клетките. По този начин, ние стабилно съборихме -catenin от shRNA лентивирус в HK2 клетки (допълнителен файл 6c). И наблюдавахме, че нокдаунът на -катенин уврежда индуцираната от AA експресия на Caspasel, IL-1, Vimentin, PAI-1 и MMP9 и насърчава експресията на E-кадхерин (фиг.6a, b). Освен това, -catenin shRNA клетки, стимулирани с AA, показват значително намалена миграция в сравнение с -catenin контролни клетки, стимулирани само с AA (фиг. 6c). Взети заедно, тези открития предполагат, че пътят на WNT/-катенин е включен в AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки.
Фигура 6 WNT/B-катенин сигнализиращ път е включен в AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки.HK2 клетките бяха третирани с В-катенин shRNA или Scramble shRNA в присъствието на 10 umol/LAA. PCR анализ в реално време на Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1.и Нива на MMP9 mRNA в HK2 клетки. b Представителни имунофлуоресцентни изображения на E-cadherin и Vimentin в HK2 клетки. Мащабна лента=50 um.c Представителни резултати от миграцията на HK2 клетки. Мащабна лента=50 um. Данните са показани като средно±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
За SIK1 е необходим сигнален път на WNT/-катенин(Индуцируема от сол киназа 1)медиирано HK2 клетъчно увреждане, индуцирано от АА
За да се проучи дали SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)регулирано AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки чрез WNT/-катенин сигнален път, -катенинът е допълнително намален в SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)нокдаун HK2 клетки. В сравнение с нокдаун клетки SIK1, по-нататъшното нокдаун на -catenin намалява нивата на mRNA на Caspasel, COLl и Vimentin, като същевременно повишава нивата на mRNA на E-cadherin (фиг. 7а). Резултатите от West-ern blot са в съответствие с PCR в реално време, показвайки, че заглушаването на -catenin и SIK1 обръща понижаващата регулация на E-cadherin, повишената регулация на Caspasel/p20/p10 и Vimentin, индуцирани от SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)нокдаун (фиг. 7b).
Взети заедно, тези резултати показват, че инхибирането на -катенин обръща възпалителния отговор, EMT и прогресията на фиброзата, медиирана от SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)нокдаун, което силно разкрива, че пътят на WNT/-катенин е необходим за SIK1(Индуцируема от сол киназа 1)медиирано HK2 клетъчно увреждане, индуцирано от АА.
Фигура 7 WNT/-катенинов път е необходим за SIK1 медиирано HK2 клетъчно увреждане, индуцирано от AA.HK-2 клетки бяха ко-трансфектирани със SIK1 и B-catenin shRNA или трансфектирани само с SIK1 или -catenin shRNA и след това третирани с 10 umol/L AA за 72 ha PCR анализ в реално време на Caspase1, COL1. Е-кадхерин и експресия на виментин. b. Western blot анализ на експресия на Caspase1/p20/p10, E-cadherin и Vimentin. Данните са показани като средно±sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Ролята на Twist1 при AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки
Действайки като EMT-TF, Twistl може да насърчи EMT и бъбречна фиброза. В това проучване открихме, че АА стимулира експресията на протеин и иРНК на Snail и Twist1, докато нокдаун -catenin инхибира експресията на Snail и Twist1, индуцирана от AA (фиг. 8a), което показва, че Snail и Twist1 са разположени надолу по веригата на -catenin и играят роля в индуцирано от AA увреждане на HK2 клетки. За да проверим нашата хипотеза, ние съборихме Twist1 от siRNA (допълнителен файл 7) и извършихме PCR в реално време и Western blot анализ. Както се очакваше, в сравнение с контролните клетки, стимулирани само с AA, експресията на Vimentin и COLI беше намалена, докато ZO-1 беше увеличена в Twist1 siRNA клетки в присъствието на AA, което предполага, че мълчанието на Twist1 облекчава появата на EMT и прогресията на бъбречната фиброза, индуцирана от АА (фиг. 8b и c).
Фигура 8. Ролята на Twist при AA-индуцирано увреждане на HK2 клетки.Western blot и PCR анализ в реално време на Snail и Twist1 нива в HK2 клетки. b PCR анализ в реално време на нивата на Twist1, COL1, ZO-1 и виментин в HK2 клетки, третирани с Twist1 siRNA или NC siRNA.c. Western blot анализ на нивата на Twist1, ZO-1 и виментин в HK2 клетки, третирани с Twist1 siRNA или NC siRNA. Данните са показани като средно±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
