Насочвано от дерепликация изолиране на нови фенилпропаноид-заместени дигликозиди от Cistanche Salsa и тяхната инхибиторна активност върху производството на NO в макрофаги

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза още

Резюме:

Дерепликацията позволява бързо идентифициране на известни и неизвестни съединения в растителни екстракти. В това проучване извършихме дерепликация на базата на течна хроматография-масспектроскопия (LC-MS), използвайки данни от ESI плюс QTOF-MS за анализ нафенилпропаноид-заместени гликозиди, основните активни съставки на Cistanche salsa (CA Mey.) Beck. Използвайки само TOF-MS, подструктурите на тези съединения могат да бъдат недвусмислено потвърдени въз основа на характерните модели на фрагментация на различни продукции. Базираното на HPLC-MS профилиране на C. salsa също позволи откриването на новифенилпропаноид-заместенгликозиди оттова растение. От тях пет нови фенилпропаноид-заместенидигликозиди, наречени цистансалсиди A–E (5, 6, 12, 17 и 18), са изолирани. Техните структури бяха изяснени чрез спектроскопски методи, включително NMR и MS анализ. Всички изолати бяха тествани за тяхната инхибиторна активност срещу производството на NO в RAW 264.7 клетки, стимулирани от LPS. От тестваните съединения, съединения 5, 11, 13 и 18 показват умерена инхибиторна активност върху индуцируема NO синтаза. Съединения 11, 13 и 18 също инхибират фосфорилирането на NF-кВ в макрофагите. Нито едно от съединенията не показва значимостцитотоксичност. 

Ключови думи:дерепликация; фенилпропаноид-заместени дигликозиди; цистанче салса; противовъзпалително

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck, принадлежащо към семейство Orobanchaceae, е паразитно растение, което получава храната си от корена на Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) и други пустинни растения [1]. Това растение се използва в традиционната медицина за лечение на неврастения, сексуална дисфункция и бъбречна недостатъчност [2,3]. В предишни фитохимични проучвания се съобщава, че цялото растение C. salsa съдържа различни видове съединения, включително фенилетаноидни гликозиди и иридоидни гликозиди [4–7]. Фенилетаноидните гликозиди, като актеозид и ехинакозид, са основните активни съставки на растението [8]. Екстрактите от C. salsa показват полезни свойства, включително имуномодулиращи, противоракови и противовъзпалителни действия [9,10]. Дерепликацията е процес, чрез който пробните смеси ще бъдат тествани за разграничаване на непознати съставки от познати съединения. Стратегиите за дерепликация се основават на аналитичните техники и търсенето в база данни за идентифициране на вторични метаболити в началото на фитохимичния изследователски процес [11]. От аналитичните техники, ESI-QTOF-MS (електроспрей йонизация-квадруполно време на полет-масова спектроскопия) може да предостави ценна информация за химичните структури на вторичните метаболити. Доказано е, че фракционирането, насочено към дерепликация, базирано на LC-MS, позволява екстракция и пречистване на целевите метаболити от сурови екстракти от растения с висока ефективност [12–15]. Това проучване извърши дерепликация на базата на LC-MS, използвайки данни от ESI плюс TOF-MS за анализ на фенилпропаноид-заместени дигликозиди, основните активни съставки на C. salsa. Данните от TOF-MS могат да предложат подструктурите на тези съединения въз основа на характерни модели на фрагментация на различни продуктови йони. Въз основа на тази дерепликация бяха анализирани LC-MS профили на фракция на етил ацетат (EtOAc) и водоразтворима фракция. EtOAc фракцията беше подложена на стратегията за дерепликация за по-нататъшно разделяне, което доведе до изолирането на пет нови фенилпропаноид-заместени дигликозиди и 13 известни съединения (Фигура 1). Беше потвърдено, че условно прогнозираните структури на фенилпропаноид-заместени дигликозиди са правилно съпоставени с техните реални структури. Освен това бяха изследвани противовъзпалителните действия на изолатите.

Резултати и дискусия

Фенилпропаноид-заместените дигликозиди, изолирани от C. salsa, обикновено имат структури, базирани на дизахаридни гликозиди, които се състоят от глюкоза и рамноза с Rha (1→3) Glc връзка и един цинамоилов заместител, като кумарова киселина (Cou), кафеена киселина киселина (Caf) и ферулоилова киселина (Fer), на C-4 или C-6 позиция на глюкозата. Агликонът обикновено се прикрепя към C-1 позицията на глюкозата. Често се съобщава за структурите на фенилпропаноид-заместени дигликозиди с ацетилова група при C-2 на глюкозата [6,12,16]. За да се извърши дерепликацията, моделите на MS фрагментация на тези съединения бяха анализирани чрез положителен режим ESI-QTOF-MS. В MS спектрите, всички фенилпропаноид-заместени дигликозиди произвеждат аддуктивни йонни пикове при [M плюс NH4] плюс, [M плюс K] плюс и [M плюс Na] плюс, което осигурява молекулното тегло и формулата. Моделът на фрагментните йони може да бъде открит чрез последователни загуби на агликонови и гликозидни остатъци ([M плюс H − агликон] плюс, [M плюс H − агликон − Rha] плюс и [M плюс H − агликон – Фигура 1. Структури на съединенията 1–18 2. Резултати и дискусия Фенилпропаноид-заместените дигликозиди, изолирани от C. salsa, обикновено имат структури, базирани на дизахаридни гликозиди, които се състоят от глюкоза и рамноза с Rha (1→3) Glc връзка и един цинамоилов заместител, като кумарова киселина (Cou), кафеена киселина (Caf) и ферулоилова киселина (Fer), на позицията C-4 или C-6 на глюкозата. Агликонът обикновено се прикрепя към C{{24 }} позиция на глюкозата. Често се съобщава за структурите на фенилпропаноид-заместени дигликозиди с ацетилова група при C-2 на глюкозата [6,12,16]. За да се извърши дерепликация, MS фрагментационни модели на тези съединения бяха анализирани чрез положителен режим ESI-QTOF-MS. В MS спектрите, всички фенилпропаноид-заместени диглико страни произвеждат аддуктивни йонни пикове при [M плюс NH4] плюс, [M плюс K] плюс и [M плюс Na] плюс, което осигурява молекулното тегло и формулата. Моделът на фрагментните йони може да бъде открит чрез последователни загуби на агликонови и гликозидни остатъци ([M плюс H − Aglycone] плюс, [M плюс H − Aglycone − Rha] плюс и [M плюс H − Aglycone – Rha − Glc (или ацетил) -Glc)] плюс ), които са полезни за предсказване на вида на цинамоиловия заместител и захарите. Фрагментните йони при m/z 163 на кафеоиловата група, m/z 147 на кумароиловата група или m/z 177 на ферулоиловата група дават характерния сигнал на цинамоилов заместител в фенилпропаноид-заместените дигликозиди [4,15] ( Фигура 2). Анализът на фрагментните йони би предоставил полезна информация за идентифициране на структурите на фенилпропаноид-заместени дигликозиди. Въпреки това, техните изомери не могат да бъдат диференцирани само чрез MS спектрометрия. За точна идентификация на техните пълни структури са необходими NMR спектри.

Всички изолати бяха тествани за техните инхибиторни ефекти върху LPS-индуцираното производство на NO в RAW 264.7 клетки. Дексаметазонът беше използван като положителна контрола и неговият IC50 беше 7.0 µM. От тестваните съединения, съединения 5 (IC50 42.7 ± 6.6 µM), 11 (IC50 37.3 ± 2.2 µM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} ± 4.0 µM) и 18 (IC50 27.9 ± 0,8 µM) показват умерени инхибиторни активности върху индуцируемата NO синтаза, докато другите съединения са неактивни в този анализ (IC50 стойности > 100 µM). За да се провери дали тези съединения имат цитотоксичност, клетъчната жизнеспособност се измерва с помощта на МТТ анализ. В резултат нито един от тях не показва значителна цитотоксичност (допълнителна фигура S6-1). Тези четири съединения бяха избрани, за да се оцени тяхната инхибиторна активност срещу NF-кВ пътя в LPS-стимулирани RAW 264.7 клетки. Стимулирането на RAW 264.7 клетки с LPS индуцира фосфорилирането на IkB и NF-kB (p65) след 0.5 h инкубация. Фосфорилирането на NF-кВ (р65) е значително намалено чрез предварителна обработка със съединения 11, 13 и 18, както е показано чрез Western blot анализ (Фигура 5). Следователно, съединения 11, 13 и 18 могат да проявят противовъзпалителни ефекти чрез инхибиране на NF-кВ в макрофагите.

Материали и методи

Оптичните въртения бяха измерени с дигитален поляриметър Jasco P-2000 (Jasco, Токио, Япония). UV спектрите бяха записани на спектрометър Chirascan плюс Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR спектрите бяха записани с помощта на Jasco FT/IR-4200 спектрофотометър. Електроспрей йонизираща квадруполна времепролетна масспектрометрия (HR-ESI-qTOF-MS) с висока разделителна способност беше извършена на Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, оборудван със серия Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Пало Алто, Калифорния, САЩ), а използваната колона беше колона Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id150 × 4,6 mm, 5 um). За събиране на данни е използван софтуерът MassHunter Workstation.

1D (H и 13C) и 2D('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) ЯМР спектрите са получени с Jeol LA 300 (Jeol, Токио, Япония), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 и Bruker AVANCE 800 HD спектрометри, съчетани с криосонда (Bruker, Ettlingen, Германия). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) се използва като NMR разтворител и референтни пикове (6H 2.50 и δc 39.5). Колонна хроматография （CC） се извършва с помощта на Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Швеция) или Kieselgel 60 силикагел (40-63 um,230-400 mesh, Art 9385; Merck, Дармщат, Германия). Тънкослойна хроматография (TLC) се провежда върху предварително покрити плочи Kieselgel 60 със силикагел F254 (Art.5715; Merck). Петна върху TLC се откриват с помощта на UVлампа при 254 nm и 365 nm (VL-4.LC, 365 /254; Vilber Lourmat, Torcy, Франция). Течна хроматография със средно налягане (MPLC) се извършва на флаш колона RediSep 120 g със силициев диоксид (lsco, Lincoln, NE, USA) и силикагел Kiesegel 60 (40-63 um, 230-400 мрежа, Art.9385; Merck ) с помощта на придружител Combiflash (Isco). Системата за течна хроматография под високо налягане (HPLC) беше Gilson HPLC, оборудвана с помпа Gilson 321 и UV.VIS 151 детектор (Gilson, Middleton, WI, USA), използвайки полупрепаративни ODS колони (Luna 5 um C18 （2） 100). Å, id 250 × 10 mm, 5 μm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, САЩ; Hypersil GOLDrM aQ 175A, id250 × 10 mm, 5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf, Германия; Inno C18 колона 120 A, id 250 × 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Корея). Аналитичният RP- HPLC системата беше система Waters 2695 Alliance с детектор 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), а използваната колона беше колона HypersilTM BDS C18 (130 A, id150×4.6 mm, 5 μm, Thermo НаученTM). Мравчената киселина е закупена от Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Сеул, Корея). Разтворителите с клас HPLC бяха закупени от Fisher Scientific Korea Ltd. (Сеул, Корея). HSOA, Na, CO и първокласни разтворители за екстракция, фракциониране и изолиране бяха закупени от Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Сеул, Корея). L- и D-цистеин метилов естер хидрохлорид и о-толилизотиокванат са закупени от Tokyo Chemical Industry (Токио, Япония).

Изводи

В това изследване ние изолирахме и изяснихме структурите на пет нови фенилпропаноид-заместени дигликозиди, наречени цистансалсид AE (5,6, 12, 17 и 18), в допълнение към изолирането и идентифицирането на 13 известни съединения, използвайки стратегия за дерепликация. Установено е, че известните съединения са липедозид AI(1)[21], 2'-ацетилактеозид (2)[22], изоцистанозид С(3)[15], османтузид В (4)[21], епимеридинозид А(7) [15], цистанозид D(8)[23], салсазид B(9) [6l, тубулозид Е (10)[16]цистанозид M(11)[15], изомартинозид(13) [24], салсазид C(14) )[6], джионозид C(15)[25] и салсасид F (16)[6]. Техните структури са установени чрез анализ на обширни спектроскопски данни и чрез сравнение с докладваните данни в литературата. Беше потвърдено, че условно прогнозираните структури на фенилпропаноид-заместени дигликозиди са правилно съпоставени с техните реални структури.

При NO инхибиторен анализ, съединения 5 （IC50 42.7±6.6 μM）, 11（IC50 37.3±2.2 μM）,13 （IC50 40.0 ±4.0 μM） и 18（ICs0 27.9±0.8uM показват умерени инхибиторни активности. От тези съединения е установено, че съединения 11, 13 и 18 инхибират фосфорилирането на NF-kB в макрофагите и по този начин могат да проявяват противовъзпалителна активност, която ще трябва да бъде доказана в по-нататъшни експерименти.

Извличане от: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ("Лицензът"). Независимо от Правилата и условията на ProQuest, можете да използвате това съдържание в съответствие с условията на Лиценза.