Определяне на ехинакозид във воден екстракт от Cistanche Herba чрез HPLC

Резюме:

Цел Установен е HPLC метод заопределяне на ехинакозидвводен екстракт от цистанчебилка.

Методи Ехинакозидът се определя чрез HPLC. Разделянето се извършва на колона Inertsil ODS-SP C18 с подвижна фаза, състояща се от ацетонитрил (А) и 0.4% разтвор на фосфорна киселина (В), чрез градиентно елуиране. Дължината на вълната на откриване беше настроена на 333 nm, а температурата на колоната беше 30 градуса. Скоростта на потока беше 1,0 mL·min-1 и инжекционният обем беше 10 μL. Резултати Линейната зависимост на ехинакозида в диапазона на концентрация от 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 е добра (r=0.999 8). Възстановяванията бяха 94,59%-105.31% (RSD= 2.93%,n=9). Съдържанието на ехинакозид във водните екстракти от Cistanche herba е 15,527,7,347,12,267 mg·g-1. Заключение Установеният HPLC метод с добра повторяемост е точен, прост и осъществим. Подходящ е за определяне на ехинакозид във воден екстракт от Cistanche herba.

Ключови думи:HPLC;воден екстракт от Cistanche herba; ехинакозид; определяне на съдържанието

Cistanche deserticola е тонизиращо традиционно китайско лекарство, често използвано в клиничната практика и е известно като „пустинен женшен“ [1]. Cistanche deserticola, записано в изданието на Китайската фармакопея от 2015 г., е изсушено месесто стъбло с люспести листа на Cistanche deserticola YC Ma или Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. То е топло, сладко и солено и се връща към меридианите на бъбреците и дебелото черво. Има ефект на подхранване на ян на бъбреците, попълване на есенция и кръв и овлажняване на червата и лаксативи [2]. „Materia Medica на Shen Nong“ казва, че може да „тонизира средата, да подхрани петте вътрешни органа, да засили ин и да подхрани есенцията“. Cistanche deserticola съдържа главно фенилетаноидни гликозиди, иридоиди и техните гликозиди, лигнани и техните гликозиди, полизахариди, естерни съединения и алкалоиди [3]. Фенилетанол гликозидите са основните активни съставки на Cistanche deserticola. Сред тях ехинакозид и вербаскозид са изброени в Cistanche deserticola в Китайската фармакопея.

Индикативни компоненти за идентификация и определяне на съдържанието. Фармакологичните изследвания [4] показват, че Cistanche deserticola има различни фармакологични ефекти като слабително, защита на черния дроб, против остеопороза, антиоксидант, против стареене и против умора. Водният екстракт от Cistanche deserticola може да насърчи експресията на костен морфогенетичен протеин 2 ген в остеобласти на плъхове, устойчива на тартарат кисела фосфатаза, остеокалцин в серума на овариектомирани мишки и Smad1, mad5 гени, трансформиращ растежен фактор- и др. в костния мозък. , има антиостеопорозни ефекти [5-6].

Ехинацеята може да насърчи пролиферацията на остеобластите и диференциацията на мезенхимни стволови клетки от костен мозък, култивирани in vitro в остеобласти [7-9]. През последните години има много изследователски доклади за определяне на съдържанието на ехинакозид и вербаскозид в етанолов екстракт от Cistanche deserticola и неговите съставни препарати [10-12], но има малко доклади за определяне на съдържанието на индексни компоненти в Cistanche deserticola воден екстракт. В това изследване е използвана високоефективна течна хроматография (HPLC) за определяне на съдържанието на ехинацеазид във водния екстракт от Cistanche deserticola.

1 материал

1.1 Инструменти

LC-20AT високоефективна течна хроматография, SPD-20A детектор, SIL-20A автосамплер, CTO-10ASvp колонна пещ, LC разтвор течна хроматография работна станция, Shimadzu Corporation of Япония; Електронна аналитична везна MES125P-OCE-DU, Sartorius Company, Германия; SHZ-D (Ⅲ) многофункционална вакуумна помпа с циркулираща вода, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 система за охлаждане на ротационен изпарител, ротационен изпарител RV 10 D S96, IKA Company, Германия; DK-S26

Електрическа водна баня с постоянна температура, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; UPR серия машина за свръхчиста вода, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Медицински материали и реактиви

Медицинският материал от Cistanche deserticola е закупен от Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., партиден номер: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, главният традиционен китайски фармацевт в Третата свързана болница на Университета по китайска медицина в Гуанджоу, го идентифицира като изсушено месесто стъбло с люспести листа на Cistanche deserticola YCMa. Пробата се съхранява в стаята за тестване на лекарства на третата свързана болница на Университета по китайска медицина в Гуанджоу; Референтна субстанция Echinacea Glycoside, съдържание 89,7%, Китайски институт за контрол на храните и лекарствата, партиден номер: 111670-

201706; ацетонитрилът е хроматографски чист (Merck, Германия); метанолът и фосфорната киселина са аналитично чисти (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); водата е свръхчиста вода.

2 Методи и резултати

2.1 Приготвяне на воден екстракт от Cistanche deserticola

Вземете едрия прах от лекарствения материал на Cistanche deserticola, добавете 10 пъти количеството дестилирана вода, нагрейте и кипете под обратен хладник за екстракция два пъти, 1 час всеки път, филтрирайте, комбинирайте филтрата и концентрирайте филтрата с ротационен изпарител до съдържание на сурово лекарство от 0,100 g·mL-1 и го съхранявайте при 4 градуса за по-късна употреба.

2.2 Хроматографски условия и пригодност на системата

Хроматографска колона: колона Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); подвижна фаза: ацетонитрил (A) -0.4% разтвор на фосфорна киселина (B), градиентно елуиране: 0 ~ 5 минути, 17%

А; 5 ~ 25 минути, 20% A; 25 ~ 30 минути, 17% А; дължина на вълната на детекция: 333 nm; температура на колоната: 30 градуса; скорост на потока: 1,0 mL·min-1;

Инжекционен обем: 10 μL. При тези хроматографски условия, разделянето между пиковете на ехинакозида и съседните компоненти е по-голямо от 1,5 и броят на теоретичните плочи, базирани на пика на ехинацеазид, трябва да бъде не по-малко от 4, 000. Хроматограмата е показана на фигура 1.

2.3 Приготвяне на разтвора

2.3.1 Разтвор на референтно вещество Претеглете подходящо количество ехинакозид еталонно вещество, претеглете го точно, поставете го в мерителна колба от 10 mL, добавете метанол, за да го разтворите, и пригответе разтвор на референтно вещество, съдържащ 898,794 ug ехинацеазид на ml, 4 градуса Запазете за по-късна употреба.

2.3.2 Тестово решение

Измерете точно 2.0 mL воден екстракт от Cistanche deserticola, изпарете до сухо на водна баня, добавете метанол, за да се разтвори, разредете до обем в 10 mL мерителна колба, разклатете добре и филтрирайте с 0,22 μm микропореста мембрана, за да се получи.

2.4 Изследване на линейна зависимост

Измерете точно {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 mL от референтния разтвор по точка 2.3.1, поставете го в мерителна колба от 5 mL, добавете метанол, за да допълните обема, и разклатете добре, за да получите градиентна концентрация от 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 референтен разтвор, филтриран през 0,22 μm микропореста мембрана. Измерете в съответствие с хроматографските условия в 2.2 и запишете пиковата площ. Извършете линейна регресия с масовата концентрация на референтното вещество като абсцисата (X, ug·mL-1) и площта на пика като ордината (Y) и се получава регресионното уравнение: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Резултатите показват, че ехинацеята има добра линейна зависимост в диапазона на концентрация от 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Тест за точност

Вземете 539.276 4 ug ·mL- 1 референтен разтвор, инжектирайте и измервайте 6 пъти непрекъснато в съответствие с хроматографските условия в 2.2 и запишете площта на пика. Резултатите показват, че RSD на площта на пика на ехинакозида е 1,81%, което показва добра прецизност на инструмента.

2.6 Тест за стабилност

Измерете точно 2.0 mL воден екстракт от Cistanche deserticola, изпарете до сухо на водна баня, добавете метанол за разтваряне, разредете в 10 mL мерителна колба, разклатете добре, филтрирайте с {{ 7}}.22 μm микропореста мембрана, следвайте хроматографските условия по точка 2.2 и поставете съответно на 0 и 2. , 4, 8, 12, 24 h измерване на инжектиране, запишете площта на пика. Резултатите показват, че RSD на пиковата площ на ехинакозида е 1,16%, което показва, че тестовият разтвор има добра стабилност в рамките на 24 часа.

2.7 Тест за повторяемост

Измерете точно 2.0 mL воден екстракт от Cistanche deserticola и пригответе 6 тестови разтвора паралелно съгласно метода в 2.3.2. Инжектирайте проби за измерване в съответствие с хроматографските условия в 2.2 и запишете площта на пика. Резултатите показаха, че RSD наехинакозидмасовата концентрация е 1.28%, което показва добра повторяемост на метода.

2.8 Тест за възстановяване на пробата

Измерете точно 9 порции от 1.0 mL воден екстракт от Cistanche deserticola, добавете 0.8, 1.0 и 1,2 mL референтен разтвор (1,552 mg·mL{{11) }}) съответно, изпарете до сухо във водна баня, добавете метанол за разтваряне и регулирайте до 10 mL мерителна колба; Разклатете добре и филтрирайте през 0,22 μm микропореста мембрана, за да приготвите тестови разтвори с висока, средна и ниска концентрация. Подгответе 3 копия от всяка концентрация паралелно. Измерва се според хроматографските условия в 2.2. Запишете площта на пика и изчислете възстановяването на пробата. Оценете. Резултатите са показани в таблица 1.

2.9 Определяне на съдържанието на пробата

Измерете точно 3 порции от 2.0 mL воден екстракт от Cistanche deserticola, изпарете до сухо във водна баня, добавете метанол за разтваряне, разредете в мерителна колба от 10 mL, разклатете добре, филтрирайте с 0,22 μm микропореста мембрана и се измерва в съответствие с хроматографските условия съгласно 2.2. Запишете площта на пика и изчислете съдържанието на ехинацеазид. Резултатите са показани в таблица 2.

Таблица 1 Резултати от тестове за възстановяване на ехинакозид

Таблица 2 Резултати от определяне съдържанието на ехинакозид във воден екстракт от Cistanche herba