Различна бъбречна хронотоксичност на бромобензен и неговите междинни метаболити при мишки

Известно е, че бромбензолът (BB) представлява сериозна заплаха за човешкото здраве. По-рано демонстрирахме, че BB показва хронотоксичност, тоест ежедневни колебания в тежестта на хепатотоксичността, предизвикана при мишки. Въпреки че BB показва лека нефротоксичност, не се наблюдава дневна флуктуация при тази токсичност. Това може да се отдаде на факта, че индуцираната от ВВ хронотоксичност се наблюдава само в черния дроб, а не вбъбреции че увреждането, причинено от BB, е видно в черния дроб, маскирайки ежедневните колебания в нефротоксичността. За да потвърдим тези две възможности, ние изследвахме дневните колебания в нефротоксичността, дължащи се на междинните метаболити на ВВ, които са насочени къмбъбреци: 3-бромофенол, бромохидрохинон и 4-бромокатехол. Мишките бяха инжектирани с 3-бромофенол, бромохидрохинон или 4-бромокатехол интраперитонеално в шест различни времеви точки на ден (време на Zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 или ZT22). Смъртността се наблюдава за 7 дни след инжектирането. Мишките са по-чувствителни към острата токсичност на тези метаболити около ZT14 (тъмна фаза), отколкото около ZT2 (светла фаза). Освен това, мишки, на които е приложена несмъртоносна доза 4-бромокатехол, показват значително повишаване на нивата на плазмения уреен азот ибъбречнамалондиалдехид при експозиция на ZT14. Освен това глутатион пероксидазата-4, индикатор за фероптоза, е отслабена при експозиция на ZT14. Тези резултати показват, че токсичността на метаболитите на ВВ е била по-висока по време на експозицията на тъмната фаза и демонстрират причината, поради която денонощната вариация на нефротоксичността от ВВ не е наблюдавана в предишния ни доклад е, чебъбречнащетае бил маскиран поради тежко чернодробно увреждане.

Щракнете върху Cistanche tubulosa Таблетки за бъбречно заболяване

Ключови думи бромобензен; денонощна вариация; циркаден ритъм; хронотоксичност;бъбрек

ВЪВЕДЕНИЕ

Бромбензолът (BB) е общ индустриален реагент, който обикновено се използва като суровина за синтеза на фармацевтични продукти, багрила и пестициди.1,2) BB е органичен замърсител, който уврежда естествената среда и представлява сериозна заплаха за човешкото здраве . Едно проучване твърди, че BB предизвиква тежка и лека хепатотоксичностбъбречнатоксичност при мишки.3) Въпреки че самият BB, неметаболитна форма, притежава ниска токсичност, неговите междинни метаболити имат токсични ефекти върху черния дроб ибъбреци. Чернодробните CYP450, като CYP1A2, CYP1B1 и CYP2E1, метаболизират BB до четири метаболита: 3-бромофенол (3-BrP), бромохидрохинон (BrHQ), 4-бромокатехол (4- BrC) и BB-3,4-оксид. BB-3,4-оксид проявява висока хепатотоксичност, а другите метаболити показват нефротоксичност, 4–6), което показва, че тези метаболити имат различни целеви органи.

В това проучване ние се насочихме към „хронотоксикологията“, тъй като по-рано сме предполагали връзката между времето на прилагане и тежестта на токсичността на химикалите.7–9) Предишното ни проучване демонстрира забележими ежедневни колебания в тежестта на токсичните реакции към BB при мишки, т.е. , мишките са били по-толерантни към индуцирано от BB чернодробно увреждане по време на експозицията на тъмната фаза (2:00), отколкото по време на експозицията на светлата фаза (14:00).8) Въпреки че BB показва лека нефротоксичност , хронотоксичност не се наблюдава прибъбреци. По този начин индуцираната от ВВ хронотоксичност е възможно да се наблюдава само в черния дроб, а не вбъбреци. В нашето предишно проучване, стрептомицин, антибиотик, за който е известно, че предизвиква определена нефротоксичност, показа ясни дневни вариации в индуцираната нефротоксичност при мишки.9) Въз основа на наличните данни, ние предположихме, че хронотоксичността, причинена от BB, е видна в черния дроб, а не в набъбреци, като по този начин маскира хронотоксичността в последния орган. Метаболитите на ВВ, генерирани чрез различни метаболитни пътища, се срещат в ниски концентрации и по този начин могат да допринесат за незначително увреждане на бъбреците; поради това индуцираната от BB метаболит нефротоксичност не може да бъде оценена клинично. В това проучване изследвахме дневните вариации в нефротоксичността на междинните метаболити на ВВ: 3-BrP, BrHQ и 4-BrC (фиг. 1).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Лечение на животни

Мъжки ICR мишки бяха закупени от Japan SLC Inc. (Shizuoka, Япония) и бяха държани при стандартни условия на контролирана температура (24 ± 1 градуса), влажност (55 ± 5 процента) и светлина (12: 12-h цикли светло/тъмно, свети в 08: 00), със свободен достъп до вода и храна. Експерименталните лечения бяха проведени с използване на 7-седмични животни. След приключване на експериментите, оцелелите мишки бяха умъртвени с помощта на пентобарбитал. Всички експерименти бяха одобрени от институционалната комисия за грижа за животни и експерименти на университета Kinjo Gakuin.

Експериментален протокол

За анализа на смъртността, {{0}}седмични мъжки ICR мишки получават единична интраперитонеална (ip) инжекция от 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg BrHQ или 220 mg/kg 4-BrC (при обем от 0,1 ml/10 g телесно тегло; Tokyo Kasei Corp, Токио, Япония). Тази доза се определя според стойността на LD50 в информационните листове за безопасност за всеки химикал. За инжектиране на всеки метаболит, мишките бяха разпределени в шест групи от по пет животни всяка. Метаболитите на BB са приложени в шест различни времеви точки (време на часовника: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02: {{21 }} и 06:00), описани като zeitgeber времена (ZTs): съответно ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 и ZT22. Контролните мишки получават същия обем физиологичен разтвор. Смъртността се наблюдава за 7 дни след инжектирането.

За анализиране на циркадните вариации вбъбречнанараняване, на 7-седмични мъжки ICR мишки (5–9 мишки) е приложена ip инжекция от 165 mg/kg 4-BrC при ZT2 или ZT14. Контролните мишки получиха същия обем физиологичен разтвор, както е описано по-горе. Животните бяха евтаназирани с помощта на пентобарбитал и техните плазмени проби бяха събрани 24 часа след инжектирането. Получените плазмени проби се съхраняват при -80 градуса. Theбъбрециот всички животни са събрани и съхранени при -80 градуса.

Нива на плазмен уреен азот (BUN), аспартат аминотрансфераза (AST) и бъбречен малондиалдехид (MDA)

Плазмените нива на BUN и AST бяха определени с помощта на BUN Wako Test и трансаминаза CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Осака, Япония), съгласно инструкциите на производителя.8) ОбщобъбречнаНивата на MDA бяха измерени чрез колориметричен анализ на микроплаки (Oxford Biomedical Research, MI, USA), съгласно инструкциите на производителя.8)

Уестърн блот анализ

Протеинови проби (50 µg), извлечени отбъбрецибяха разделени чрез електрофореза с 10% натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел.10) Използваните първични антитела бяха както следва (всички разредени 1: 1500): миши рецептор-взаимодействащ протеин (RIP) 1 моноклонално антитяло, мише RIP3 моноклонално антитяло и миши глутатион пероксидаза 4 (GPX4) моноклонално антитяло (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); заешко разцепено каспаза-3 поликлонално антитяло (технология за клетъчно сигнализиране); и миши -актин моноклонално антитяло (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Япония).

Статистически анализ

Бяха проведени множество сравнения с помощта на пост-хок теста на Tukey-Kramer. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуера SPSS 25.0 (Чикаго, Илинойс, САЩ). Резултати с p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

В това проучване сравнихме хронотоксичността на три междинни метаболита на ВВ (3-BrP, BrHQ и 4-BrC), за които е известно, че предизвикватбъбречнатоксичност. Първо изследвахме ефекта от времето на инжектиране върху смъртността, предизвикана от междинния метаболит на ВВ. Фигура 2 показва броя на оцелелите животни и средното време на преживяване (MST) 7 дни след инжектирането. Когато 3-BrP беше приложен при ZT10 и ZT14, всички мишки умряха (0 процента) в рамките на 4 часа (фиг. 2A). Обратно, когато 3-BrP се прилага при ZT6 и ZT22, три мишки (60 процента) оцеляват; когато се прилага при ZT2 и ZT18, броят на оцелелите мишки е съответно една и две (20 и 40 процента). След прилагане на BrHQ, смъртта на мишки се наблюдава само в рамките на 4 часа след прилагането във всички ZT групи. На 7-ия ден след приложението нито една мишка не оцелява в групите ZT14 и ZT18 и три (60 процента) оцеляват в групите ZT2 и ZT6. В групите ZT10 и ZT 22, броят на оцелелите мишки е съответно две и една (40 и 20 процента) (фиг. 2В). След 4-администриране на BrC, всички мишки умират в рамките на 3 дни, когато са дозирани при ZT14 или ZT18 (0 процента) и само една или две (20 или 40 процента) оцеляват в други ZT групи (фиг. 2C). MST беше почти в съответствие с броя на оцелелите мишки във всички групи (Фигури 2D–F). Тези резултати показват леталната хронотоксичност на трите междинни метаболита на ВВ. След прилагане при ZT14 (тъмна фаза), и трите метаболита показват висока токсичност. Интересното е, че моделите на хронотоксичност на тези метаболити на ВВ са различни от тези на самия ВВ, т.е. мишките, изложени на ВВ в тъмната фаза, имат по-ниска чувствителност към токсичност.8) По-рано съобщихме, че стрептомицинът, който показва нефротоксичност, е силно токсичен след експозиция в тъмна фаза и по-малко токсични след експозиция в светла фаза.9) Тези констатации от предишните проучвания не противоречат на тези от настоящото проучване, което предполага, че разликите в токсичността на BB и трите междинни метаболита на BB се приписват на техните целеви органи . BB е насочен към черния дроб, докато неговите междинни метаболити са насочени къмбъбреци.

След това изследвахме ефекта от времето на инжектиране върху тежестта на органната токсичност, като използвахме нелетална доза 4-BrC (165 mg/kg). Тъй като се наблюдава ранна смърт в рамките на 4 часа с 3-BrP и BrHQ инжекции, описани по-горе, ние избрахме само 4-BrC за следващите експерименти. За експериментално удобство избрахме ZT2 и ZT14 като времена на инжектиране. В групата ZT2 плазменото ниво на BUN, индикатор за нефротоксичност, не е повишено след експозиция на 4-BrC; въпреки това, нивото на BUN беше значително повишено в групата ZT14 (фиг. 3A). Паралелно с BUN измервахме плазменото ниво на AST, индикатор за хепатотоксичност. Установихме, че приложението на 4-BrC не повлиява плазмените нива на AST както при ZT2, така и при ZT14 (фиг. 3B), което предполага, че 4-BrC е токсичен само забъбреци. Освен това, ние оценихме нивата на MDA като индикатор за оксидативен стрес вбъбреци. Прилагането на 4-BrC значително повишава бъбречното ниво на MDA в групите ZT14 и ZT2. Въпреки това, нивото на MDA в групата на инжектиране на ZT2 е значително по-ниско от това в групата на ZT14 (фиг. 3C).

Към днешна дата са докладвани различни пътища на клетъчна смърт като апоптоза, некроптоза и фероптоза.11) Освен това се съобщава, че клетъчната смърт, причинена от 4-BrC, се медиира главно чрез некроза.6) За изследване на тип клетъчна смърт, индуцирана от 4-BrC, ние анализирахме нивата на протеини, свързани с клетъчната смърт: разцепена каспаза-3 за апоптоза, RIP1/RIP3 за некроптоза и GPX4 за фероптоза. Не са наблюдавани очевидни промени в нивата на разцепената каспаза-3, RIP1 и RIP3 във всяка група, което предполага, че апоптозата и некроптозата не са индуцирани от 4-BrC (фиг. 4). Обратно, понижение на нивото на GPX4 се наблюдава след прилагане на 4-BrC при ZT14 (фиг. 4). Ние не наблюдавахме 4-BrC-индуцирана бъбречна некроза чрез хистопатологичен анализ (данните не са показани). Това предполага, че концентрацията на 4-BrC, използвана в това проучване, причинява леко увреждане на бъбреците и не води до некроза. От тези резултати може да се предположи, че 4-BrC причинява фероптоза, която показва дневни вариации.

В това проучване ние показахме, че междинните метаболити на ВВ предизвикват хронотоксичност вбъбрек. За разлика от това, нашият предишен резултат показа индуцирана от BB нефротоксичност. Въпреки това, бъбречната хронотоксичност не се променя между светлата фаза и тъмната фаза.8) Въпреки че критичната причина за разликата между предишни и настоящи изследвания все още не е ясна, ние смятаме, че се е случило да се маскира бъбречната хронотоксичност чрез индуциране на тежка чернодробна нараняване. В бъдещия експеримент трябва да измерим натрупаните количества от всеки BB-междинен метаболит, тъй като тези количества могат да се променят от CYP и/или нивата на нараняване.

Много биологични фактори показват циркаден ритъм в техните нива на експресия. Например, Xu et al. съобщават за дневни вариации в експресията на чернодробния антиоксидантен ген при мишки.12) Глутатионът (GSH) е антиоксидант, който е от решаващо значение за поддържане на здравето и защита срещу токсични съединения. Съобщава се, че както 4-BrC, така и 3-BrP намаляват бъбречното ниво на GSH.4,13) Фероптозата беше предложена през 2012 г. като форма на клетъчна смърт, предизвикана от еластин, който инхибира вноса на цистеин, което води до изчерпване на GSH и инактивиране на GPX4.14) Нашите резултати показват, че GPX4 е потиснат само при ZT14 от 4-BrC. Следователно GSH-свързаните протеини или гени могат да бъдат свързани с хронотоксичност.

В заключение, настоящото ни проучване демонстрира, че BB индуцира бъбречно увреждане, както и чернодробно увреждане чрез своите метаболити, като 3-BrP, BrHQ и 4-BrC. Причината, поради която дневната вариация на нефротоксичността от BB не е наблюдавана в нашия предишен доклад, е, че бъбречното увреждане е маскирано поради силно чернодробно увреждане.

ПРЕПРАТКИ

1) Lau SS, Monks TJ. Приносът на бромобензена към настоящото ни разбиране за химически индуцирана токсичност. Life Sci., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Хепатопротективни ефекти на меда от Apis cerana Fabricius върху индуцирано от бромобензен увреждане на черния дроб при мишки. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Веди М, Сабина Е.П. Оценка на хепатопротективния и нефропротективния потенциал на withaferin A върху индуцирано от бромобензен увреждане при швейцарски мишки албиноси: възможно участие на митохондриална дисфункция и възпаление. Cell Biol. Токсикол., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. Ролята на 4-бромофенол и 4-бромокатехол в ковалентното свързване на бромобензен и токсичността в изолирани хепатоцити на плъх. Токсикол. Приложение Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Идентифициране на 2-бромохидрохинон като метаболит на бромобензен и о-бромофенол: последствия за индуцирана от бромобензен нефротоксичност. J. Pharmacol. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Ръш Г.Ф., Нютън Дж.Ф., Майта К., Куо Ч.Х., Хук Дж.Б. Нефротоксичност на фенолни метаболити на бромобензен при мишка. Токсикология, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, ​​Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Многопосочни анализи на чернодробна хронотоксичност, индуцирана от кадмий и при мишки. J. Toxicol. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, ​​Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Хронотоксичност на индуцирано от бромобензен чернодробно увреждане при мишки. J. Toxicol. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, ​​Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Хронотоксичност на индуцирано от стрептомицин бъбречно увреждане при мишки. Biol. Pharm. Бюл., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, ​​Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Потенциращият ефект на ацетаминофен и индуцираната от въглероден тетрахлорид хепатотоксичност се медиира от активиране на протеин за рецепторно взаимодействие при мишки. Токсикол. мех. Методи, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Програмирана некроза и болест: Ние прекъсваме редовното ви програмиране, за да ви донесем некро възпаление. Разлика в клетъчната смърт, 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Дневна вариация на експресията на чернодробния антиоксидантен ген при мишки. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Монкс TJ, Hinson JA, Gillette JR. Токсичност на бромобензен и р-бромофенол и ковалентно свързване in vivo. Life Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Диксън SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Фероптоза: зависима от желязото форма на неапоптозна клетъчна смърт. Клетка, 149, 1060–1072 (2012).

Хироки Йошиока, a,b,# Сара Томинага, a,# Май Нишикава, a Ясуро Шинохара, a Макото Накао, a Masae Yoshikawa, a Tohru Maeda,*, a и Нобухико Миура*,c

колеж по фармация, университет Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Япония: b Център за краниофациални изследвания, Център за здравни науки на Тексаския университет в Хюстън, Факултет по дентална медицина; 1941 East Road, Houston, TX 77054, САЩ: и cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 Момоно-Чо, Тоцука-Ку, Йокохама 245–2006, Япония. Получено на 30 август 2020 г.; приет на 25 октомври 2020 г

за повече информация: Ali.ma@wecistanche.com