Част 2: Ефектът срещу злокачествен асцит на общите дитерпеноиди от Euphorbiae Ebracteolatae Radix се дължи на промени в аквапорините чрез инхибиране на активността на PKC в бъбреците

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Всички знаем, че бъбрекът е най-важният орган в човешкото тяло. Ако бъбрекът не е добър, той трябва да подхрани бъбрека. Има много начини за подхранване на бъбреците. Някои хора ще ядатЦистанчеза подхранване на бъбреците. Цистанче е богато на алкалоиди,ехинакозид, вербаскум гликозидикристални неутрални вещества, аминокиселини, микроелементи, витамини и други съставки. Cistanche може също така да регулира кръвоносната система със следните ефекти: предпазва исхемичния миокард; понижават кръвните липиди, устояват на атеросклерозата и устояват на тромбозата; намаляване на периферното съдово съпротивление, разширяване на периферните кръвоносни съдове и понижаване на кръвното налягане; предпазва черния дроб и се противопоставя на мастния черен дроб.

3. Дискусия

Исторически EER се използва в TCM за лечение на раздуване на корема и оток [1]. В това проучване антиасцитните ефекти на EER са изследвани с помощта на асцитни мишки, носещи H22 туморни клетки. Злокачествените асцитни мишки се използват широко в изследванията за изследване на лечението на тумори и асцит [21,22]. Нашите резултати показват, че както EER, така и TDEE могат значително да намалят обема на асцита, докато NTDEE няма ефект. Тези резултати показват, че TDEE е антиасцитната активна фракция на EER. Предишни проучвания показват, че дитерпеноидите от EER имат инхибиторна активност върхутуморни клеткиin vitro [5,23]. Въпреки това, това проучване установи, че те нямат ефект върху жизнеспособността на туморните клетки, клетъчния цикъл или апоптозата на туморните клетки. Възможните причини за това несъответствие могат да включват разликите в дозите и лошата корелация между in vivo и in vitro активностите. TCM поддържа мнението, че EER е ефективен при лечението на оток главно чрез бързо регулиране на отделянето на урина и изпражнения [6]. Затова анализирахме ефекта на TDEE върху теглото на урината и съдържанието на фекална вода при асцитни мишки. Трябва да се отбележи, че теглото на урината и теглото на асцитната течност са били повлияни от TDEE при дози от 3 и 0.6g сурови билки/kg, докато съдържанието на фекална вода се увеличава само при 3 g сурови билки/kg, така че TDEE основно намален обем на асцита чрез намаляване на реабсорбцията на вода в бъбреците. Бъбречната реабсорбция на вода играе централна роля в поддържането на водната хомеостаза в тялото [16]. AQP осигуряват основните канали за бъбреците за реабсорбиране на вода и концентриране на урината [24]. Следователно, изследването на експресията на AQPs може да осигури механизъм за намаляване на асцита.

Различни AQP се изразяват в различни области набъбрек.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>70 процента от абсорбцията на вода в гломерулния филтрат [16]. AQP2, AOP3 и AOP4 се експресират изключително в събирателните канали, които са жизненоважни сегменти за регулиране на водния баланс и концентрацията на урина [16]. В настоящото изследване TDEE намалява протеиновата експресия на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 в бъбреците на мишки. Тези открития бяха потвърдени от резултатите от клетъчни експерименти in vitro. Инхибиторните активности на AQPs на основните дитерпеноиди в TDEE бяха оценени в клетъчните линии на проксималния тубул и събирателния канал. Нашите резултати показват, че дитерпеноидите в TDEE намаляват нивата на експресия на AQPs протеин и иРНК в HK-2 и mIMCD3 клетки.

Кликнете, за да се свържете с доставчика за покупка на Cistanche tubulosa

Относителните нива на експресия на AQPs протеин и иРНК на всеки дитерпеноид бяха сравнени с контролната група.Бъбречнатубулите са важен компонент на реабсорбцията на вода. Сред четирите дитерпеноиди, ент-абиетановите дитерпеноиди йолкинолид B (1269 процента от TDEE) имат най-силен ефект върху регулирането на AQP1 в HK-2 клетки. Сравнявайки го със структурата на съединение 2, йолкинолид В (съединение 3) има два епоксидни пръстена в позиции на C-11 и 14. Когато епоксидният пръстен при C-11 и 14 бяха съответно преобразувани към хидроксилна и двойна връзка в съединение 2, инхибиторната активност на AQP1 изчезва. Концентрацията на урината се осъществява главно в събирателните тубули на бъбреците. Резултатите от mIMCD3 клетките показаха, че розан дитерпеноидното съединение 4 и нордитерпеноидното лактоново съединение 5 (представляващи съответно 9,16 процента и 39,26 процента от TDEE) имат най-силните инхибиторни ефекти върху експресията на AQP2, AQP3 и AQP4. Инхибиторните ефекти на ент-абиетановите дитерпеноиди са слаби в сравнение с тези два вида дитерпеноиди. Инхибиторните ефекти на различни видове дитерпеноиди върху различни AOPs в бъбреците не са еднакви, което може да се дължи на вариации в химичната структура на дитерпеноидите и времето за реакция на AQPs към всяко съединение. Като цяло, тези дитерпеноиди могат да придадат синергични инхибиторни ефекти на AQP. Тъй като активността на тези дитерпеноиди е оценена in vitro, активността на тези съединения след метаболизма in vivo остава неясна и следователно се нуждае от допълнително изследване.

Няколко проучвания предполагат, че PKC и PKA функционират в регулирането на AQP [17-20]. PKC е семейство серин/треонин кинази, участващи в различни клетъчни сигнални трансдукции [26]. Семейството PKC включва няколко изоформи [26]. След активиране, PKC се преместват от цитозола към плазмената мембрана, свързват се с диацилглицерол (DAG) и впоследствие предизвикват серия от физиологични промени [27]. Транслокацията на PKC от цитозола към плазмената мембрана е индикатор за активиране на PKC [28]. DAG се генерира чрез PLC катализирана хидролиза на мембранен фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2)[27]. В експерименти с животни, ние измервахме нивата на експресия на PKCo и PKC в мембранната фракция. В същото време открихме и промените в протеините нагоре по веригата на PKC. Резултатите предполагат, че TDEE намалява експресията на PKC върху клетъчната мембрана и инхибира активността на PKC. Въпреки това, не се наблюдава ефект на TDEE върху нивото на фосфорилиране на PLC. TDEE може директно да се свърже с PKC и да инхибира активирането на PKC. PKA ензимната активност се контролира основно от регулаторни субединици, които образуват холоензимен комплекс с каталитичните субединици [29] Освобождаването на каталитични субединици е отличителен белег на PKA активирането [29]. Открихме, че лечението с TDEE няма ефект върху активирането на PKA. За да проучим дали инхибирането на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 в бъбреците се медиира чрез блокиране на активирането на PKC сигнали, ние използвахме PMA като PKC агонист, за да се намесим в експресията на AOP1, AOP2, AQP3 и AQP4 в HK{ {19}} и mIMCD3 клетки. Нашите резултати показват, че еуфебрактеолатин А (дитерпеноидът от TDEE) намалява нивата на експресия на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 вбъбречни клетки. Индуцираното от Euphebracteolatin A инхибиране на експресията на AOP1, AOP2, AOP3 и AQP4 беше блокирано от PMA. Следователно, ние заключаваме, че TDEE регулира експресията на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 чрез инхибиране на активирането на PKC. PKC изоформите са многобройни; TDEE може също да регулира експресията на AQP чрез инхибиране на други изоформи, които очакват по-нататъшни изследвания. Към днешна дата молекулите надолу по веригата на PKC, които регулират експресията на AQP, остават слабо разбрани. В следващата стъпка ще се съсредоточим върху регулаторните механизми надолу по веригата на PKC.

В обобщение, TDEE е активна фракция на EER срещу асцит. TDEE се състои от дитерпеноиди като типове ент-абиетан, розан и нордитерпенови лактони. TDEE и неговите дитерпеноиди могат да инхибират реабсорбцията и концентрацията на вода в бъбреците чрез намаляване на нивата на експресия на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4, като по този начин разрешават асцита. Инхибирането на експресията на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 в бъбреците от TDEE е свързано с инхибирането на активирането на PKC. Това проучване може да предостави основата за клиничното приложение на EER и идентифицирането на кандидат-лекарства, които придават диуреза и антиасцитни ефекти.

4. Материали и методи

4.1. Химикали и реактиви

Комплект за анализ на албумин беше закупен от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай). HPLC-клас ацетонитрил е закупен от Media Co. (Anqing, Китай). Модифицираната на Dulbecco среда на Eagle (DMEM) беше получена от HyClone (Logan, UT, USA). Минимална есенциална среда с неесенциални аминокиселини (MEM NEAA) и фетален говежди серум (FBS) са получени от Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Китай). Заешки анти-AQP1 и AQP3 антитела са получени от EnoGene Co., Ltd. (Нанкин, Китай). Заешки анти-AQP2, AQP4 и миши анти- -актинови антитела бяха закупени от Zen BioScience Co., Ltd. (Чънду, Китай). Заешки анти-PKC, PKC, PLC и фосфо-PLC(Tyr783) антитела бяха закупени от Affinity Biosciences Co., Ltd. (Changzhou, Китай). Буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA буфер), клетъчен цикъл и комплекти за откриване на клетъчна апоптоза бяха предоставени от Yifeixue Biotechnology (Nanjing, Китай). BCA комплект беше закупен от Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). TRIzol реактивен буфер е закупен от Thermo Fisher Scientific (Карлсбад, Калифорния, САЩ). PVDF мембраните са закупени от Millipore (Bedford, MA, USA). Комплект за синтез на cDNA беше закупен от YEASEN Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай).

4.2. Растителен материал

EER, коренът на Euphorbia ebracteolate Hayata, беше закупен от Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd. (Божоу, Китай) на 15 септември 2017 г. и удостоверен от професор Харбин Ху от Института за контрол на храните и лекарствата в Дзянсу. Образец на ваучер (WH20170915) беше депозиран в хербариума на традиционната китайска медицина към Училището по фармация на Университета по китайска медицина в Нанкин.

4.3. Екстракция и изолиране на TDEE и пречистване на дитерпеноиди

EER се пулверизира с помощта на механична мелница. Прахът (100 g) се подлага на последователна екстракция на Soxhlet екстрактор в продължение на 6 часа с дихлорометан. След това екстрактът се концентрира при понижено налягане, при което се получава дихлорометанов екстракт. Екстрактът от дихлорометан се подлага на колонна хроматография (СС) върху ODS, като се елуира последователно с 40 процента и 90 процента метанол. Елуентът от 90 процента метанол се събира, концентрира се и се суши, за да се получи TDEE (2.4 g). Екстрахираните остатъци се обединяват и екстрахират три пъти с 95 процента етанол. След това екстрактът се смесва и се изпарява до сухо, за да се получи NTDEE (15.6 g). TEER (19.8 g) се екстрахира от EER прах (100 g) с 95 процента етанол. Тези екстракти са използвани в експерименти с животни.

Основните съединения на TDEE бяха изолирани чрез следния процес. Коренът на EER (20 kg) се смила на прах и се екстрахира с дихлорометан в продължение на 72 часа при стайна температура чрез накисване три пъти. Дихлорометановият екстракт се получава и се концентрира с помощта на ротационен изпарител. Остатъкът се подлага на СС върху силикагел, като се използва градиентна система с нарастваща полярност с CH, Cl и MeOH (100:0-0:100), за да се получат 8 фракции (Fr. 1-Fr.8) . Fr.4 се подлага на колона със силикагел, елуиране с петролев етер-EtOAc (от 50:1 до 1:1), последвано от обратнофазова ODS CCелуиране с MeOH-H, O от 60 процента до 80 процента, за да се получат съединения 5 и 6. Fr.5 се хроматографира върху колона със силикагел, като се елуира с петролев етер-EtOAc (от 35:1 до 0:1), за да се получат 7 субфракции (Fr.5.1-Fr.5.7). Fr.5.3 се разделя чрез ODS CC елуиране с MeOH-H2O (от 75 процента до 100 процента), последвано

чрез полупрепаративна HPLC (MeOH-H2O, от 75 процента до 100 процента), за да се получи съединение 4.Fr.5.4, се хроматографира върху колона със силикагел, елуирайки с петролев етер-EtOAc (от 30:1 до 5:1), последвано от Sephadex LH-20(MeOH:CH2CI, 1:1) и полупрепаративна HPLC (MeOH-H, O, от 60 процента до 95 процента), за да се получи съединение 3.Fr. 5.6 се пречиства чрез ODS CC, елуиране с градиент на MeOH-H2O от 40:60 до 100:0, последвано от Sephadex LH-20 CC (CHCl-MeOH, 1:1), за да се получат съединения 1 и 2.

4.4. Експерименти In Vivo

4.4.1. Животни и експериментален дизайн

ICR мъжки мишки (тегло: 18-22 g) са получени от Qing Long Shan Animal Breeding Farm (Nanjing, Китай). Мишките се държат в стандартни лабораторни клетки при умерена влажност (50 процента ± 5 процента) при постоянна температура (22 ± 1 градус) в 12-часова стая с цикъл светло-тъмно. Всички животни имаха свободен достъп до храна и вода по време на експерименталния период. Експерименталният протокол беше одобрен от Комитета по етика на животните към Нанкинския университет по китайска медицина (Нанкин, Китай).

Общо 90 мъжки мишки бяха разделени на случаен принцип в 9 групи (n= 10). Контролната група беше инжектирана интраперитонеално с 0.2 ml физиологичен разтвор. Мишките в другите групи бяха интраперитонеално инокулирани с 1 × 1{{10}} степен Н22 клетки в обем от 0.2 mL. Всички лекарства бяха суспендирани във вода с 0.5 процента (wo/o)натриева карбокси метилцелулоза (0.5 процента Na-CMC). След 24 часа, мишките бяха третирани чрез сонда всеки ден съгласно следната схема в продължение на 8 дни: нормални и моделни групи бяха администрирани 0, 5 процента Na-CMC. Фуроземид (6 mg/kg) беше избран като положителна контрола, тъй като се използва широко за лечение на едематозни заболявания като асцит чрез диурезния ефект. На групите TEER, TDEE и NTDEE са прилагани съответните екстракти от EER (3,0 и 0,6 g сурови билки/kg).

4.4.2. Анализ на теглото на асцитната течност, теглото на урината и съдържанието на фекална вода

Мишките от модела и третираните групи бяха умъртвени и асцитната течност беше събрана от перитонеалната кухина. След това течността се претегля на електронна везна.

Мишките бяха настанени в отделни клетки. Изпражненията се събират в претеглени и запечатани флакони. След 5 часа флаконите, съдържащи влажни изпражнения, се претеглят. След това флаконите бяха изсушени до постоянно тегло при 105 градуса. Съдържанието на фекална вода (процент)=((тегло на флаконите, съдържащи влажни изпражнения - теглото на флаконите, съдържащи изсъхнали изпражнения)/(тегло на флаконите, съдържащи влажни изпражнения - теглото на флаконите)) × 100.

Теглото на отделената урина се измерва чрез модификация на предишен метод [30]. Мишките бяха настанени в отделни чаши. Чашите бяха покрити с метална мрежа на гърлото, след което обърнати върху пластмасовите съдове, съдържащи суперабсорбиращ полимер (SAP). При този тест изпражненията бяха почистени. След 5 часа пластмасовите блюда, съдържащи SAP и урина, бяха претеглени. Следното уравнение беше използвано за определяне на теглото на урината: тегло на урината (g)=тегло на пластмасовите съдове, съдържащи SAP и тегло на урината на пластмасовите съдове, съдържащи SAP.

4.4.3. Анализ на серумен албумин

Кръвта от всички групи се събира чрез орбитална пункция и се центрофугира при 5000 × g за 10 минути при 4 градуса. Серумният албумин се измерва с помощта на комплект за анализ на албумин.

4.4.4. Тестове за жизнеспособност на туморни клетки, цикъл и апоптоза

След като мишките бяха умъртвени, асцитната течност, съдържаща туморните клетки, беше събрана от перитонеалната кухина и незабавно разредена 20 пъти с физиологичен разтвор. Жизнеспособността на туморните клетки се оценява чрез оцветяване с 0,4 процента трипаново синьо и се преброява в автоматизиран брояч на клетки (ALIT Life Science Co., Ltd., Шанхай, Китай).

Разредената клетъчна суспензия (0.5 mL) се центрофугира при 1000 g за 5 минути при 4 градуса С. Клетките се събират и фиксират в студен 70 процента етанол при 4 градуса за една нощ. След фиксиране, туморните клетки се промиват два пъти в PBS и се центрофугират, след което се инкубират с разтвор на РНКаза А (100 μL) за 30 минути при 37 градуса. Накрая клетките се инкубират с 400 μL пропидиев йодид

(PI) за 30 минути при 4 градуса на тъмно и се филтрира през 300-мрежеста найлонова мембрана. Процентът на клетките в различни фази беше анализиран с помощта на Accuri C6 Flow Cytometer (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).

Апоптозата на туморни клетки беше открита с помощта на комплект за апоптоза Annexin V-FITC/PI. Разредената клетъчна суспензия (0.5 mL) се промива два пъти в PBS и се центрофугира при 1000 g за 5 минути при 4 градуса. Клетките се събират и ресуспендират в 100 uL свързващ буфер, последвано от инкубиране с 5 μL Анексин V-FITC и 10 μL PI оцветяващ разтвор за 15 минути при стайна температура на тъмно. След инкубиране към всяка епруветка се добавят 400 μL свързващ буфер. Клетъчната апоптоза се открива с помощта на Accuri C6 Flow Cytometer.

4.4.5. Western Blot анализ на AQPs, PKC, PKA и PLC в бъбреците

След като мишките бяха умъртвени, бъбреците бяха изолирани и бързо замразени и след това съхранени при -80 градуса за анализ на протеиновата експресия. Тъканните проби се хомогенизират в RIPA лизисен буфер. След съхранение при -20 градуса за една нощ, тъканните лизати се събират след центрофугиране за 10 минути при 12,000×g. След центрофугиране, супернатантата се събира за определяне на общи и фосфорилирани протеини. Мембранните протеини се екстрахират от бъбреците с помощта на комплект за екстракция на мембранен протеин съгласно протокола на производителя. Концентрациите на протеина се определят с помощта на BCA комплект. Протеиновите разтвори се денатурират във вряща вода в продължение на 5 минути и се смесват с 5 × зареждащ буфер. Равни количества протеини се разделят при електрофореза с 10% SDS-полиакриламиден гел, прехвърлят се към мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) и впоследствие се блокират с 5% албумин от говежди серум (BSA) за 2 часа. След блокиране, мембраните се инкубират с първични антитела срещу AOP1(1:2000), AOP2(1:1000), AQP3(1:2000),AQP4(1:1000), PKC (1:2000), PKC (1: 2000), PKA (1:2000), PLC (1:2000), p-PLC (1:800) и -актин (1:5000) при 4 градуса за една нощ. След това мембраните се промиват с Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1 процента Tween-20(TBST), и първичните антитела се откриват с вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (1:5000). Протеините се визуализират с хемилуминесцентен реагент и система за хемилуминесцентно изобразяване Tanon 5200 (Tanon, Шанхай, Китай). Блот лентите се определят количествено чрез денситометрия с помощта на ImageJ.

4.5. Определяне на шест основни дитерпеноиди в TDEE

Euphoria G, ent{{0}}l-хидроксиабикта-8(14),13(15)-диен-16,12-олид,йолкинолид B, EU-фебрактеолатин A, Fischer A и jolkinolide E бяха разтворени в ацетонитрил до подходящите концентрации. TDEE също беше разтворен в ацетонитрил за откриване на съдържанието на съставките с помощта на HPLC. HPLC анализът се извършва на система за разделяне Waters 2695, оборудвана с фотодиоден детектор (Waters, Milford, CT, USA) и колона Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Подвижната фаза се състои от 0,1 процента мравчена киселина вода (А) и ацетонитрил (В). Разтворителят се развива със скорост на потока от 1 mL/min, като се използва следната градиентна програма:0-25 min, 65 процента B;25-40 min, 65 процента -85 процента B;{{25 }} min, 85 процента -100 процента B. Инжекционният обем беше 10 μL. Температурата на колоната е 30 градуса и е използвана дължина на вълната 265 mm.

4.6. Експерименти ин витро

4.6.1. Клетъчна култура

Клетките HK-2 и mIMCD3 бяха закупени от Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Ухан, Китай). Всички клетки се култивират в инкубатор в атмосфера с 5 процента CO2 при 37 градуса до 90 процента сливане и след това се третират с различни съединения и се управляват за експериментите. HK-2 клетките се отглеждат в MEM NEAA, допълнен с 10 процента FBS и 1 процент антибиотици, докато mIMCD3 клетките се отглеждат в DMEM среда, съдържаща 10 процента FBS и 1 процент антибиотици.

4.6.2. Уестърн блот и количествена обратна транскрипция-PCR (qRT-PCR) анализи на AQPs

HK{{0}} и mIMCD3 клетки се посяват (5 × 105/ямка) в 6-плаки с ямки за 24 и 12 часа преди третиране. Клетките бяха третирани с различни съединения в продължение на 8 часа в 5 процента CO, инкубатор при 37 градуса. Клетки, третирани с 0,1 процента диметилсулфоксид, се използват като контролен носител. След третирането, клетките се промиват два пъти в студен PBS, събират се чрез изстъргване в RIPA лизисен буфер и след това се лизират. След съхранение при -20 градуса за една нощ, лизатите се избистрят чрез центрофугиране при 12,000×g за 10 минути и супернатантите се събират и използват в Western blot анализ. Уестърн блот се провежда, както е описано по-рано в експериментите с животни в тази статия.

За изолиране на тотална РНК. След инкубиране с различни съединения в продължение на 8 часа, клетките се промиват с PBS и се разтварят в TRIzol реактивен буфер и РНК се изолира съгласно указанията на производителя. сДНК се синтезира от равно количество РНК, като се използва комплект за синтез на сДНК. Реакционната смес за gRT-PCR се приготвя чрез добавяне на cDNA, прав и обратен праймери, споменати в Таблица 1, DEPC вода и SYBR зелена основна смес. За анализ на генната експресия беше използван Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR инструмент. PCR условията бяха както следва: първоначална денатурация при 95 градуса за 5 минути, последвана от 40 цикъла от 95 градуса за 10 секунди и 60 градуса за 34 секунди. Накрая, PCR данните бяха анализирани чрез двойни делта CT методи в електронна таблица на Microsoft Excel.

4.6.3. Ефект на PKC агонист PMA върху експресията на AQPs протеин в бъбречни клетки

Клетките HK-2 и mIMCD3 бяха поставени върху 6-плаки с ямки при плътност от 5 × 10 градуса клетки/ямка. След прикрепването на клетките, клетките бяха предварително инкубирани с или без 200 nM PKC агонист (PMA) за 1, 5 часа и след това третирани с еуфебрактеолатин А (2, 5 μM) за 8 часа. Екстракцията на общи и мембранни протеини и Western blotting анализ бяха извършени, както е описано подробно по-рано.

4.7. Статистически анализ

За статистически анализ беше използван софтуер за анализ SPSS 19.0. Данните бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA или тест за ранг-сума. Числените данни бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Разлики с т<0.05 were="" considered="" statistically="">