Дисекцията на отговорите на антителата на ваксинирани с Gam-COVID-Vac субекти предполага участие на епитопи извън RBD в неутрализирането на SARS-CoV-2
Oct 16, 2023
Резюме: Милиони хора са били ваксинирани с Gam-COVID-Vac, но фините специфики на индуцираните антитела не са напълно проучени. Плазма от 12 нелекувани и 10 реконвалесцентни субекта с коронавирусна болест 2019 (COVID-19) е получена преди и след две имунизации с Gam-COVID-Vac. Реактивността на антитялото в плазмените проби (n=44) е изследвана върху панел от микро-матрици рекомбинантни нагънати и разгънати тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) протеини и 46 пептида, обхващащи шипа протеин (S) и чрез имуноглобулин G (IgG) подклас ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Способността на Gam-COVID-Vac-индуцираните антитела да инхибират свързването на рецептор-свързващия домен (RBD) към неговия рецептор ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (ACE2) беше изследвана в анализ на молекулярно взаимодействие (MIA). Капацитетът на антителата за неутрализиране на вируса е изследван чрез псевдотипизиран тест за неутрализация на вируса (pVNT) за Wuhan-Hu-1 и Omicron. Установихме, че ваксинацията с Gam-COVID-Vac индуцира значително повишаване на IgG1, но не и на други подкласове IgG срещу сгънат S, шипова протеинова субединица 1 (S1), шипова протеинова субединица 2 (S2) и RBD по сравним начин при нелекувани и реконвалесцентни предмети. Неутрализацията на вируса е силно корелирана с индуцирани от ваксинация антитела, специфични за нагънат RBD и нов пептид (т.е. пептид 12). Пептид 12 е разположен близо до RBD в N-терминалната част на S1 и може потенциално да участва в прехода на конформацията преди към след сливането на шиповия протеин. В обобщение, ваксинацията с Gam-COVID-Vac индуцира S-специфични IgG1 антитела при нелекувани и реконвалесцентни субекти по сравним начин. Освен антителата, специфични за RBD, антителата, индуцирани срещу пептид, близък до N-края на RBD, също са свързани с неутрализация на вируса.
Ключови думи: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; епитоп; антитяло; неутрализиране на вируса; анализ на молекулярно взаимодействие; Омикрон
ползи от добавката Cistanche-увеличаване на имунитета
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Въведение
След първите случаи на заразяване с тежък остър респираторен синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) в края на 2019 г. в Ухан, Китай, новата коронавирусна болест (COVID-19) бързо се разпространи навсякъде света и прерасна в глобална пандемия [1–4]. Бързото развитие на ваксините срещу COVID-19 и въвеждането на глобални програми за ваксиниране, заедно с появата на по-малко патогенни варианти на SARS-CoV-2, се считат за значими фактори за намаляване на смъртните случаи,-19-свързани с COVID и тежестта на пандемията [1,5]. Първите ваксини, които станаха достъпни, бяха генетични ваксини, базирани на медииран от аденовирус трансфер на гена, кодиращ повърхностния протеин S на SARS-CoV-2 [6–8]. SARS-CoV-2 S протеинът се състои от S1 субединицата, съдържаща рецепторно свързващ домен (RBD), прикрепен към своя рецептор ACE2 върху човешки клетки, и S2 субединицата, която осигурява прикрепването на вируса към мембраната на клетката гостоприемник чрез протеолитично разцепване на слят пептид (FP) по време на вирусната инфекция [9]. Генът S, използван за генен трансфер в някои базирани на аденовируси ваксини (напр. COVID-19 Vaccine Janssen), може да бъде модифициран, за да стабилизира протеина и да повлияе на неговото разцепване, но това не е така за другите [10]. Човешките клетки, които са заразени от аденовируси, съдържащи S-кодиращия ген, произвеждат различно количество от S антигена, който се освобождава и представя от основния комплекс за хистосъвместимост (МНС) клас II на Т клетките, което води до подпомагане на CD4+ Т клетките за производството на S-специфични антитела. S протеинът, експресиран от трансфектирани клетки, също се представя от МНС клас I на повърхността на заразената клетка и задейства активирането на S-специфични цитотоксични CD8+ Т клетки, които могат да разпознаят S антиген-продуциращи клетки и да ги унищожат. Принципът на ваксинацията, т.е. въвеждането на S-кодираща генетична информация в клетките гостоприемници и последващото производство на S антиген от заразените клетки, е подобен на ваксините с информационна рибонуклеинова киселина (mRNA), въпреки че технологията на генния трансфер се различава от тази на аденовируса ваксини на основата. По този начин „генетичните ваксини“ имитират до известна степен естествена SARS-CoV-2 инфекция. Идентифицирането на епитопи, разпознати от антитела от ваксинирани субекти, участващи в неутрализацията на вируса, е от решаващо значение не само за разбирането на механизма на действие на съществуващите ваксини, но и за разработването на усъвършенствани стратегии за активна ваксинация и пасивна имунизация срещу COVID-19 [11 ,12]. Повечето от настоящите ваксини са фокусирани върху получаване на отговор на S-специфично антитяло със специално внимание към отговора на специфично антитяло за RBD, тъй като е установено, че специфичните за RBD антитела са свързани с висока неутрализираща активност срещу SARS-CoV-2 [ 13–15]. Въпреки това, броят на мутациите, придобити от всеки нов проблемен вариант (VOC), показва значението на идентифицирането на епитопи, запазени сред VOCs, насочени от неутрализиращи антитела, които се намират не само в RBD, но и извън RBD [16]. Всъщност има проучвания, показващи наличието на неутрализиращи епитопи извън RBD, които се разпознават от антитела след имунизация [17–20]. През 2020 г. векторно базираната ваксина Gam-COVID-Vac, наричана още Sputnik-V, стана достъпна за използване в клиничната практика и в момента е одобрена за употреба в повече от 70 държави (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (достъп на 17 януари 2023 г.)). Според ресурса Our World In Data (OWID) 79 милиона души в Русия са получили поне една ваксина, а 72 милиона са напълно ваксинирани (https://ourworldindata.org/ covid-vaccinations?country= RUS (достъп на 22 март 2022 г.)). Gam-COVID-Vac се състои от два вида ваксини, които се основават на два различни човешки аденовирусни вектора (hAd26 и hAd5), носещи нативната форма на S-протеина на щама Wuhan-Hu-1 SARS-CoV{{ 73}}. Sputnik-V включва две инжекции, една с hAd26 и втора с hAd5 и Sputnik light, само с hAd26. Двата различни аденовирусни вектора се използват за първата и втората имунизация, за да се намали възможността ваксинираните субекти да продуцират имунитет към S протеиновия имунитет срещу аденовируса. Всъщност аденовирус-специфичните антитела биха ограничили ефикасността на бустерните ваксинации чрез неутрализиране на аденовирусния векторен носител. Следователно, на 21-вия ден след прилагане на първата доза от ваксина с rAd26, се извършва повторно доставяне на антиген с rAd5 вектор [8,21]. Малко проучвания са изследвали в значителна степен отговорите на S- и RBD-специфични антитела и активността на неутрализиране на вируса в серуми от Gam-COVID-Vac ваксинирани [10,22,23]. Съобщава се за повишаване на RBD-специфичните IgG антитела три месеца след прилагане на Gam-COVID-Vac и е доказано, че антителата реагират кръстосано с вариантите на Алфа, Бета, Делта и Омикрон, които представляват загриженост [24–26]. Gam-COVID-Vac също беше сравнен с няколко други лицензирани ваксини срещу SARS-CoV-2, които показаха висока степен на неутрализиране на вируса и висока ефективност срещу свързаната с COVID{102}}смъртност за Sputnik-V, макар и лека по-ниска ефективност към някои иРНК ваксини по отношение на неутрализирането на вируса [24]. И накрая, доказано е, че имунизацията на пациенти с положителен човешки имунодефицитен вирус (HIV+), лекувани с антиретровирусна терапия (третирани с ART) с Gam-COVID-Vac показва епидемиологична ефикасност срещу оригиналния див тип и Delta варианта на SARS-CoV{{ 113}} [27]. Досега обаче не е извършен подробен анализ на разпознаването на епитопа от антитела при ваксинирани с Gam-COVID-Vac субекти и са необходими данни, за да се разберат отговорите на изотипа на имуноглобулина и подкласа на IgG при ваксинирани с Gam-COVID-Vac субекти. Тук изследвахме две групи субекти, които са били ваксинирани с Gam-COVID-Vac, една, която е имала предишна инфекция със SARS-CoV-2, и друга група наивни субекти със SARS-CoV-2. Извършихме щателен анализ на епитопната специфичност на индуцираните антитела, използвайки нагънати и разгънати протеини и пептиди, получени от микроматрици на SARS-CoV-2-, обхващащи целия S протеин, включително RBD. Освен това бяха анализирани отговорите от подклас IgG. Нашето проучване разкрива, че субекти, ваксинирани с Gam-COVID-Vac, монтират RBD-специфични антитела, способни да блокират взаимодействието RBD-ACE2. Интересното е, че ние открихме, че неутрализирането на вируса също е свързано с антитела, насочени срещу пептид извън RBD, който може да участва в прехода на прето-пост-фузионната конформация на шиповия протеин.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
2. Резултати
2.1. Субекти, ваксинирани с Gam-COVID-Vac, включват нелекувани и реконвалесцентни субекти с COVID-19
Възстановяващите се субекти са били заразени от щама Wuhan-Hu-1 според неговото разпространение и данни за последователността, получени по време на инфекцията в района на Москва. Наивните субекти не са имали симптоми на COVID-19 и са им липсвали SARS-CoV-2-специфични антитела по време на набирането. Субектите на изследването включват 15 жени и 7 мъже със средна възраст 60 (т.е. 25–70 години) (Таблица 1).
Таблица 1. Демографски, клинични и серологични характеристики на субектите.
Беше получена плазмена проба от всеки от субектите във времева точка 0 (т.е. базова линия) (Фигура 1A), след което всеки субект беше ваксиниран със Sputnik-V с интервал от приблизително 21 дни между първия и втория инжектиране (времеви точки 1 и 2). Във времевата точка 3 беше събрана втора плазмена проба, за да се определят индуцираните от ваксината отговори на антитела (Фигура 1А). Субектите бяха наблюдавани още 120 дни. На 110-ия ден след последната ваксинация един субект (т.е. субект 22) е имал COVID-19, докато другите не са развили никакви симптоми на COVID-19 (Таблица 1).
Фигура 1. Дизайн на изследването и SARS-CoV-2-специфични антитела отговори преди и след ваксинация със Sputnik-V. (A) Дизайн на изследването. Бяха получени плазмени проби от нелекувани с COVID-19- (n=12) и реконвалесцентни субекти (n=10) във времева точка 0 (базова линия), след което субектите получиха два Sputnik-V ваксинации във времеви точки 1 и 2, съответно и плазмена проба е получена във времева точка 3 (т.е. ден 80–85 след първата ваксинация). (B) Нива на нуклеокапсид-специфични IgG антитела (y-ос: ISU) при нелекувани и реконвалесцентни субекти (x-ос) на изходно ниво. Хоризонталната линия показва границата за положителност. (C) Нива на IgG антитела (y-оси: ISU), специфични за RBD, S, S1 и S2 при субекти във времева точка 0 и 3 (x-оси). (D) Отляво надясно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 нива на антитела (у-оси: стойности на оптична плътност OD) до S (горна част) и RBD (долна част) във времеви точки 0 и 3 ( x-оси). Посочени са значителни разлики между групите, определени чрез теста на Wilcoxon: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—незначително.
2.2. Gam-COVID-Vac ваксинацията предизвиква широки IgG отговори на S, включително S1, RBD и S2
ползи от добавката Cistanche-увеличаване на имунитета
Извършихме подробен анализ на отговорите на антитела към голям панел от микро-матрици нагънати и разгънати SARS-CoV-2 протеини и пептиди, обхващащи S протеина в плазмени проби от SARS-CoV-2-наивни и реконвалесцентни субекти след пълен курс на имунизации с Gam-COVID-Vac (Фигура 1A,B; Таблица 1). При сравняване на плазмени проби от времева точка 0 и времева точка 3 след ваксинацията беше установено значително индуциране на IgG отговори срещу сгънат, но неразгънат RBD, S, S1 и S2 (Фигура 1C). Три месеца след ваксинацията пациентите показват 21-кратно увеличение на RBD-специфичните IgG антитела (p < 0.{{20}}001) и {{ 18}}кратно увеличение на S-специфичните IgG антитела (т.е. времева точка 0: средно 0,291, времева точка 3: средно 5,778) (p <0,0001), съответно. IgG антителата срещу S1 се увеличиха 3.7-пъти (p=0.0023), а IgG антителата срещу S2 се увеличиха 2.8-пъти (p=0.0094) (Фигура 1C ). Ваксинацията с Gam-COVID-Vac индуцира главно IgG отговори на сгънати S, S1 и RBD сравнително при нелекувани и реконвалесцентни субекти (Фигури 1C, S2 и S3), което показва, че може да се използва за усилване на SARS-CoV-2- специфични антитяло отговори също и при реконвалесцентни субекти. Значително повишаване на IgG антителата срещу RBD, S и S1 се наблюдава при нелекувани и реконвалесцентни субекти (Фигура S2) и няма значителни разлики по отношение на нивата на IgG спрямо RBD, S, S1 и S2 при нелекувани и реконвалесцентни субекти в точка 3 (Фигура S3).
2.3. Gam-COVID-Vac ваксинацията индуцира главно отговор на подклас IgG1 към S и RBD
Съобщава се, че алерген-специфичната имунотерапия (AIT) индуцира главно алерген-специфични IgG1 и IgG4 отговори, които се различават не само по отношение на техните ефекторни функции (IgG1 може да медиира антитяло-зависима клетъчна цитотоксичност (ADCC) и активиране на комплемента, докато IgG4 няма тези ефекторни функции), но и по отношение на тяхната кинетика (IgG1: бързо начало и ранен спад: IgG4: бавно начало, но устойчиви нива) [28–30]. Затова изследвахме отговорите на подклас IgG (т.е. IgG1–IgG4) към S и RBD при субекти, ваксинирани със Sputnik-V. Фигура 1D показва, че ваксинацията индуцира почти изключително IgG1 подклас отговор към S и RBD. Значително повишаване на нивата на IgG1, специфични за S и RBD (p=0.0002 и p=0.0071, съответно) бяха открити след ваксинация. Въпреки това не могат да бъдат открити съответни отговори на подклас IgG2, IgG3 или IgG4, специфични за S и RBD (Фигура 1D).
2.4. Индуциране на вирус-неутрализиращи антитела и антитела, инхибиращи взаимодействието RBD-ACE2 чрез Gam-COVID-Vac ваксинация
За откриване на антитела, неутрализиращи вируса, използвахме pVNT тест, при който вирусоподобни частици бяха псевдотипизирани с S-протеин от оригиналния щам Wuhan-Hu-1 и наскоро описания VOC Omicron. Антитела с неутрализираща активност за щам Wuhan Hu-1 бяха открити във всички с изключение на един (т.е. субект 22) от 22 субекта (Фигура 2A, Таблица 2), докато титрите на неутрализиращи антитела за Omicron бяха значително по-ниски (Фигура 2B) и открити само при 17 от 20 субекта (Фигура 2А, Таблица 2). Не е намерена съответна неутрализация за субекти 6, 7, 10, 11, 15 (Фигура 2А, Таблица 2). Вирус неутрализиращите титри за Omicron са 25 пъти по-ниски, отколкото за WT (средно 141,9 и 5,7 съответно за Wuhan-Hu-1 и Omicron) (Фигура 2B).
Фигура 2. Вирус-неутрализираща активност в плазмата 3 месеца след ваксинация Sputnik-V и асоциация с отговорите на IgG антитела към RBD и S-производни пептиди. (A) Неутрализиране на вируса (ID50) (ос y) срещу щам Wuhan-hu-1 (зелено) и Omicron (оранжево) е получено с плазма от нелекуван (син) и реконвалесцент (червен) предмети (оси x). (B) Сравнение на неутрализацията на вируса (у-ос: ID50, получена за плазма от тестваните субекти, стълбовете представляват медиани с интерквартилен диапазон (IQR) Wuhan Hu-1 (зелен) и Omicron (оранжев) Хоризонталната линия представлява резултати, получени с плазма от здрав, неинфектиран контролен субект (здрава контрола, HC) Значимите разлики между щамовете са определени чрез теста на Mann-Whitney: **** p < 0. {{30}}001. (C) Локализация на RBD и пептиди, свързани с неутрализацията на вируса в схема на S (S1, S2). (D) Корелации между титрите на неутрализация на вируса за Wuhan-Hu{{19 }} (WT) или Omicron (у-оси) и нива на IgG, специфични за RBD и получени от шипове пептиди 12, 32 и 46A (х-оси: ISU). Сините и червените символи показват съответно нелекувани и реконвалесцентни субекти. Звездички показват значими корелации според непараметричния тест на Spearman, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=не е значимо.
Таблица 2. Сравнение на нивата на IgG, специфични за S, S1, S2 и RBD, измерени чрез микрочипове с инхибиране на свързването на RBD с ACE2 и титри на неутрализация на вируса (Wuhan-Hu-1, Omicron), определени за плазма от изследвани субекти. Топлинното картографиране се извършва за всеки параметър поотделно с помощта на Excel. Най-високото ниво се смяташе за тъмночервено, а най-ниското беше бяло.
Фактът, че във всички с изключение на един субект (т.е. субект 22) вирус неутрализиращите антитела се увеличават след ваксинация, показва, че те са били индуцирани от ваксинация (Таблица 2). Субект 21 вече показа силно блокиране на взаимодействието RBD-ACE2 в MIA и висока вирусна неутрализация на изходно ниво (Таблица 2). Трябва да се отбележи, че плазмени проби от ваксинирани с Gam-COVID-Vac реконвалесцентни субекти, които са имали умерено заболяване (#1, 2, 17, 18, 21), имат по-високи титри на вирусна неутрализация от тези от реконвалесцентни субекти, които са имали леко заболяване (#22) или без симптоми (#4, 5, 7, 9) (Таблици 1 и 2). Ключово откритие обаче е, че инхибирането на свързването на RBD с ACE2 и неутрализирането на вируса не винаги са свързани. Повече от 25% инхибиране на свързването на RBD Wuhan Hu-1 с ACE2 се наблюдава само при 6 субекта, които също са показали инхибиране в теста за неутрализиране на вируса поради ваксинация (т.е. субекти 1, 2, 3, 17, 18 и 19) (Таблица 2). Интересно е, че вирус неутрализираща активност (50% инфекциозна доза (ID50) > 100) се наблюдава при 6 субекта, въпреки че те не показват никакво или слабо инхибиране на свързването на RBD с ACE2 (Таблица 2: Субекти 6, 10, 12, 13, 16, 20) .
2.5. Неутрализирането на вируса при субекти, ваксинирани с Gam-COVID-Vac, е силно свързано с IgG отговорите към RBD и към S-производния пептид 12
Както беше посочено по-горе, плазмата от няколко субекта, ваксинирани с Gam-COVID-Vac (напр. при субекти 6, 10, 12, 13, 16, 20; Таблица 2), показва неутрализираща вируса активност, но не инхибира взаимодействието RBD-ACE2. Затова анализирахме реактивността на IgG антитялото към пептидите, обхващащи S протеина, чрез анализ на чип, базиран на микроматрици [13] (Фигура S4 и Фигура 2C) и корелирахме пептид-специфични IgG отговори с вирусна неутрализация на Wuhan-Hu{{19} } щам и Omicron (Фигура 2D). IgG отговорите към три пептида (т.е. пептиди 12, 32, 46A) като IgG отговорите към сгънат RBD корелират значително с неутрализирането на щама Wuhan-Hu-1 (Фигура 2C, D). Пептид 12 се открояваше, тъй като отговорите на антитялото към разгънатия пептид 12 (Фигура S1), но не и към разгънатите пептиди 32 и 46A бяха значително подсилени от Gam-COVID Vac при нелекувани субекти (Фигура 3A) и също така значително корелираха с неутрализирането на Omicron (Фигура 2D ). Не е наблюдавано значително усилване при реконвалесцентни субекти на пептиди 12, 32 или 46А (Фигура 3А). Последователността на пептид 12 е силно запазена сред щамовете на SARS-CoV-2 (Фигура 4) и се намира в S1 близо до N-края на RBD и следователно обозначава регион, който може да бъде от значение за прехода на пре- към конформацията след сливане на S протеина (Фигура 3B).
Фигура 3. Средни нива на IgG антитела (y-оси: ISU) към S-получени пептиди (P12, P32, P46A) при ваксинирани нелекувани и реконвалесцентни субекти във времеви точки 0 и 3 (x-оси) (A) . Посочени са значителни разлики между групите, определени чрез теста на Wilcoxon: * p < 0.05, ns=не е значимо. (F) (B) Фигура 3. Средни нива на IgG антитела (у-оси: ISU) към S-получени пептиди (P12, P32, P46A) при ваксинирани нелекувани и реконвалесцентни субекти във времеви точки 0 и 3 (x -оси) (A). Посочени са значителни разлики между групите, определени чрез теста на Wilcoxon: * p <0,05, ns=не е значимо. (B) Визуализация на пептиди 12, 32 и 46A в повърхностното представяне на SARS-CoV-2 спайковия протеинов тример (страничен изглед, конформация преди сливане), генериран с PyMOL. Пептид 12 е подчертан в модела S-тример в червено, пептид 32 в синьо и 46А в оранжево. Въглехидратите са показани в светло сиво.
Фигура 4. Подравняване на протеинова последователност на Wuhan-Hu-1 (горе) и Omicron (долу) на SARS-CoV-2 S-протеин. RBD е оцветен в светло жълто и пептиди 12, 22, 25, 32, 33, 46A и 47 са подчертани. S-протеинова последователност на Wuhan съответства на WA1 изолат (номер на достъп в GeneBank: BCN86353.1), S-протеинова последователност на Omicron Omicron е клон GRA, линия B.1.1.529 BA.1 въз основа на базата данни на GISAID ( https://www.gisaid.org/ (достъп на 15 март 2022 г.)). Заместванията на аминокиселини са цветно кодирани според тяхната хидропатия и свойства на заряд (розово=хидрофобно, зелено=неутрално, светлосиньо=основно хидрофилно и светлочервено=киселинно хидрофилен).
3. Дискусия
Базираната на вектор ваксина Gam-COVID-Vac, наричана още Sputnik-V, беше една от първите ваксини срещу SARS-CoV-2, които станаха достъпни за използване в клиничната практика. Налична е обаче относително малко информация относно фините специфики на отговорите на антитела при лица, които са били ваксинирани с COVID-19. В това проучване извършихме подробен анализ на реакциите на антитела към микро-матрици нагънати и разгънати SARS-CoV-2 протеини и пептиди, обхващащи S протеина в плазмени проби от SARS CoV-2-наивни и реконвалесцентни субекти след пълен курс на имунизации с Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac индуцира главно IgG1, но не и други отговори от подклас IgG на сгънати S, S1, S2 и RBD по сравним начин при нелекувани и реконвалесцентни субекти, което показва, че може да се използва за усилване на SARS-CoV-2- специфични антитяло отговори също и при реконвалесцентни субекти. Подобно на други генетични ваксини, индуцираният от Gam-COVID-Vac отговор на антитела се намира главно в подклас IgG1, който има по-кратък полуживот в сравнение с отговор на подклас IgG4, който е по-устойчив. Например, специфичните отговори от подклас IgG4 са свързани с дългосрочна защита по време на алерген-специфична имунотерапия, докато специфичните отговори на IgG1 се изграждат бързо, но избледняват след няколко месеца [28–30]. Съответно ще са необходими чести бустерни инжекции на Gam-COVID-Vac и други генетични ваксини, за да се поддържа отговорът на неутрализиращите антитела на високо ниво. Ваксинирането с Gam-COVID-Vac предизвиква отговор на антитела, който имитира до голяма степен този, открит след естествена инфекция със SARS-CoV-2 [13]. В допълнение, отговорите на антитела след естествена инфекция принадлежат главно към подклас IgG1 и са насочени срещу сгънати S, S1, S2 и RBD [13]. Новата и интересна констатация на нашето проучване беше, че плазмата от няколко ваксинирани с Gam-COVID-Vac субекти (напр. при субекти 6, 10, 12, 13, 16, 20; Таблица 2) показва неутрализираща вируса активност, но не инхибира Взаимодействие RBD-ACE2. Затова анализирахме реактивността на IgG антитела към пептидите, обхващащи пълния S протеин чрез анализ на чипове, базиран на микроматрици [13] (Фигури 2D и S4) и корелирахме пептид-специфични IgG отговори с вирусна неутрализация на Wuhan-Hu{{62} } щам и Omicron BA.1 (Фигура 2D). IgG отговорите към три пептида (т.е. пептиди 12, 32, 46A) като IgG отговорите към RBD корелират значително с неутрализирането на щама Wuhan-Hu-1 (Фигура 2C, D). Въпреки това, пептид 12 е уникален, тъй като отговорите на антитялото само към пептид 12, но не и към пептиди 32 и 46A, са значително подсилени от ваксинацията (Фигура 3A) и също така значително корелират с неутрализирането на Omicron (Фигура 2D). Степента на индуцираното от ваксината усилване на IgG отговорите към пептид 12 е умерено, но значително при нелекувани субекти и доста сравнимо с усилването на IgG антитела, насочени към S и S1. Въпреки това, IgG антителата срещу изолирания разгънат пептид (Фигура S1) може да представляват само част от антителата, насочени срещу пептид 12 в нагънатия протеин. Освен това са важни не само нивата, но и авидността на антителата. Последователността от пептиди 12 е силно запазена сред щама Wuhan-Hu-1 и BA.1 Omicron VOC (Фигура 4) и е получена от регион, който може да бъде от значение за прехода на преди към след сливането конформация на S протеина (Фигура 3B). Освен това сравнението на нови мутантни варианти на Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1) показва, че пептид 12 (284–313 aa. ) остава непроменен по отношение на аминокиселинната последователност, за разлика например от пептид 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (достъпен на 28 ноември 2022 г.)). Трябва да се отбележи, че са описани моноклонални антитела с вирус-неутрализираща способност, насочени към областта на N-терминалния домен (NTD), част от която е пептид 12 [31], и се съобщава, че и други ваксини могат да индуцират отговор на антитела, насочен срещу тази област [18–20,32], което показва, че областта, дефинирана от пептид 12, може да бъде важна за индуциране на неутрализиращи антитела. Следователно може да се приеме, че антителата, индуцирани от Gam-COVID-Vac ваксинация, могат да неутрализират SARS-CoV-2 по два механизма, единият просто чрез инхибиране на взаимодействието RBD–ACE2 и друг чрез насочване към региона, съдържащ пептид 12 на S- протеин, който може да участва в структурни промени (т.е. преход на предварително слята в слята конформация на S). Нашето проучване има ограничения. Например, ние използвахме неутрализационен анализ, базиран на псевдотипизирани лентивируси, но тези анализи са широко използвани и надеждни [33]. Също така ограничение на нашето изследване е, че пептидите в нашия микроматриц са били разгънати и по този начин може да са идентифицирали само част от неутрализиращи антитела, които са разпознали разгънатите пептиди, докато още по-голяма част от антитела може да са били свързани с конформационни епитопи в идентифицираните регион. Освен това, ограничение на нашето изследване е, че анализирахме само малък брой субекти. Въпреки това, нашето проучване ясно показва, че антитела с различна епитопна специфичност могат да допринесат за защитния ефект на Gam COVID-Vac ваксинация. В допълнение, изследването показва отговор на потенциално запазен пептид, който може да се използва за създаване на широко неутрализиращи антитела.
Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система
4. Материали и методи
4.1. Проучване на населението и етична декларация
Здрави субекти с (n {{0}}) или без (n=12) предишни SARS-CoV-2 инфекции бяха включени в проучването през декември 2020 г. в Националния изследователски център Институт на Имунология на Федералната медико-биологична агенция на Русия (етичен номер: #12-1, 29 декември 2020 г.). Всички участници предоставиха писмено информирано съгласие. Предишна SARS-CoV-2 инфекция е потвърдена или от предишен положителен PCR тест и симптоми на COVID-19, или от наличието на SARS-CoV-2-специфични антитела, насочени към нуклеокапсиден антиген и/или RBD и/или S антиген, както е описано [13]. Всички субекти бяха имунизирани интрамускулно с две дози Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Москва, Русия) на интервал от три седмици. Кръвни проби са взети един ден преди първата ваксинация (T0, Фигура 1A) и 80 до 85 дни след първата ваксинация (T3, Фигура 1A).
4.2. Откриване на SARS-CoV-2-специфични реакции на антитела
Имуноглобулиновият отговор на нелекувани и реконвалесцентни пациенти с COVID{{0}} беше оценен в плазмени проби преди и след имунизация със Sputnik-V (Фигура 1А). Специфични IgG към изчерпателен панел от SARS-CoV-2 протеини и 46 пептида (25–30 mers), обхващащи S протеина, бяха измерени в 1:50 разредени плазмени проби чрез микрочипова технология, както преди описано [13]. Аминокиселинните последователности, броят на аминокиселините и молекулното тегло за всички синтетични пептиди на микрочипа са представени в таблица 3. За пептиди 12 и 32 и RBD, експресирани в Escherichia coli (E. coli) (разгъната) и в човешки ембрионален бъбрек 293 (HEK293) клетки (нагънати) са предоставени спектри на кръгов дихроизъм (CD) (Фигура S1). Пептиди 12 и 32 не разкриват специфична вторична структура, както е определено чрез кръгов дихроизъм (CD), както е показано на фигура S1. По-подробно, стъклени предметни стъкла, съдържащи микрочипове, заобиколени от епоксидна рамка (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Лауда-Кьонигсхофен, Германия) бяха активирани с реактивен с амини комплексен органичен полимер, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , САЩ), за да се улесни свързването на протеини и пептиди. SARS-CoV-2 антигени/пептиди бяха забелязани с помощта на концентрация от 0,5–1 mg/mL в (75 mM Na2HPO4, pH=8.4) в три екземпляра с помощта на SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Берлин, Германия) [13]. Експресията и пречистването на протеини и пептидния синтез са описани в [13]. Реактивността на IgG антитела към антигени с микрочипове се измерва чрез промиване първо на микрочиповете за 5 минути с буфериран с фосфат физиологичен разтвор с 0,5% Tween 20 (PBST) и изсушаването им чрез центрофугиране с помощта на центрофуга Sigma 2–7 и MTP-11113 ротор (и двете Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Германия). След това се добавят 35 µL аликвотни части от 1:50 разредени плазмени проби (разредител на пробата, Thermofisher, Waltham, MA, САЩ) и се инкубират в продължение на 2 часа при 22 ◦C. След друга стъпка на промиване, 30 µL вторични антитела (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, USA) белязани с анти-човешки IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)) бяха приложени и инкубирани за 30 минути при 22 ◦ C RT. След това чиповете бяха измити, изсушени и впоследствие сканирани с помощта на конфокален лазерен скенер (Tecan, Männedorf, Швейцария). Анализът на изображението беше извършен чрез софтуер за получаване и анализ на изображения с микрочипове MAPIX (Innopsys, Carbonne, Франция) и преобразуването на измерените флуоресцентни единици в стандартизирани единици ISAC (ISU) беше извършено, както е описано [13]. Нивата на специфични антитела се изразяват в стандартизирани единици ISAC (ISU). S и RBD-специфичните IgG1-4 антитела отговори бяха измерени в плазмени проби (1:50 разредени) в дубликати чрез ELISA, както е описано по-горе [13] с вариация на<5% for their average values.
Таблица 3. Синтетични SARS-CoV-2 шипови протеинови пептиди, получени от §.
4.3. Далечен UV кръгов дихроизъм (CD) спектри
За пептиди, P12 и P32, както и RBD, експресирани в Е. coli и HEK293 клетки, CD анализът беше извършен с помощта на Jasco J-180 спектрополяриметър (Japan Spectroscopic Co., Токио, Япония), описан по-рано [34]. CD спектри на пептиди и протеини (Фигура S1) бяха измерени при концентрация от 0.1 mg/mL в 10 mM NaH2PO4 (рН 8,0), който беше използван за забелязване на антигените.
4.4. Тест за неутрализиране на вируси на базата на псевдовирус (PVT)
Активността на неутрализирането на вируса в плазмени проби се определя чрез базиран на псевдовирус тест за неутрализация на вируса, както е описано по-горе [35]. За да се произведат вирусоподобни частици (VLPs) на SARS-CoV-2, клетките HEK293T бяха котрансфектирани с 3 плазмида: лентивирусен опаковъчен плазмид pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, UK), pUCHR-GFP и a pCAGGS-S∆19 плазмид, кодиращ шиповия протеин от див тип SARS-CoV-2 (идентичен с референтните Wuhan-Hu-1 и WA1 изолати) или pCAGGS-S∆19-Om плазмид кодиращ шиповия протеин SARS-CoV-2 Omicron (любезен подарък от Андрей Горчаков, Лаборатория по имуногенетика, Институт по молекулярна и клетъчна биология, Сибирски клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия). Преди употреба в pVNT, VLPs се титруват чрез ограничаващо разреждане и се инкубират в продължение на 4 дни с hACE2-трансфектирани HEK293T клетки. Доза от вирусни частици, която дава 50% зелен флуоресцентен протеин (GFP)-положителни клетки, беше избрана за използване в теста. За pVNT, всички плазмени проби бяха топлинно инактивирани за 30 минути при 56 ◦C преди употреба. На 4-ия ден клетките след инфекцията бяха повторно суспендирани и процентът на GFP-позитивните клетки беше измерен чрез поточна цитометрия. Стойностите на ID50 се изчисляват с помощта на сигмоидална крива (софтуер GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), реконструирана чрез процента на неутрализация при различните посочени плазмени концентрации.
4.5. Тест за молекулярно взаимодействие (MIA)
За откриване на капацитета на плазмени проби от COVID{{0}} реконвалесцентни или нелекувани субекти (Таблица 1), преди и след имунизация Sputnik-V, за инхибиране на свързването на 5{{0}} ng/mL от RBD-hu-1 към ACE2 рецепторен анализ на молекулярно взаимодействие (MIA) беше извършен, както е описано [13,36–39]. Този анализ може да измерва инхибирането на белязания RBD към ELISA плака ACE2 чрез антитела или инхибиране на друго съединение на взаимодействието RBD-ACE2 [38]. Накратко, рекомбинантен ACE-2 (GenScript, Piscataway, NJ, USA) се покрива (2 µg/mL) за една нощ върху NUNC Maxisorb 96-ямкови плаки (Thermofisher). След това бяха проведени три цикъла на промиване с промивен буфер и след това плаките бяха блокирани за 3 часа при стайна температура с блокиращ буфер. Серумните проби се разреждат 1:2 в PBS, 0.05% Tween 20, 1% BSA и се инкубират предварително в продължение на 2 часа с 50 ng His-маркиран рекомбинантен RBD (GenScript). След това предварително инкубираните серумни проби бяха добавени към плочите, съдържащи ACE-2 за 3 часа и плочите бяха промити и инкубирани за една нощ с 1:1000 разредено мише моноклонално анти-His tag антитяло (Dianova, Хамбург, Германия) . След 3 стъпки на промиване се добавя 1:1000 разредено HRP-свързано анти-мише IgG1 антитяло (GE Healthcare, Чикаго, Илинойс, САЩ) за 2 часа и откриването се извършва с ABTS. Стойностите на средната оптична плътност (OD), съответстващи на свързания RBD, бяха измерени при 405 nm и 492 nm (референтен) в четец TECAN Infinite F5 ELISA с интегриран софтуер i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Швейцария). Буферната контрола (наслагване без RBD) беше извадена от всеки резултат. Определянията са извършени в два екземпляра и резултатите са показани като средни стойности с вариация на<5%.
Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система
4.6. Визуализация на пептидите в структурата на Spike Protein
Повърхностното представяне на шиповия протеин на SARS-CoV-2 е генерирано в базирана на PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, версия 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) на PDB запис 6XR8.
4.7. Статистически анализ
Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism (версия 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). Тестът на Wilcoxon (фигури 1C, D и 3A), тестът на Mann-Whitney (фигури 2B и S3) и тестът на Friedman (фигура S2) бяха използвани за сравнение между две или множество групи. p < 0.05 се счита за статистически значимо. Корелацията между двете групи беше определена чрез теста за ранг на Spearman (Фигура 2D). Беше извършена нормализирана нелинейна регресия с помощта на софтуер GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Данните са представени като медиана ± IQR. Звездичките показват значителни разлики между групите, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—незначително.
5. Изводи
В обобщение, нашето изследване е първото, което изследва в дълбочина специфичността на епитопа и IgG подкласа на антитела, индуцирани от Gam-COVID-Vac, и разкрива различни механизми на индуцирана от Gam-COVID-Vac вирусна неутрализация от антитела. По-специално, получихме доказателства, че антитела, насочени към пептид (т.е. пептид 12), разположен близо до, но извън RBD в N-терминалната част на S1, са свързани с неутрализация на вируса. Потенциалната неутрализираща вируса активност на пептидните 12-специфични антитела може да се дължи на способността им да пречат на прехода на конформацията преди сливането към конформацията след сливането на шиповия протеин. Предлагаме обмисляне на включването на областта, дефинирана от пептид 12 в имуногенна форма във ваксини за индуциране на антитела срещу тази епитопна област и за тестване на антитела, индуцирани от такива ваксини за неутрализация на вируса. В случай, че вирусната неутрализация на ваксините може да бъде подобрена, включването на епитопи на имуногенен пептид 12 може да подобри ефикасността на ваксините срещу COVID-19. В допълнение, може да се обмисли разработването на антитела срещу пептидния 12-дефиниран епитоп за пасивна имунизация. Тъй като дефинираният от пептида 12-епитоп се запазва в известните понастоящем варианти на SARS-CoV-2, ваксините и антителата, насочени към пептид 12 май, защитават кръстосано срещу варианти на SARS-CoV-2. По този начин предоставяме нови знания, които могат да бъдат полезни за разработването на нови стратегии за активно и пасивно ваксиниране срещу COVID-19.
Препратки
1. Родригес-Койра, Дж.; Sokolowska, M. SARS-CoV-2 кандидат ваксини – Състав, механизми на действие и етапи на клинично развитие. Алергия 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]
2. Шарма, А.; Ахмад, FI; Лал, SK COVID-19: Преглед на еволюцията, предаването, откриването, контрола и превенцията на новата коронавирусна болест. Вируси 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]
3. Аршад, Б.; Икбал, Т.; Bhatti, KP Review-Insights in Off-Label терапевтични стратегии срещу лека и тежка COVID-19 инфекция. Пак. J. Pharm. Sci. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]
4. Заман, У.; Saqib, S.; Ула, Ф. КОВИД-19: Филогенетичните подходи могат да помогнат при намирането на ресурси за естествено лечение. Фитотер. Рез. 2020, 34, 2783–2785. [CrossRef]
5. Рубио-Касиляс, А.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 Прекъсната вирулентност като резултат от естествения подбор. COVID 2022, 2, 1089–1101. [CrossRef]
6. Логунов, Д.Ю.; Должикова, И.В.; Зубкова, О. В. Безопасност и имуногенност на rAd26 и rAd5 векторно базирана хетероложна първична усилваща ваксина срещу COVID-19 в две формулировки: Две открити, нерандомизирани проучвания фаза 1/2 от Русия. Lancet 2020, 396, 887–897, Корекция в Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]
7. Фолегати, PM; Ewer, KJ; Aley, PK Безопасност и имуногенност на ваксината ChAdOx1 nCoV-19 срещу SARS-CoV-2: предварителен доклад от фаза 1/2, единично-сляпо, рандомизирано контролирано изпитване. Lancet 2020, 396, 467–478, Корекция в Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]
8. Логунов, Д.Ю.; Должикова, И.В.; Shcheblyakov, DV Безопасност и ефикасност на rAd26 и rAd5 базирана на вектор хетероложна първична усилваща ваксина срещу COVID-19: междинен анализ на рандомизирано контролирано изпитване фаза 3 в Русия. Lancet 2021, 397, 671–681, Корекция в Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]
9. Джаксън, CB; Фарзан, М.; Чен, Б.; Choe, H. Механизми на навлизане на SARS-CoV-2 в клетките. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]
10. Хайнц, FX; Stiasny, K. Отличителни черти на настоящите ваксини срещу COVID-19: известни и неизвестни за представянето на антигена и начините на действие. NPJ ваксини 2021, 6, 104. [CrossRef]
11. Лим, HX; Masomian, M.; Халид, К.; Кумар, AU; MacAry, PA; Poh, CL Идентифициране на B-клетъчни епитопи за предизвикване на неутрализиращи антитела срещу SARS-CoV-2 Spike протеин чрез биоинформатика и насочване към моноклонални антитела. Вътр. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4341. [CrossRef]
12. Морой, Г.; Tuffery, P. Базирани на пептиди стратегии срещу SARS-CoV-2 атака: Актуализирана гледна точка In Silico. Преден. Лекарство. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]
13. Gattinger, P.; Niespodziana, K.; Stiasny, K. Неутрализирането на SARS-CoV-2 изисква антитела срещу епитопи на конформационния рецепторен свързващ домейн. Алергия 2022, 77, 230–242. [CrossRef]
14. Ниу, Л.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC Структурен ландшафт на неутрализиращи антитела срещу SARS-CoV-2 рецепторно свързващ домейн. Преден. Immunol. 2021, 12, 647934. [CrossRef]
15. Шан, С.; Mok, CK; Джан, С. Мощно и защитно човешко неутрализиращо антитяло срещу SARS-CoV-2 варианти. Преден. Immunol. 2021, 12, 766821. [CrossRef]
16. Баджпай, П.; Сингх, В.; Chandele, A. Широко неутрализиращи антитела срещу SARS-CoV-2 предоставят нови прозрения за неутрализирането на варианти и други човешки коронавируси. Преден. клетка. заразявам. Microbiol. 2022, 12, 928279. [CrossRef]
17. Вишвакарма, П.; Ядав, Н.; Rizvi, ZA Тежък остър респираторен синдром Coronavirus 2 Spike Protein базирани нови епитопи индуцират мощни имунни отговори in vivo и инхибират вирусната репликация in vitro. Преден. Immunol. 2021, 12, 613045. [CrossRef]
18. Гарет, ME; Galloway, JG; Wolf, C. Цялостно характеризиране на отговорите на антитялото към SARS-CoV-2 Spike протеин открива допълнителни индуцирани от ваксината епитопи извън тези за лека инфекция. eLife 2022, 11, e73490. [CrossRef]
19. Пенг, М.; Dou, X.; Zhang, X. Защитни антигенни епитопи, разкрити чрез имуносигнатури след три дози инактивирана SARS-CoV-2 ваксина. Преден. Immunol. 2022, 13, 938378. [CrossRef]
20. Полвере, И.; Parrella, A.; Zerillo, L. Разнообразие на хуморалния имунен отговор към различни ваксини срещу COVID-19: Последици за политиката за „Зелен пропуск“. Преден. Immunol. 2022, 13, 833085. [CrossRef]
21. Тухватулин, А.И.; Должикова, И.В.; Щебляков, Д. В. Отворено, нерандомизирано, фаза 1/2 проучване за безопасността, поносимостта и имуногенността на еднодозовата ваксина „Спутник Лайт“ за профилактика на коронавирусна инфекция при здрави възрастни. Lancet Reg. Здраве Eur. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]
22. Гонзалес, С.; Олшевицки, С.; Салазар, М. Ефективност на първия компонент на Gam-COVID-Vac (Sputnik V) за намаляване на потвърдените инфекции, хоспитализации и смъртност при SARS-CoV-2 при пациенти на възраст 60–79 години: ретроспективно кохортно проучване в Аржентина. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]
23. Гушчин, В.А.; Должикова, И.В.; Shchetinin, AM Неутрализираща активност на серуми от хора, ваксинирани със Sputnik V срещу проблемни варианти (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) и Московска ендемична SARS -CoV-2 варианти. Ваксини 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]
24. Воко, З.; Кис, З.; Surjan, G. Национална ефективност на пет ваксини срещу SARS-CoV-2 в Унгария – проучването HUN-VE. Clin. Microbiol. заразявам. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]
25. Jeewandara, C.; Фернандо, С.; Pushpakumara, PD Имунни отговори след първата доза от Sputnik V (Gam-COVID-Vac). Sci. Rep. 2022, 12, 1727. [CrossRef]
26. Икегейм, С.; Siddiquey, MNA; Hung, CT Неутрализираща активност на серуми от ваксина Sputnik V срещу SARS-CoV-2 варианти. Нац. Общ. 2021, 12, 4598. [CrossRef]
27. Гушчин, В.А.; Циганова, Е.В.; Ogarkova, DA Sputnik V защита от COVID-19 при хора, живеещи с ХИВ на антиретровирусна терапия. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]
28. Шамджи, MH; Валента, Р.; Jardetzky, T. Ролята на алерген-специфичните IgE, IgG и IgA при алергично заболяване. Алергия 2021, 76, 3627–3641. [CrossRef]
29. Eckl-Dorna, J.; Вебер, М.; Stanek, V. Две години лечение с рекомбинантна ваксина срещу алергия към тревен прашец BM32 предизвиква непрекъснато нарастващ алерген-специфичен IgG4 отговор. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [CrossRef]
30. Шамджи, MH; Kappen, JH; Akdis, M. Биомаркери за мониторинг на клиничната ефикасност на алергенната имунотерапия за алергичен риноконюнктивит и алергична астма: Документ за позицията на EAACI. Алергия 2017, 72, 1156–1173. [CrossRef]
31. Торторичи, MA; Белтрамело, М.; Lempp, FA Ултрамощните човешки антитела предпазват от предизвикателство SARS-CoV-2 чрез множество механизми. Наука 2020, 370, 950–957. [CrossRef]
32. Cia, G.; Пучи, Ф.; Рууман, М. Анализ на неутрализиращата активност на антитела, насочени към отворени или затворени SARS-CoV-2 спайкови протеинови конформации. Вътр. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2078. [CrossRef]
33. Менг, Б.; Датир, Р.; Choi, J. SARS-CoV-2 спайк N-терминален домейн модулира TMPRSS2-зависимото вирусно навлизане и фузогенност. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]
34. Resch, Y.; Weghofer, М.; Seiberler, S. Молекулярна характеристика на Der p 10: диагностичен маркер за широка сенсибилизация при алергия към домашен прах. Clin. Exp. Алергия 2011, 41, 1468–1477. [CrossRef]
35. Бязрова, М.; Юсубалиева, Г.; Спиридонова, А. Модел на циркулиращи SARS-CoV-2-специфични антитела, секретиращи и генериране на В-клетки на паметта при пациенти с остър COVID-19. Clin. Превод Immunol. 2021, 10, e1245. [CrossRef]
36. Gattinger, P.; Борочова, К.; Дорофеева, Ю. Антителата в серума на реконвалесцентни пациенти след лек COVID-19 не винаги предотвратяват свързването на вируса с рецептора. Алергия 2021, 76, 878–883. [CrossRef]
37. Gattinger, P.; Тулаева, И.; Борохова, К. Омикрон: Вариант на SARS-CoV-2, който предизвиква истинско безпокойство. Алергия 2022, 77, 1616–1620. [CrossRef]
38. Gattinger, P.; Охраданова-Репич, А.; Valenta, R. Значение, приложения и характеристики на анализи, измерващи SARS-CoV-2 неутрализиращи антитела. Вътр. J. Mol. Sci. 2023, 24, 5352. [CrossRef]
39. Gattinger, P.; Kratzer, B.; Тулаева, И.; Niespodziana, K.; Охраданова-Репич, А.; Гебецбергер, Л.; Борочова, К.; Garner-Spitzer, E.; Трапин, Д.; Хофер, Г.; et al. Ваксина, базирана на сгънат рецепторен свързващ домен-PreS слят протеин с потенциал да индуцира стерилизиращ имунитет към SARS-CoV-2 варианти. Алергия 2022, 77, 2431–2445. [CrossRef]
