Място на уязвимост при SARS-CoV-2 Спайк индуцира широко защитно антитяло срещу антигенно различни подварианти на Omicron

Бързата еволюция на вариантите Omicron на тежкия остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) подчерта необходимостта от идентифициране на антитела с широки неутрализиращи способности за информиране на бъдещи моноклонални терапии и стратегии за ваксиниране. Тук идентифицирахме S728-1157, широко неутрализиращо антитяло (bnAb), насочено към рецептор-свързващото място (RBS), което е получено от индивид, преди това заразен с WT SARS-CoV-2 преди разпространението на тревожни варианти (ЛОС). S728-1157 демонстрира широка кръстосана неутрализация на всички доминиращи варианти, включително D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu и Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Освен това, S728-1157 защитава хамстери срещу in vivo предизвикателства с WT, Delta и BA.1 вируси. Структурният анализ показа, че това антитяло е насочено към епитоп от клас 1/RBS-A в рецепторния свързващ домен чрез множество хидрофобни и полярни взаимодействия с неговия регион 3, определящ комплементарността на тежката верига (CDR-H3), в допълнение към общите мотиви в CDR-H1/ CDR-H2 от клас 1/RBS-A антитела. Важно е, че този епитоп е по-лесно достъпен в отворено и предварително слято състояние, или в хексапролин (6P)-стабилизирани шипове конструкции, в сравнение с дипролин (2P) конструкции. Като цяло, S728-1157 демонстрира широк терапевтичен потенциал и може да предостави информация за целенасочени дизайни на ваксини срещу бъдещи варианти на SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Въведение

От началото на пандемията през декември 2019 г. вирусът на тежкия остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) доведе до над 660 милиона случая на коронавирусна болест 2019 (COVID-19) и над 6,5 милиони смъртни случаи в световен мащаб. Въпреки че бързото разработване и разпространение на ваксини и терапевтици ограничи ефекта на COVID-19 до голяма степен, появата на циркулиращи опасни варианти (ЛОС) продължава да представлява основна заплаха поради потенциала за по-нататъшно избягване на имунитета и повишена патогенност. Вариантът D614G беше най-ранният вариант, който се появи и стана универсално разпространен след това. В сравнение с WT, вариантът D614G показва повишена трансмисивност, а не повишена патогенност и следователно е малко вероятно да намали ефикасността на ваксините при клинични изпитвания (1). Между появата на D614G до октомври 2021 г. в световен мащаб се развиха 4 допълнителни значителни ЛОС, включително Алфа, Бета, Гама и Делта. Сред тези варианти Delta се превърна в сериозна глобална заплаха поради своята трансмисивност, повишена тежест на заболяването и частично избягване на имунитета, както се вижда от намалената способност на поликлоналния серум и mAbs да неутрализират този щам (2-6). Малко след това, през ноември 2021 г., вариантът Omicron беше идентифициран и обявен като нов VOC. Този вариант притежава най-голям брой мутации до момента и изглежда се разпространява по-бързо от предишните щамове (7, 8). Понастоящем има широка гама от подлинии на Omicron, водещи до нови случаи на COVID-19, като BQ.1, BQ.1.1 и XBB.1.5 стават доминиращи над BA.5 и отчитат повечето нови случаи в света към момента на писане. Вариантите на Omicron могат да избегнат разпознаването от имунитета, свързан с ваксината срещу COVID-19, в различна степен, като по този начин значително намаляват неутрализиращата сила на серумните антитела от реконвалесцентни, напълно ваксинирани с иРНК индивиди и индивиди, подсилени с новия двувалентен WT/BA.5 иРНК ваксина (9, 10). По подобен начин, вариантите на Omicron успяха да избегнат свързването на няколко терапевтични моноклонални антитела с разрешение за спешна употреба (EUA), въпреки че преди това беше доказано, че са ефективни срещу по-ранни ЛОС (10–12). Поради намалената неутрализация срещу Omicron и продължаващата заплаха от бъдещи летливи органични съединения, има спешна нужда да се идентифицират широки и мощни неутрализиращи антитела, които могат да предпазват от различни, развиващи се SARS-CoV-2 линии. В това проучване ние идентифицирахме мощно рецепторно-свързващ домен-реактивен (RBD-реактивен) mAb от периферната кръв на SARS-CoV-2-реконвалесцентен индивид, който ефективно неутрализира Алфа, Бета, Капа, Делта, Mu, и варианти на Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 и XBB). Това mAb, S728-1157, значително намалява BA.1 Omicron, Delta и WT вирусните натоварвания в белите дробове и назалната лигавица след in vivo заразяване с хамстери. S728-1157 свързва рецепторното свързващо място (RBS), което е напълно изложено, когато RBD на шипа е в конформация нагоре. mAb използва мотиви, открити в CDR-H1 и CDR-H2, които са общи за IGHV3-53/3-66 антитела клас 1/RBS-A (13, 14), но също и чрез широки уникални контакти с CDR -H3 за заобикаляне на мутации в пиковете на ЛОС. Това предполага, че рационалният дизайн на бъдещите усилвания на ваксината, покриващи вариантите на Omicron, трябва да бъде модифициран, за да представи стабилизиран пик в конфигурацията предимно нагоре, за да индуцира оптимално клас 1/RBS-A mAbs, които имат подобни характеристики на CDR-H3.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

Резултати

Изолиране на RBD-реактивни mAbs, които показват различни модели на неутрализация и ефикасност. Преди разпространението на линиите на Omicron, преди това характеризирахме 43 mAbs, насочени към различни епитопи на шиповия протеин, включително N-крайния домен (NTD), RBD и субединица 2 (S2). Нито едно от тези антитела не успя да неутрализира циркулиращите по това време варианти на SARS-CoV-2 (15). В това проучване допълнителен панел от RBD-реактивни mAbs бяха експресирани от 3 индивида с висок отговор, които монтираха стабилни анти-пикови IgG отговори, както е дефинирано по-рано (16) (допълнителни таблици 1 и 3; допълнителен материал, достъпен онлайн с тази статия; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Въпреки че пропорцията на шипове на RBD-свързващи В-клетки е сходна при високо реагиращите в сравнение със средно и слабо реагиращите (Фигура 1, A–C), нивата на соматична хипермутация на тежката верига са значително по-високи в групата с висок отговор (Фигура 1 , D и E), което предполага, че тези индивиди може да имат най-висок потенциал за генериране на мощни кръстосано реактивни mAbs (16). Тези антитела бяха допълнително изследвани срещу RBD мутанти, за да се идентифицират техните епитопни класификации (17). Сред 14 RBD-реактивни моноклонални антитела, ние идентифицирахме 4 клас 2 моноклонални антитела, 2 клас 3 моноклонални антитела и 8 некласифицирани моноклонални антитела, които показват малко или никакво намаление на свързването срещу всички тествани ключови RBD мутанти (Фигура 1F). Трябва да се отбележи, че антителата от клас 2, клас 3 и клас 4 приблизително съответстват на RBS BD, S309 и CR3022 епитопите, дефинирани в предишни проучвания (13, 18). Клас 2 и 3 RBD mAbs не разпознават мултивариантен RBD мутант, съдържащ K417N/E484K/L452R/N501Y замествания, изкуствено проектиран RBD, за да включва ключови мутации за избягване на вируса (17, 18), нито демонстрират някаква кръстосана реактивност към RBD на SARS-CoV-1 и близкоизточния респираторен синдром (MERS)-CoV (Фигура 1F). Функционално, клас 2 и 3 RBD mAbs мощно неутрализират D614G и Delta варианти, но неутрализиращата активност е по-ограничена срещу Beta, Kappa и Mu (Фигура 1G). Нито едно от анализираните антитела от клас 2 или 3 не неутрализира нито един тестван вариант на Omicron.

Обратно, по-голямата част от некласифицираните моноклонални антитела се свързват с мултиварианта на RBD и реагират кръстосано на SARS-CoV-1 RBD (Фигура 1F). Сред тях идентифицирахме 3 mAbs, S451-1140, S626-161 и S728-1157, които показаха висока неутрализираща активност срещу D614G и кръстосано неутрализирани бета, делта, капа, Mu и Omicron BA.1 с 99% инхибираща концентрация (IC99) в диапазона 20–2500 ng/mL (Фигура 1G). Като се има предвид широката неутрализираща ефикасност на тези 3 mAbs, в допълнение към платформата за анализ на плака, ние също извършихме неутрализационната активност срещу автентични BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 и XBB вируси, използващи неутрализационен тест за намаляване на фокуса (FRNT) (Фигура 1G). От тях S728-1157 показва висока неутрализираща активност срещу панела от варианти на Omicron, включително BA.1, BA.2, BA.4 и BA.5, с IC99 до 100 ng/mL, измерено чрез тест за плака. Подобен сценарий се наблюдава при използване на FRNT, където S728-1157 поддържа високата си неутрализираща активност срещу BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 и XBB с IC50 в диапазона от 8–300 ng /mL (Фигура 1G). S451-1140 неутрализира BA.1, BA.2, BA.2.75 и BL.1 силно, но не и BA.4 и BA.5, както се наблюдава и в двете платформи за анализ на неутрализация. От друга страна, S626-161 не демонстрира неутрализираща активност срещу варианти на Omicron извън варианта BA.1 (Фигура 1G). Въпреки че S626-161 има по-ниска неутрализираща активност срещу тестваните ЛОС в сравнение с другите 2 антитела, това е единственото mAb, което показва кръстосана реактивност не само към SARS CoV-1 RBD, но също така е в състояние да неутрализира прилеп коронавируси WIV-1 и RsSHC014 (Фигура 1, F и G). Тези данни предполагат, че S626-161 разпознава запазен епитоп, който се споделя между тези арбовирусни линии, но липсва в BA.2 и по-късните щамове. Освен това, в сравнение със S728-1157 и S451-1140, S626-161 има по-дълъг CDR-H3, който би могъл да осигури подобрена способност за разпознаване на силно запазен пластир от остатъци, споделяни между арбовирусите, както е описано в предишно проучване (19) (допълнителна фигура 1). При сравняване на вариабилни гени на имуноглобулинова тежка (IGHV) и лека верига (IGLV или IGKV) на тези 3 mAbs с наличната база данни за неутрализиращи mAbs на SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27), открихме, че тежката верига променливи гени, използвани от S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) и S626-161 (IGHV4-39) имат по-рано беше съобщено, че кодира няколко мощно неутрализиращи SARS-CoV-2 антитела, насочени към RBD (21, 22, 28, 29). Въпреки това, само S 728-1157 има уникални променливи генни двойки на тежка и лека верига, които не са докладвани в базата данни (допълнителна таблица 3), което показва, че това не е публичен клонотип.

Фигура 1. Характеризиране на RBD-реактивни mAbs, изолирани от COVID-19-реконвалесцентни индивиди

Тези 3 mAbs (S451-1140, S626-161 и S728-1157) бяха характеризирани допълнително, за да се определи тяхната ширина на свързване срещу SARSCoV-2 VOCs (Фигура 2, A и B) . Доказано е, че префузионно стабилизираният пик, съдържащ 2-пролинови замествания в субединицата S2 (2P; дипролин), е по-добър имуноген в сравнение с WT пика и е в основата на няколко текущи SARS-CoV-2 ваксини, включително ваксини на базата на иРНК (30, 31). Съвсем наскоро беше съобщено, че шиповият протеин, стабилизиран с 6 пролини (6P; хексапролин), повишава експресията и е дори по-стабилен от оригиналната дипролинова конструкция; в резултат на това беше предложено за използване в следващото поколение ваксини срещу COVID-19 (32, 33). За да се определи дали има разлики в антигенността между шиповите конструкции на дипролин и хексапролин, и двата имуногена бяха включени в нашия тестов панел. Както е измерено чрез ELISA, ние открихме, че 3 mAbs свързват 6P-WT шиповия антиген в по-голяма степен в сравнение с WT-2P пика (Фигура 2, A и B). Всичките 3 mAbs показаха сравнимо свързване с пиковете на Алфа, Бета, Гама и Делта вируси по отношение на това на WT-2P (Фигура 2, A и B). Въпреки това, реактивността на свързване на тези 3 mAbs беше значително намалена спрямо панел от антигени от семейството на Omicron (Фигура 2, B и C). S{31}} свързването е чувствително към мутациите, открити в BA.1 и BA.2, което води до голямо намаляване на свързването и 31-кратно намаляване на неутрализацията срещу тези варианти в сравнение с WT-2 P антиген и D614G вирус, съответно (Фигура 2B). Кръстосано неутрализиращото сарбековирус моноклонално антитело, S626-161, също показа 1.2- до 3.5-кратно намалено свързване към пиков BA.1 антиген, което може да е причина за {{45} }кратно намаляване на неутрализационната активност срещу BA.1 (Фигура 1G и Фигура 2, B и C). За най-мощното широко неутрализиращо антитяло (bnAb), S728-1157, свързването с антигените на Omicron е намалено в по-малка степен (вариращо от 1.1- до 4.4-кратно) в сравнение с WT-2P пик и не се повлиява при неутрализиращата активност (Фигура 1G и Фигура 2, B и C). Значителното намаляване на свързването на Omicron-неутрализиращото mAb към шипа на BA.1 може да се дължи на промени в неговата мобилност и свързано с плътното опаковане на структурите на Omicron 3-RBD-down и предпочитанието за 1- нагоре RBD, които помагат за избягване на антитела, както се съобщава от предишно проучване (34). Стабилизиращите мутации 2P и 6P също имат различни ефекти във вариантите на Omicron, където всичките 3 mAbs показаха над 2.8-кратно повишено свързване с шип BA.1-6P в сравнение с BA.1-2P версия, но само незначително повишено свързване към пиковите BA.2 и BA.4/5 6P версии в сравнение с техните 2P версии с 1,2 × до 1,4 ×, което предполага малко по-добра достъпност на Omicron-неутрализиращи mAbs до хексаполните версии, особено за шипа BA.1 конструкт. В допълнение към ELISA, интерферометрията на биослоя (BLI) беше използвана за количествено определяне на скоростта на свързване и равновесните константи (kon, koff и KD) на тези 3 mAbs към панел от спайк антигени (допълнителна фигура 2). Скоростите на разпознаване на антигенното свързване на фрагмента (Fab) към хексапролиновите шипове бяха 1.5- до 3.3-кратно по-бързи в сравнение с дипролиновите шипове (допълнителна фигура 2, B и C), показвайки, че антителата се свързват с 6P конструкта по-бързо, отколкото с 2P конструкта. Това можеше да се очаква, ако епитопите бяха по-достъпни на RBD в отворено състояние на хексапролиновия шип. С изключение на S626- 161, Fabs се дисоциират от пика на хексапролина по-бавно (имат по-нисък koff) от пика на дипролина, така че общият KD показва, че S728-1157 и S451-1140 се свързват с хексапролиновият пик с по-голям афинитет (допълнителна фигура 2, B и C). Увеличаването на свързването с пика на хексапролина беше още по-забележимо за интактния IgG чрез модела на взаимодействие 1:2, както е показано от S728-1157 и S451- 1140 mAbs, в съответствие с експозицията на множество епитопи с 6P стабилизация, позволяваща подобрен авидитет (допълнителна фигура 2, A и C). Взети заедно, тези резултати предполагат, че насочените епитопи могат да бъдат сравнително по-достъпни при 6P-стабилизиран шип, когато RBD е в отворено състояние. След това бяха извършени структурни анализи, за да се провери това предположение.

Фигура 2. Широчина на свързване на Omicron-неутрализиращи mAbs

Структурен анализ на широко неутрализиращи mAbs. Като първо приближение на свързаните епитопи беше използван конкурентен анализ ELISA, за да се определи дали тези 3 широко неутрализиращи моноклонални антитела имат някакво припокриване с нашия настоящ панел от моноклонални антитела, колекция от моноклонални антитела с известна епитопна специфичност от предишни проучвания (15, 25, 35) и 2 други mAbs, които понастоящем се използват в клинична практика, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) и REGN10933 (Regeneron) (37). Местата на свързване на S451-1140 и S728-1157 частично се припокриват с CC12.3 (23, 25), неутрализиращо антитяло от клас 1 и повечето антитела от клас 2, включително LY-CoV555 и REGN10933, но не с антитела от клас 3 и клас 4 (Фигура 3A). S626-161 споделя забележимо припокриване в областта на свързване с клас 1 CC12.3, няколко антитела от клас 4, включително CR3022 и други некласифицирани антитела, докато има известно частично припокриване с няколко антитела от клас 2 и едно антитела от клас 3 (Фигура 3А). Аналогично, конкурентен BLI анализ разкрива, че S451-1140 и S728-1157 силно се конкурират помежду си за свързване към пика WT-6P, докато S626-161 не (допълнителна фигура 3). Като цяло тези данни предполагат, че S451-1140 и S728-1157 разпознават подобни епитопи, които са различни от S626-161.

Фигура 3. Механизъм на широка неутрализация на S728-1157

Антитялото S728-1157 беше кодирано от IGHV3-66 и притежаваше къс определящ комплементарността регион 3 (CDR-H3). По-специално, mAbs, които свързват RBS в режим на свързване 1 (т.е. RBS-A или място от клас 1), типизирано от CC12.1, CC12.3, B38 и C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), са склонни да използват IGHV3-53 или 3-66 и са чувствителни към VOC мутации (40). Въпреки това, CDR-H3 регионът на S728-1157 е силно различен от други антитела от този клас, което потенциално отчита неговата по-широка активност. За да разберем структурната основа на широката неутрализация от S728-1157 при този епитоп, ние разрешихме криоелектронна микроскопия (крио-ЕМ) структура (Фигура 3B) на IgG S728-1157 в комплекс с шип WT{ {31}}P-Mut7, версия на шип WT-6P, притежаваща интерпротомерна дисулфидна връзка при C705 и C883, при приблизително 3,3 Å глобална резолюция (допълнителна фигура 4E). Използвайки разширяване на симетрията, фокусирана класификация и методи за усъвършенстване, постигнахме локална разделителна способност на интерфейса RBD-Fv до приблизително 4 Å (допълнителна фигура 4E и допълнителна таблица 8). Кристална структура на S728-1157 Fab беше определена при разделителна способност 3,1 Å и използвана за изграждане на атомния модел в интерфейса RBD-Fv. Нашите структури потвърждават, че S728-1157 свързва епитопа на RBS-A (или клас 1) в конформацията RBD-up (Фигура 3B и допълнителна фигура 4E), подобно на други IGHV3-53/{{55} } антитела (Фигура 3C). Стеричното блокиране на мястото на свързване на ангиотензин-конвертиращия ензим 2 (ACE2) от S728-1157 обяснява неговата висока неутрализираща ефективност срещу SARS-CoV-2. Мотивът 32NY33 и мотивът 53SGGS56 (23) в S728-1157 CDR-H1 и -H2 взаимодействат с RBD почти по същия начин като CC12.3 (допълнителна фигура 4, B и C). Въпреки това, в сравнение с VH 98DF99 в CC12.3, VH 98DY99 в S728-1157 CDR-H3 образува по-обширни взаимодействия, включително както хидрофобни, така и полярни взаимодействия, с RBD, което може да обясни широката неутрализация срещу ЛОС (Фигура 3D и допълнителни таблици 6 и 7). Диглицинът VH 100GG101 в S728- 1157 CDR-H3 може също така да улесни по-широкото свързване в сравнение с VH Y100 в CC12.3, вероятно поради гъвкавостта на глициновите остатъци, които водят до различна конформация на върха на CDR -H3 цикъл и относително изместване на остатъците при 98DY99.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Въпреки че Omicron VOCs имат обширни мутации в RBD, повечето от тези остатъци не взаимодействат със S728-1157, тъй като все още се наблюдава свързване (допълнителна фигура 4A). От нашия шип WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 модел се предвижда, че Y505 до VL Q31 и E484 до VH Y99 създават водородни връзки (допълнителна фигура 4D и допълнителна таблица 6 ), които имат потенциала да бъдат нарушени от мутациите на Omicron Y505H и E484A. Въпреки това, Y505H мутация все още би позволила водородна връзка с VL Q31, а E484A мутация би добавила друга хидрофобна странична верига близо до хидрофобни остатъци VL Y99, F456 и Y489. Тези контакти могат да обяснят отчасти механизма, който позволява на S728-1157 да запази неутрализираща активност, макар и намалена, срещу пика BA.1 антиген (Фигура 1G и Фигура 2B). Антигенът BA.1, от своя страна, вероятно е свързан с мутациите на Omicron, променящи конформационния пейзаж на шиповия протеин (34). Въпреки това, няколко соматично мутирали остатъка, т.е. VH L27, L28, R31, F58 и VL V28 и Q31, в S728-1157 участват във взаимодействието със SARS-CoV-2 RBD (допълнителна фигура 1 и Допълнителна таблица 7), което може също да допринесе за неговата широка реактивност в сравнение с CC12.3. Като цяло, нашите структурни проучвания разкриха основата за широка неутрализация на S728-1157, която може да побере повечето мутации в SARS-CoV-2 ЛОС.

Фигура 4. Защитна ефикасност на bnAbs срещу SARS-CoV-2 инфекция при хамстери.

S728-1157 намалява репликацията на SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta и WT SARS-CoV-2 при сирийски хамстери. За да оценим защитната ефикасност на нашите широко неутрализиращи моноклонални антитела, ние използвахме златен модел на инфекция от сирийски хамстер, който е широко използван за SARS-CoV-2. Хамстерите получиха 5 mg/kg от нашите тестови моноклонални антитела или изотипна контрола, насочена към неподходящ антиген (гликопротеин на еболавирус) чрез интраперитонеална инжекция 1 ден след заразяване с вируси SARS CoV-2. Белодробни и назални тъкани се събират 4 дни след инфекцията (Фигура 4А). Терапевтичното приложение на S728-1157 доведе до намалени титри на WT, BA.1 Omicron и Delta варианти както в носните раковини, така и в белите дробове на заразени хамстери (Фигура 4, B–D). Интересното е, че ефектът на S728-1157 в белите дробове беше драматичен, намалявайки вирусните натоварвания на WT и BA.1 Omicron с приблизително 104PFU, като вирусните титри на варианта BA.1 Omicron бяха напълно премахнати (Фигура 4C). За разлика от in vitro неутрализацията (Фигура 1G), S451-1140 не намалява репликацията на вируса BA.1 Omicron в белите дробове и носните раковини, което показва липса на връзка между in vitro неутрализацията и in vivo защитата за този клонинг (Фигура 4E) . За сравнение, прилагането на S626-161 води до незначително значими намаления на белодробните вирусни титри след предизвикване на WT и BA.1 (Фигура 4, F и G). Тези данни подчертават, че за прецизно дефиниране на широко защитни mAbs е необходима оценка на ефикасността на защитата успоредно с неутрализационната активност. Продължавайки напред, ще бъде интересно да се проучи до каква степен защитният капацитет на S728-1157 е Fc-зависим. Като цяло, S728-1157 представлява обещаващо mAb с широка ефикасност на неутрализация срещу SARS CoV-2 варианти, които са в състояние драстично да намалят репликацията на WT, Delta и BA.1 in vivo.

Инфекцията със SARS-CoV-2 рядко предизвиква мощни S728-1157-подобни кръстосано неутрализиращи mAbs. Предвид кръстосаната неутрализация и профилактичния потенциал на S728-1157, ние се опитахме да оценим дали антитела, подобни на S728–1157, често се индуцират сред поликлоналните отговори при пациенти със SARS-CoV-2. За да оценим това, извършихме конкурентни ELISA, използвайки реконвалесцентен серум за откриване на титри на анти-RBD антитела, които биха могли да се конкурират за свързване със S728-1157 (Фигура 5А). Субектите бяха разделени на 3 групи въз основа на степента на отговорите на антитялото, както е дефинирано по-рано (15, 16). Въпреки че пациентите с висок и умерен отговор имат по-високи титри на S728-1157-конкурентни серумни антитела в сравнение с пациентите с нисък отговор (Фигура 5B), титрите са доста ниски във всички групи, което предполага, че е необичайно да се придобият високи нива на S{{ 18}}–подобни антитела в поликлонален серум след инфекция с WT SARS-CoV-2. В допълнение към S728-1157, тествахме конкуренцията на реконвалесцентния серум с други mAbs, включително S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 и CC12.3. Подобно на S728-1157, наблюдавахме относително ниски титри на антитела, конкуриращи се с S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 и CC12.3 в поликлонален серум от повечето реконвалесцентни индивиди (Фигура 5, C–F и H). Независимо от това, пациентите с висок отговор са склонни да имат значително по-високи титри спрямо неутрализиращите моноклонални антитела, отколкото пациентите с нисък отговор (Фигура 5, B–F и H). Обратно, антителата, насочени към мястото на епитопа CR3022, са по-изразени при реконвалесцентни индивиди, което предполага обогатяване на клас 4 RBD антитела в поликлонален серум (Фигура 5G). Трябва да се отбележи, че няма значителна разлика в титрите на CR3022 в 3-те групи с отговор, което предполага, че антителата на мястото на CR3022- са постоянно индуцирани по време на инфекция с WT SARS-CoV-2 при повечето индивиди. Интересното е, че в сравнение с CC12.3, S728-1157 е открит при 4-кратно по-ниски нива в серума на хора с висок отговор. По този начин, въпреки че антителата от клас 1 често се индуцират от естествена инфекция и ваксинация (14, 20, 28, 29, 41–43), нашите данни предполагат, че антитела, подобни на S728–1157, които представляват подгрупа от този клас, са сравнително редки.

Освен това, ние изследвахме разликата в реактивността към 2P срещу 6P-стабилизиран пик в нашите реконвалесцентни кохортни серуми (Фигура 5, I–K). Ние открихме, че всички 3 групи отговорили са монтирали анти-спайк реактивни антитела срещу 6P-стабилизиран шип WT в по-голяма степен отколкото 2P-стабилизиран шип WT, с коефициент от 6 до 11 пъти (Фигура 5J), което показва, че основните антигенни епитопи са по-добре проявени или стабилизирани върху 6Р-стабилизиран антиген. Използвайки едни и същи проби, пациентите с висок и умерен отговор също имат по-ниски титри на анти-спайк антитела срещу BA.1-2P отколкото BA.1-6P, с 4–5 пъти (Фигура 5K). Трябва да се отбележи, че пациентите с нисък отговор имат по-малка кратна промяна в реактивността на свързване срещу пик BA.1 Omicron-2P и 6P (2-кратно намаляване) в сравнение с WT-2P и 6P пик ({ {28}}кратно намаляване) (Фигура 5, J и K), което предполага, че серумното антитяло срещу BA.1 Omicron-реактивни епитопи може да бъде по-ограничено при субекти с слаб отговор. Като цяло, тези данни предполагат, че има подобрено поликлонално свързване, предизвикано от естествена инфекция към 6P-стабилизиран пик, както за WT, така и за Omicron вируси.

Антитела, подобни на S728–1157, се индуцират оптимално в контекста на хибриден имунитет. Първичната инфекция със SARS-CoV-2 без ваксинация е станала рядкост в настоящата глобална обстановка и няколко проучвания съобщават, че имунитетът срещу SARS-CoV-2 е различен при индивидите със специфична история на ваксинация/инфекция. В резултат на това след това се опитахме да проучим кои обичайни експозиции, освен инфекцията с WT само с предшестващ SARS-CoV-2, биха индуцирали ефективно антитела, подобни на S728–1157, в плазмата от моновалентни ваксини на базата на иРНК със или без предварителна инфекция. Получихме необходимия биообразец от кохортата на проучването Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (ПАРИЖ), която проследява здравните работници надлъжно от началото на пандемията (44). Избрахме плазмени проби от напълно имунизирани (2 × ваксинирани) участници в проучването със и без инфекция, както и от подсилени участници (3 × ваксинирани) със и без инфекция. В допълнение, ние също така включихме проби от участници в проучването, които са получили двувалентна иРНК ваксина (предшественик WA1/2020 плюс Omicron BA.5) (Фигура 6A и Допълнителна таблица 2). Пробивните инфекции при участниците, които са получили бустерни ваксинации, са настъпили в момент, когато линиите на Omicron са изместили всички други линии на SARS-CoV-2 в столичния район на Ню Йорк. Установихме, че двойно ваксинираните индивиди имат най-ниските титри на S728-1157 конкурентни серумни антитела сред 5-те групи тествани проби (Фигура 6B). Трябва да се отбележи, че тези нива са подобни на тези, наблюдавани за нашата реконвалесцентна неваксинирана кохорта (всички отговорили; Фигура 5B). За сравнение, индивиди с анамнеза за естествена инфекция, включително реконвалесцентни индивиди с 2 от 3 дози ваксина, и индивиди, които са преживели пробивна инфекция и са получили двувалентен бустер, показват значително по-високи нива на предизвикване на S728-1157 в сравнение с неинфектираните но ваксинирани лица (Фигура 6B). Въпреки че групата с неинфектирана 3-доза показва само незначително увеличение в сравнение с групата с 2-доза, разпределението по двойки по тип ваксина показва, че хомоложните трети дози от BNT162b2 и mRNA-1273 значително повишават S{{ 38}}като титри на неутрализиращи антитела съответно с 2,72 × и 2,85 × (Фигура 6, C и D). Трябва да се отбележи, че сред участниците с общо 3 контакта с пик по какъвто и да е начин, титрите на антитела, подобни на S728-1157-, са били 3 пъти по-високи при реконвалесцентни двойни ваксинирани в сравнение с нелекувани от инфекция тройни ваксини, което предполага, че SARS-CoV{{ 51}} инфекцията по-оптимално индуцира този клонотип. Сред групите с хибриден имунитет отбелязахме, че по-голямата част от подсилените индивиди с пробив, които са получили доза двувалентна бустер ваксина, имат само незначително по-висок титър на S728-1157 антитяло в сравнение с реконвалесцентно ваксинираните групи преди омикрон, което предполага, че S{{53 }} титърът вероятно се доближаваше до плато след 3 експозиции. Ние също така изследвахме титрите на поликлоналните антитела, които се конкурираха с CC12.3 и CR3022 в допълнение към S728-1157. Всички индивиди показват относително високи титри на CC12.3- и CR3022-подобни антитела, независимо от броя и вида на експозициите (допълнителна фигура 5), противно на това, което наблюдавахме за S728-1157- като антитела. Като цяло тези данни показват, че SARS-CoV-2 инфекцията и иРНК ваксинацията допринасят за индуцирането на S728-1157-подобни антитела, като инфекцията играе по-доминираща роля при ваксинираните индивиди.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

И накрая, при сравняване на отговорите срещу 2P- срещу 6P-стабилизиран пик в кохортата на иРНК-ваксинация, ние открихме, че повечето групи предизвикват подобни нива на антитела срещу двата конструкта. Изключение от това беше неинфектираната тройно ваксинирана група, която демонстрира статистически по-висока, макар и само леко повишена, реактивност към 2P в сравнение с 6P-стабилизирания скок (Фигура 6E). Тези данни предполагат, че за разлика от естествената инфекция (Фигура 5, J и K), ваксинацията сама по себе си води до поликлонален отговор, който е по-ограничен до епитопи в конструкцията Spike-2P, в съответствие със Spike{{12 }}P формулировка на настоящите ваксини. В крайна сметка тези констатации подкрепят идеята, че 6P-стабилизирането на бъдещи ваксини срещу SARS-CoV-2 може да бъде от голяма полза при индуцирането на широко защитни клонотипове на антитела като S728-1157.

Фигура 5. Конкуренция на реконвалесцентни серумни антитела с широко неутрализиращи RBD-реактивни mAbs и сравнение на отговора на серумните антитела срещу 6P- срещу 2P-стабилизирани пикове

Фигура 6. Конкуренция на mRNA-ваксинирано серумно антитяло с S728-1157 неутрализиращи RBD-реактивни mAbs и сравнение на отговора на серумното антитяло срещу 6P- срещу 2P-стабилизирани пикове.

Дискусия

В това проучване ние идентифицираме мощно bnAb, изолирано от В-клетка на паметта на индивид, който се е възстановил от SARS-CoV-2 инфекция по време на първоначалната вълна на пандемията от COVID-19. Това bnAb, S728- 1157, поддържаше значителна реактивност на свързване и имаше постоянна неутрализираща активност срещу всички тествани SARS-CoV-2 VOC, включително Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 и XBB, и успя да намали значително инфекциозните вирусни титри след Delta и BA.1 инфекция при хамстери.

Открихме, че реконвалесцентният серум от нашата кохорта съдържа ниски концентрации на антитела, които се конкурират със S728-1157 (клас 1/ RBS-A антитяло) и клас 2 епитоп mAbs. Това предполага, че S728-1157 е донякъде уникален от други антитела, които са насочени към епитопи от клас 1 и рядко се индуцира в RBD-специфичния набор от В клетки на паметта. Вместо това изглежда, че нашата кохорта от естествени инфекции индуцира антитела, насочени към епитопа CR3022 (клас 4); антителата с тази специфичност често са кръстосано реактивни, но по-слабо неутрализиращи от антителата, насочени към RBS (14, 17). Тези данни допълват нашите предишни констатации, показващи, че изобилието от антитела от клас 3/S309 в реконвалесцентни серуми може да допринесе за неутрализираща активност срещу алфа и гама варианти, докато липсата на антитела от клас 2 може да обясни намалената способност за неутрализация срещу делта (15) . Независимо от това се съобщава, че обхватът на активност на повечето от тези насочени към RBS антитела (RBS-A/клас 1, RBS-B, C/клас 2 и RBS-D, S309/клас 3) срещу варианти на Omicron е силно ограничен (11, 40, 45).

Ключовото предизвикателство, което се движи напред, ще бъде да се определи как да се подобри предизвикването на широко кръстосано реактивни антитела към запазени RBS епитопи. В това отношение ние наблюдавахме тук, че индивиди с хибриден имунитет монтират значително по-високи титри на S728-1157-подобни антитела, отколкото ваксинирани индивиди без предшестваща инфекция. Важно е, че това явление беше отбелязано дори когато броят на експозициите беше контролиран (т.е. при реконвалесцентни двойни ваксинирани срещу неинфектирани тройни ваксинирани), което предполага, че някакъв елемент от имунитета, свързан с инфекцията (или формулировка на ваксина, която може да имитира този тип имунитет) е важен за извличането на този клонотип. Това е в съответствие с експериментални доказателства, документиращи, че индивиди с хибриден имунитет имат по-широки профили на реактивност на антитяло в сравнение с тези, които имат само индуциран от ваксинация или първична инфекция имунен отговор (9).

Структурите тук илюстрират, че S728-1157 свързва епитопа RBS-A/клас 1 в конформацията нагоре RBD. Този епитоп изглежда е по-лесно достъпен при 6P-стабилизирани шипове, за които се съобщава, че представят 2 RBD в северната част на щата, в сравнение с 2P шипове, които представят само 1 (30, 33, 46, 47) и към които нашите антитела специфични за конформация нагоре показват подобрено свързване. S728-1157 е изолиран след естествена инфекция; в такива контексти шансовете за индуциране на S728-1157-подобни клонинги вероятно са по-високи, като се има предвид, че RBD трябва да може да приеме възходяща конформация, дори временно, за да се свърже с ACE2, като по този начин излага този епитоп. За разлика от по-голямата част от IGHV3-53/3-66 RBS-A/клас 1 антитела, S728-1157 може да приспособи ключови мутации в VOC шипове, използвайки широки взаимодействия между CDR-H3 и RBD (29, 48–50). S728-1157 също използва различна лека верига (IGLV3-9) в сравнение с други по-малко широки антитела като CC12.3 (IGKV3-20), което може да повлияе на цялостните взаимодействия на свързване; обаче, нашият анализ показва, че има по-малко водородно свързване между S728-1157 леката верига и RBD в сравнение с CC12.3 (допълнителна таблица 7). Въпреки че повечето от CDR-H3 контактните остатъци, критични за VOC кръстосана реактивност в това взаимодействие, са кодирани от зародишна линия и не са въведени чрез соматични мутации, няколко соматично мутирали остатъци в рамкови региони или CDR-H1, CDR-H2 и CDR-L1 са участва във взаимодействие със SARS-CoV-2 RBD. От една страна, това предполага, че В клетките на паметта, кодиращи антитела от клас IGHV3-53/66, могат да придобият подобна степен на кръстосана реактивност чрез по-нататъшно узряване на афинитета. От друга страна, това също показва възможността за проектиране на имуногени, насочени към зародишна линия, които са насочени към S728-1157-подобни наивни В клетки. Въпреки че може да е предизвикателство да се проектират ваксини, които могат специфично да предизвикат S728-1157-подобни антитела с избрани CDR-H3s, способни да преодолеят VOC мутациите, окуражаващо е, че ограничението на IGHV-ген се наблюдава при други мощни SARS-CoV{ {58}} проучвания за неутрализиращи mAbs (13, 15, 20–27). Като алтернатива, това може също да бъде осъществимо чрез итеративна имунизация с оптимизирани RBD имуногени, както беше съобщено по-рано за други патогени (51–55).

Въпреки че са наблюдавани много мутации в антигенното място на RBS-A/клас 1 (18), по отношение на епитопа S728-1157, 13 от 15 общо RBD контактни остатъка и 2 от 3 CDR-H{{9} }свързаните RBD контактни остатъци се запазват в рамките на Omicron и всички други летливи органични съединения. Това предполага, че регионът на RBD, където е открит епитопът S728-1157, може да включва остатъци, критични за неговата динамична функция и вирусна годност и следователно би бил по-малко толерантен към мутации и антигенен дрейф, отколкото околните остатъци от RBS-A/клас 1 място. Ако случаят е такъв, тенденцията този конкретен епитоп да бъде загубен, докато вирусните варианти се развиват, трябва да бъде намалена, което прави характеризирането на S728-1157 и подобни антитела и епитопи важни за ваксини, устойчиви на варианти, или терапевтично развитие на mAb. В обобщение, нашето проучване идентифицира bnAbs, които могат да осигурят информация за имуногенния дизайн за следващо поколение устойчиви на варианти коронавирусни ваксини или да служат като mAb терапевтици, които са резистентни към еволюцията на SARS CoV-2. По-специално, по отношение на комбинирана ефективност и широчина, S728-1157 изглежда е най-доброто в този клас антитяло, изолирано до момента. Като се има предвид, че това антитяло се свързва по-лесно с 6P-стабилизация, се предвижда то да бъде индуцирано преференциално от 6P-стабилизирани рекомбинантни шипови протеини или цял вирус, което предполага, че модификацията на хексапролин може да бъде от полза за бъдещи конструкти на ваксина, за да се предпази оптимално от бъдещи SARS-CoV -2 варианти и други арбовируси.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Методи

Изолиране на моноклонални антитела. PBMCs бяха изолирани от филтри за редукция на левкоредация и замразени, както е описано по-горе (24). В клетките бяха обогатени от PBMCs чрез FACS. Клетките се оцветяват с CD19, CD3 и антигенни проби, конюгирани с олиго-флуорофор; представляващите интерес клетки бяха идентифицирани като CD3– CD19+ антиген+. Всички моноклонални антитела бяха генерирани от олигомаркирани клетки, сортирани по антигенна примамка, идентифицирани чрез едноклетъчна RNA-Seq, както е описано по-рано (15, 24). Данните за единични В клетки, генерирани в това проучване, са депозирани в Gene Expression Omnibus: GSE171703 и GSM5231088–GSM5231123.

Антиген-специфичните В клетки бяха избрани за генериране на mAbs на базата на интензитета на антигенна сонда, анализиран от JMP Pro 15. Гените на тежката и леката верига на антитялото бяха синтезирани от Интегрирани ДНК технологии (IDT) и клонирани в човешки IgG1 и човешка κ или λ лека верига експресионни вектори чрез сглобяване на Gibson, както е описано по-горе (56). Тежките и леките вериги на съответното mAb бяха временно котрансфектирани в HEK293T клетки (ATCC). След трансфекция в продължение на 18 часа, трансфектираните клетки бяха допълнени със свободна от протеин хибридомна среда супернатант (PFHM-II, Gibco). Супернатантата, съдържаща секретирано mAb, се събира на ден 4 и се пречиства с помощта на протеинови A-агарозни перли (Thermo Fisher Scientific), както е описано по-горе (56). Последователностите на тежки и леки вериги на добре охарактеризираните антитела са извлечени от банка данни за протеини (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) и REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) и бяха синтезирани, както е описано по-горе. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) е предоставено от Meng Yuan в Scripps Research Institute (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Експресия на рекомбинантен пиков протеин. Рекомбинантният шип D614G SARS-CoV-2 с пълна дължина (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, единични RBD мутанти (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A и Y505F), комбиниран RBD мутант (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD и MERS-CoV RBD бяха генерирани вътрешно. Накратко, рекомбинантните антигени се експресират с помощта на клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Интересуващият ген беше клониран в експресионен вектор на бозайник (вътрешно модифициран AbVec) и трансфектиран с помощта на комплекта ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) съгласно протокола на производителя. Супернатантата се събира на 4-ия ден след трансфекцията и се инкубира с Ni-нитрилотриоцетна киселина (Ni-NTA) агароза (Qiagen). Пречистването се провежда с помощта на колона с гравитационен поток и се елуира с имидазол-съдържащ буфер, както е описано по-горе (57, 58). Елуатът се буферира и се обменя с PBS, като се използва центробежен модул Amicon (Millipore). Рекомбинантните FL шипове, стабилизирани чрез 2P мутации на вариантите B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 и BA.4 Omicron и бяха произведени в лабораторията Sather към Института за детски изследвания в Сиатъл. K417V, N439K и E484K RBDs и рекомбинантен FL шип WT-2P и 6P са произведени в лабораторията на Krammer в Медицинското училище Icahn в планината Синай. SARS-CoV-2-6P-Mut7 и spike BA.1-6P са проектирани и произведени, както е описано в предишно проучване (59). Протеиновите последователности и ресурсите за всеки антиген са изброени в Допълнителна таблица 4. ELISA. Рекомбинантни SARS-CoV-2 spike/RBD протеини бяха покрити върху микротитърни плаки с високо протеиново свързване (Costar) при 2 ug/mL в PBS при 50 μL/ямка и държани една нощ при 4 градуса. Плаките се промиват с PBS, съдържащ 0.05% Tween 20 (PBS-T) и се блокират със 150 μL PBS, съдържащ 20% FBS за 1 час при 37 градуса. Моноклоналните антитела бяха серийно разредени 3-кратно, започвайки от 10 ug/mL в PBS и инкубирани в ямките за 1 час при 37 градуса. След това плаките се промиват и се инкубират с HRP-конюгирано козе анти-човешко IgG антитяло (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1, 000) за 1 час при 37 градуса. След промиване се добавят 100 μL Super AquaBlue ELISA субстрат (eBioscience) на ямка. Абсорбцията се измерва при 405 nm на спектрофотометър за микроплака (Bio-Rad). Анализите бяха стандартизирани с помощта на контролно антитяло S144-509 (15), с известни характеристики на свързване във всяка плака, и плаките бяха проявени, докато абсорбцията на контролата достигна OD от 3,0. Всички mAbs бяха тествани в два екземпляра и всеки експеримент беше извършен два пъти.

Серум ELISA. Микротитърни плаки с високо протеиново свързване бяха покрити с рекомбинантни антигени на SARS-CoV-2 при 2 ug/mL в PBS за една нощ при 4 градуса. Плаките се промиват с PBS 0.05% Tween и се блокират с 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% обезмаслено мляко на прах за 1 час при стайна температура (RT). Плазмените проби бяха инактивирани на топлина за 1 час при 56 градуса преди извършване на серологичния експеримент. Плазмата беше серийно разредена 2-кратно в PBS 0,1% Tween + 1% обезмаслено мляко на прах. Плаките се инкубират със серумни разреждания в продължение на 2 часа при RT. HRP-конюгирано козе анти-човешко Ig вторично антитяло, разредено при 1:3, 000 с PBS 0,1% Tween + 1% обезмаслено мляко на прах, се използва за откриване на свързването на антитела. След 1 час инкубация, плаките се проявяват със 100 μL разтвор на SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) в продължение на 10 минути. След това се използват 50 μL 3M HCl за спиране на реакцията на развитие. Абсорбцията се измерва при 490 nm на спектрофотометър за микроплака (Bio-Rad). Крайните титри бяха екстраполирани от сигмоидалната 4PL (където х е логаритмична концентрация) стандартна крива за всяка проба. Границата на откриване (LOD) се определя като средната + 3 SD на OD сигнала, записан с помощта на плазма от индивиди преди SARS-CoV-2. Всички изчисления бяха извършени в софтуера GraphPad Prism (версия 9.0).

Състезание ELISA. За определяне на класификацията на прицелния епитоп на RBD-реактивни mAbs, бяха проведени конкурентни ELISA, като се използваха други mAbs с известни характеристики на свързване на епитоп като конкурентни mAbs. Конкурентни mAbs бяха биотинилирани с помощта на EZ-Link сулфо-NHS-биотин (Thermo Fisher Scientific) в продължение на 2 часа при RT. Излишъкът от биотин на биотинилираните моноклонални антитела беше отстранен със 7k молекулно тегло прекъсване (MWCO) Zeba въртящи се обезсоляващи колони (Thermo Fisher Scientific). Плаките бяха покрити с 2 ug/mL RBD антиген за една нощ при 4 градуса. Плаките бяха блокирани с PBS–20% FBS в продължение на 2 часа при стайна температура и беше добавено 2-кратното разреждане на mAbs от неопределен клас или серум, като се започне от 20 ug/mL mAbs и 1:10 разреждане на серум. След инкубиране на антитялото в продължение на 2 часа при стайна температура, биотинилираното конкурентно моноклонално антитяло се добавя в концентрация два пъти по-висока от неговата константа на дисоциация (KD) и се инкубира за още 2 часа при стайна температура заедно с моноклоналното антитяло или серум, който е добавен преди това. Плаките се промиват и се инкубират със 100 μL HRP-конюгиран стрептавидин (Southern Biotech) при разреждане 1:1, 000 за 1 час при 37 градуса. Плаките бяха разработени с Super AquaBlue ELISA субстрат (eBioscience). За да се нормализират анализите, конкурентното биотинилирано mAb се добавя към ямка без никакви конкурентни mAbs или серум като контрола. Данните бяха записани, когато абсорбцията на контролната ямка достигна OD от 1,0–1,5. Процентът на конкуренцията между mAbs след това се изчислява чрез разделяне на наблюдаваната OD на пробата на OD, достигната от положителната контрола, изваждане на тази стойност от 1 и умножаване по 100. За серума, ODs се трансформират log10 и се анализират чрез нелинейна регресия, за да се определи 50 Стойности на % концентрация на инхибиране (IC50) с помощта на софтуер GraphPad Prism (версия 9.0). Данните бяха трансформирани в Log1P и нанесени в графика, представителна за реципрочното серумно разреждане на IC50 на серумното разреждане, което може да постигне 50% конкуренция с конкурентното mAb, което представлява интерес. Всички mAbs бяха тествани в два екземпляра, всеки експеримент беше извършен 2 пъти независимо и стойностите от 2 независими експеримента бяха осреднени.

Анализи на плака. Анализите на плаки бяха извършени с SARS-CoV-2 вариантни вируси върху Vero E6/TMPRSS2 клетки (Японска колекция за изследователски биоресурси (JCRB)) (допълнителна таблица 5). Клетките се култивират до постигане на 90% сливане, преди да бъдат трипсинизирани и посяти при плътност от 3 × 104 клетки/ямка в 96-плаки с ямки. На следващия ден 102 PFU от вариант SARS-CoV-2 бяха инкубирани с 2-кратно разредени mAbs за 1 час. Сместа антитяло-вирус се инкубира с Vero E6/TMPRSS2 клетки в продължение на 3 дни при 37 градуса. Плаките се фиксират с 20% метанол и след това се оцветяват с разтвор на кристално виолетово. Пълните инхибиторни концентрации (IC99) бяха изчислени с помощта на логаритъм (инхибитор) спрямо нормализиран отговор (променлив наклон), извършен в GraphPad Prism (версия 9.0). Всички mAbs бяха тествани в два екземпляра и всеки експеримент беше извършен два пъти. Тест за неутрализиране на намаляване на фокуса. Тестовете за неутрализиране на намаляване на фокуса (FRNTs) бяха използвани за определяне на неутрализационните дейности като допълнителна платформа встрани от анализа на плаката. Серийни разреждания на серум, започващи при крайна концентрация от 1:20, се смесват със 103 образуващи фокуса единици вирус на ямка и се инкубират за 1 час при 37 градуса. Обединена препандемична серумна проба служи като контрола. Сместа антитяло-вирус се инокулира върху Vero E6/TMPRSS2 клетки (JCRB) в 96-ямкови плаки и се инкубира за 1 час при 37 градуса. Към всяка ямка се добавя равен обем разтвор на метилцелулоза. Клетките се инкубират в продължение на 16 часа при 37 градуса и след това се фиксират с формалин. След като формалинът беше отстранен, клетките бяха имунооцветени с миши mAb срещу SARS-CoV-1/2 нуклеопротеин [клон 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], последвано от HRP-маркиран кози анти-миши имуноглобулин (Sigma- Олдрич; A8924). Заразените клетки се оцветяват с TrueBlue субстрат (SeraCare Life Sciences) и след това се промиват с дестилирана вода. След изсушаване, фокусните числа се определят количествено с помощта на анализатор ImmunoSpot S6, софтуер ImmunoCapture и софтуер BioSpot (клетъчна технология). IC50 се изчислява от интерполираната стойност от логаритъм (инхибитор) спрямо нормализиран отговор, като се използва нелинейна регресия с променлив наклон (4 параметъра), извършена в GraphPad Prism (версия 9.0).

Препратки

1. Hou YJ, et al. SARS-CoV-2 D614G вариант показва ефективна репликация ex vivo и предаване in vivo. Наука. 2020; 370 (6523): 1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. Множество варианти на SARS CoV-2 избягват неутрализацията от индуцирания от ваксината хуморален имунитет. клетка. 2021; 184 (9): 2523.

3. Wall EC, et al. Неутрализираща активност на антитела срещу SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 и B.1.351 чрез BNT162b2 ваксинация. Ланцет. 2021; 397 (10292): 2331–2333.

4. Edara VV, et al. Инфекция и индуцирани от ваксина отговори на неутрализиращи антитела към вариантите на SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021; 385 (7): 664–666.

5. Zhou D, et al. Доказателство за изпускане на SARS-CoV-2 вариант B.1.351 от естествени и индуцирани от ваксина серуми. клетка. 2021; 184 (9): 2348–2361.

6. Weisblum Y, et al. Бягство от неутрализиращи антитела от SARS-CoV-2 шипове протеинови варианти. Елайф. 2020; 9: e61312.

7. Греъм Ф. Ежедневен брифинг: Вариантът на коронавирус Омикрон поставя учените нащрек. Природата. 2021;.

8. Карим SSA, Карим QA. Вариант на Omicron SARS-CoV-2: нова глава в пандемията от COVID-19. Ланцет. 2021; 398 (10317): 2126–2128.

9. Carreño JM, et al. Активност на реконвалесцентен и ваксинален серум срещу SARS-CoV-2 Omicron. Природата. 2021; 602 (7898): 682–688.

10. Wang Q, et al. Тревожни свойства за избягване на антитела на нарастващите подварианти на SARS-CoV-2 BQ и XBB. клетка. 2022; 186 (2): 279–286.

11. VanBlargan LA, et al. Инфекциозен вирус SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron избягва неутрализация от терапевтични моноклонални антитела. Nat Med. 2022; 28 (3): 490–495.

12. Takashita E, et al. Ефикасност на антителата и антивирусните лекарства срещу Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022; 386 (10): 995–998.

13. Yuan M, et al. Разпознаване на SARS-CoV-2 рецепторния свързващ домейн чрез неутрализиращи антитела. Biochem Biophys Res Commun. 2021; 538: 192-203.

14. Barnes CO, et al. SARS-CoV-2 структури на неутрализиращи антитела информират терапевтичните стратегии. Природата. 2020; 588 (7839): 682–687.

15. Changrob S, et al. Кръстосано неутрализиране на възникващи тревожни варианти на SARS-CoV-2 от антитела, насочени към различни епитопи при пик. Мбио. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ, et al. Тежестта на инфекцията SARS-CoV-2 е свързана с превъзходния хуморален имунитет срещу пика. Мбио. 2021; 12 (1): e02940–20.

17. Greaney AJ, et al. Картографиране на мутации в SARS-CoV-2 RBD, които избягват свързването от различни класове антитела. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. Защитни неутрализиращи епитопи при SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022; 310 (1): 76–92.

19. Jette CA, et al. Широка кръстосана реактивност между арбовируси, проявена от подгрупа от неутрализиращи антитела, получени от донор на COVID-19. Cell Rep. 2021; 36 (13): 109760.

20. Brouwer PJM, et al. Мощните неутрализиращи антитела от пациенти с COVID{1}} определят множество цели на уязвимост. Наука. 2020; 369 (6504): 643–650.

21. Pinto D, et al. Кръстосана неутрализация на SARS CoV-2 от човешко моноклонално SARS-CoV антитяло. Природата. 2020; 583 (7815): 290–295.

22. Robbiani DF, et al. Конвергентни отговори на антитела към SARS-CoV-2 при реконвалесцентни индивиди. Природата. 2020; 584 (7821): 437–442.

23. Yuan M, et al. Структурна основа на споделен отговор на антитела към SARS-CoV-2. Наука. 2020; 369 (6507): 1119–1123.

24. Dugan HL, et al. Профилирането на В-клетъчната имунодоминантност след инфекция със SARS-CoV-2 разкрива еволюция на антитела към неутрализиращи вирусни цели. Имунитет. 2021; 54 (6): 1290–1303.

25. Rogers TF, et al. Изолиране на мощни SARS CoV-2 неутрализиращи антитела и защита от заболяване в малък животински модел. Наука. 2020; 369 (6506): 956–963.

26. Schmitz AJ, et al. Публично антитяло, предизвикано от ваксина, предпазва от SARS-CoV-2 и нововъзникващи варианти. Имунитет. 2021; 54 (9): 2159–2166.e6.

27. Shi R, et al. Човешко неутрализиращо антитяло е насочено към рецептор-свързващото място на SARS-CoV-2. Природата. 2020; 584 (7819): 120–124.

28. Cao Y, et al. Мощни неутрализиращи антитела срещу SARS-CoV-2, идентифицирани чрез високопроизводително едноклетъчно секвениране на В-клетки на реконвалесцентни пациенти. клетка. 2020; 182 (1): 73–84.

29. Barnes CO, et al. Структурите на човешките антитела, свързани с пика на SARS-CoV-2, разкриват общи епитопи и повтарящи се характеристики на антителата. клетка. 2020; 182 (4): 828–842.

30. Corbett KS, et al. Дизайн на SARS-CoV-2 иРНК ваксина, активиран от прототипна готовност за патогени. Природата. 2020; 586 (7830): 567–571.

31. Amanat F, et al. Въвеждането на два пролина и отстраняването на многоосновното място на разцепване доведе до по-висока ефикасност на рекомбинантна ваксина срещу SARS-CoV-2, базирана на шипове, в миши модел. mBio. 2021; 12 (2): e02648–20.

32. Sun W, et al. Вирус на нюкасълската болест, експресиращ стабилизиран пиков протеин на SARS-CoV-2, предизвиква защитни имунни реакции. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. Структурно базиран дизайн на предварително стабилизирани SARS-CoV-2 пикове. Наука. 2020; 369 (6510): 1501–1505.

34. Gobeil SM, et al. Структурно разнообразие на пика на SARS-CoV-2 Omicron. Mol Cell. 2022; 82 (11): 2050–2068.

35. Yuan M, et al. Силно консервативен загадъчен епитоп в рецепторните свързващи домени на SARS-CoV-2 и SARS-CoV. Наука. 2020; 368 (6491): 630–633.

36. Starr TN, et al. Пълна карта на SARS-CoV-2 RBD мутации, които избягват моноклоналното антитяло LY-CoV555 и неговия коктейл с LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, et al. Антителата REGN-COV2 предотвратяват и лекуват SARS-CoV-2 инфекция при макаци резус и хамстери. Наука. 2020; 370 (6520): 1110–1115.

38. Wu NC, et al. Алтернативен начин на свързване на IGHV3-53 антитела към SARS-CoV-2 рецепторен свързващ домен. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. Неконкурираща се двойка човешки неутрализиращи антитела блокират свързването на вируса COVID-19 с неговия рецептор ACE2. Наука. 2020; 368 (6496): 1274–1278.

40. Yuan M, et al. Структурни и функционални разклонения на антигенния дрейф в последните варианти на SARS-CoV-2. Наука. 2021; 373 (6556): 818–823.

41. Yan Q, et al. RBD-насочени неутрализиращи антитела, кодирани от зародишна линия IGHV3-53-, обикновено присъстват в репертоара на антитела на пациенти с COVID-19. Възникващи микроби заразяват. 2021; 10 (1): 1097–1111.

42. Zhang Q, et al. Мощни и защитни IGHV3- 53/3-66 обществени антитела и техният споделен спасителен мутант при пика на SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021; 12 (1): 4210.

43. Wang Z, et al. Антитела, предизвикани от иРНК ваксина срещу SARS-CoV-2 и циркулиращи варианти. Природата. 2021; 592 (7855): 616–622.

44. Simon V, et al. ПАРИЖ и СПАРТА: намиране на ахилесовата пета на SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. SARS-CoV-2 RBD антитела, които максимизират широчината и устойчивостта на бягство. Природата. 2021; 597 (7874): 97–102.

46. ​​Walls AC, et al. Структура, функция и антигенност на пиковия гликопротеин на SARS-CoV-2. клетка. 2020; 181 (2): 281–292.

47. Henderson R, et al. Контролиране на шиповидната гликопротеинова конформация на SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020; 27 (10): 925–933.

48. Shrestha LB, et al. Широко неутрализиращи антитела срещу възникващи варианти на SARS-CoV-2. Преден имунол. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ, et al. Антителата, предизвикани от иРНК-1273 ваксинация, се свързват по-широко с рецепторния свързващ домен, отколкото тези от SARS-CoV-2 инфекция. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 Бета вариантна инфекция предизвиква мощни специфични за линията и кръстосано реактивни антитела. Наука. 2022; 375 (6582): 782–787.

51. Wrammert J, et al. Широко кръстосано реактивните антитела доминират човешкия В-клетъчен отговор срещу пандемична инфекция с грипен вирус H1N1 от 2009 г. J Exp Med. 2011; 208 (1): 181–193.

52. Guthmiller JJ, et al. Първо излагане на индуцирани от пандемичния вирус H1N1 широко неутрализиращи антитела, насочени към епитопи на главата на хемаглутинина. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, et al. Грипното антигенно инженерство се фокусира върху имунните отговори към субдоминантен, но широко защитен вирусен епитоп. Микроб клетъчен гостоприемник. 2019; 25 (6): 827–835.

54. Nachbagauer R, et al. Базиран на химерен хемаглутинин подход за универсална ваксина срещу грипен вирус предизвиква широк и дълготраен имунитет в рандомизирано, плацебо-контролирано изпитване фаза I. Nat Med. 2021; 27 (1): 106–114.

55. Angeletti D, et al. Заобикаляща имунодоминантност за насочване към субдоминантни широко неутрализиращи епитопи. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ, et al. Ефикасен метод за генериране на моноклонални антитела от човешки B клетки. Методи Mol Biol. 2019; 1904: 109–145.

57. Amanat F, et al. Серологичен анализ за откриване на сероконверсия на SARS-CoV-2 при хора. Nat Med. 2020; 26 (7): 1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. Сероконверсия на SARS-CoV-2 при хора: подробен протокол за серологичен анализ, производство на антиген и настройка на теста. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL, et al. Структурни прозрения на силно мощно пан-неутрализиращо SARS-CoV-2 човешко моноклонално антитяло. Proc Natl Acad Sci САЩ. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et al. Автоматизирана молекулярна микроскопия: новата система Leginon. J Struct Biol. 2005; 151 (1): 41–60.

61. Lander GC, et al. Appion: интегриран тръбопровод, управляван от база данни за улесняване на обработката на EM изображения. J Struct Biol. 2009; 166 (1): 95–102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker и TiltPicker: софтуерни инструменти за улесняване на селекцията на частици в едночастична електронна микроскопия. J Struct Biol. 2009; 166 (2): 205–213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--система за визуализация за изследователски изследвания и анализи. J Comput Chem. 2004; 25 (13): 1605–1612.

64. Punjani A, et al. Неравномерно усъвършенстване: адаптивното регулиране подобрява крио-ЕМ реконструкцията на една частица. Nat методи. 2020; 17 (12): 1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: Определяне и корекция на CTF в реално време. J Struct Biol. 2016; 193 (1): 1–12.

66. Живанов Й. и др. Нови инструменти за автоматизирано крио-ЕМ структурно определяне с висока разделителна способност в RELION-3. Елайф. 2018; 7: e42166.

67. Casanal A, et al. Текущи разработки в coot за изграждане на макромолекулен модел на електронна крио-микроскопия и кристалографски данни. Protein Sci. 2020; 29 (4): 1069–1078.

68. Frenz B, et al. Автоматично коригиране на грешки в гликопротеиновите структури с розета. Структура. 2019; 27 (1): 134–139.

69. Klaholz BP. Извличане и прецизиране на атомни модели в кристалографията и крио-ЕМ: най-новите инструменти на Phenix за улесняване на структурния анализ. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019; 75 (pt 10): 878–881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Визуализация на структурата за изследователи, преподаватели и разработчици. Protein Sci. 2021; 30 (1): 70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Обработка на данни от рентгенова дифракция, събрани в режим на трептене. Методи Enzymol. 1997; 276: 307-326.

72. McCoy AJ, et al. Кристалографски софтуер Phaser. J Appl Crystallogr. 2007; 40 (pt 4): 658–674.

73. Qiang M, et al. Неутрализиращи антитела срещу SARS CoV-2 са избрани от библиотека с човешки антитела, конструирана преди десетилетия. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: инструменти за изграждане на модели за молекулярна графика. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60 (pt 12 pt 1): 2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: цялостна базирана на Python система за решение на макромолекулна структура. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66 (т. 2): 213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Епитопен анализатор: структурно базиран уеб инструмент за анализ на широко неутрализиращи епитопи. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.