Разнообразни антивирусни системи от дрожди предотвратяват смъртоносна патогенеза, причинена от LA Mycovirus

Последните проучвания показват, че антивирусните системи са забележително запазени от бактерии до бозайници, което показва, че уникални прозрения за тези системи могат да бъдат получени чрез изучаване на микробни организми. За разлика от бактериите обаче, където инфекцията с фаги може да бъде смъртоносна, не са известни цитотоксични вирусни последствия в напъпилите дрожди Saccharomyces cerevisiae, въпреки че са хронично заразени с двойноверижен РНК миковирус, наречен LA. Това остава така въпреки предишната идентификация на запазени антивирусни системи, които ограничават репликацията на LA. Тук показваме, че тези системи си сътрудничат, за да предотвратят необузданата репликация на LA, която причинява леталност в клетки, отглеждани при високи температури. Използвайки това откритие, ние използваме екран за свръхекспресия, за да идентифицираме антивирусни функции за дрождевите хомолози на полиА-свързващ протеин (PABPC1) и протеин Larp1, съдържащ La-домейн, които и двата участват във вродения вирусен имунитет при хората. Използвайки подхода на допълнителна загуба на функция, ние идентифицираме нови антивирусни функции за запазените РНК екзонуклеази REX2 и MYG1; хроматиновите регулаторни комплекси SAGA и PAF1; и HSF1, главният транскрипционен регулатор на реакцията на протеостатичен стрес. Чрез изследване на тези антивирусни системи, ние показваме, че патогенезата на LA е свързана с активиран протеостатичен стрес отговор и натрупването на цитотоксични протеинови агрегати. Тези констатации идентифицират протеотоксичния стрес като основна причина за патогенезата на LA и допълнително развиват дрождите като мощна моделна система за откриване и характеризиране на запазени антивирусни системи.

Всички лабораторни щамове и повечето екологични изолати на пъпкуващи дрожди S. cerevisiae са заразени с двойноверижен РНК (dsRNA) вирус, наречен LA (1, 2). LA принадлежи към широко разпространеното семейство Totiviridae от ендогенни dsRNA вируси. Както всички вируси от това семейство, геномът на LA dsRNA е опакован във вирион, който го предпазва от медиирано от гостоприемника храносмилане. Дупките във вириона позволяват екструзията на РНК транскрипти в цитозола, който кодира капсидния протеин, Gag, който съдържа по-голямата част от частицата. LA транскриптът също кодира Gag-pol слят протеин, произведен на много по-ниски нива от Gag протеина, който притежава РНК-зависима РНК полимеразна активност. Всеки вирион съдържа Gag-pol протеин, който отговаря за репликацията и транскрипцията на LA в рамките на частицата. Капсидирането на вирусните транскрипти в зараждащите се частици и синтезирането на отрицателната РНК верига от Gag-pol за образуване на dsRNA генома завършва цикъла на репликация на LA (2). За да произведе тези протеини, LA използва характеристики, типични за РНК вируси, открити при хора, включително механизъм за "отвличане на капачка", който доставя LA транскрипти с 5'-метил капачка и механизъм за рибозомно изместване на рамката, за да произведе Gag и Gag-pol слети протеини от единичен препис (3, 4).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Скорошни проучвания на бактериални антивирусни системи показват, че те споделят забележителна еволюционна консервация с хората, разкривайки потенциала на микробните организми да предоставят нови прозрения за вродения вирусен имунитет (5-11). Наистина, ранните проучвания, включващи LA, доведоха до откриването на две антивирусни системи, за които впоследствие беше доказано, че допринасят за вродения имунитет срещу различни РНК вируси при бозайници (12–17). Първата от тези антивирусни системи включва гените SKI2, 3 и 8, които кодират субединици на запазен комплекс, свързан с рибозома, който се противопоставя на транслацията на транскрипти, които нямат поли(А) опашки като тези, кодирани от LA (18-23). Отделен път на затихване на LA възниква чрез Xrn1 (известен също като SKI1), 5′-3′ екзорибонуклеаза, която разгражда неограничени иРНК (24–26).

Наскоро открихме, че митохондриалната ДНК/РНК ендонуклеаза Nuc1 потиска натрупването на LA в спорулиращи клетки, представлявайки нов антивирусен път на дрождите (27). Nuc1 е хомолог на ендонуклеаза G (EndoG), открита във всички еукариоти и много прокариоти и е най-известна с ролята си в насърчаването на фрагментацията на генома по време на програмирана клетъчна смърт на бозайници, виден механизъм за последна инстанция на вирусна защита (28, 29). Интересно е, че програмираната клетъчна смърт е присъща на спорулацията на дрождите и Nuc1 фрагментира ДНК от умиращи мейотични продукти по време на този процес в допълнение към ролята си в намаляването на нивата на вируса на LA, които са наследени от оцелелите спори (27, 30, 31).

Въпреки повсеместното присъствие на LA в лабораторни щамове, не е имало приписвани последици за годността му и по този начин LA до голяма степен се счита за безвреден комменсал. Тук показваме, че LA инфекцията всъщност е смъртоносна за дрождите и че тя трябва да бъде активно отслабена чрез вирусен вроден имунитет, за да се запази жизнеспособността. По-конкретно, при щамове, на които липсват паралелно действащи NUC1 и SKI антивирусни пътища, броят на копията на LA се увеличава значително, което води до леталност при високи температури.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ние разсъждавахме, че по-нататъшното характеризиране на LA и факторите, които поддържат неговата репликация на ниско ниво, може да разкрие нови антивирусни системи. Идентифицирането на състояния, които водят до патогенеза на LA, ни позволи да използваме подходи за биоинформатика и преден генетичен скрининг, за да открием нови антивирусни гени. Използвайки екран за свръхекспресирани гени, които потискат условната смъртност на nuc1∆ ski3∆, ние идентифицираме антивирусни функции за дрождевите хомолози на поли(А)-свързващ протеин (PABPC1) и La-домейна, съдържащ протеин Larp1, които и двата участват във вродените вируси имунитет при хора (32, 33). Освен това генетичните изследвания на загубата на функция идентифицираха дванадесет нови антивирусни гена. Сред тях са силно запазеният транскрипционен коактиваторен комплекс SAGA и няколко РНК екзонуклеази, включително REX2 и MYG1, като и двете имат различни, но слабо характеризирани човешки и бактериални хомолози (34–37).

И накрая, ние характеризираме патогенезата на LA, използвайки клетъчни биологични методи и откриваме, че високото вирусно натоварване причинява протеостатичен стрес. Тъй като е добре известно, че високата температура изостря протеостатичния стрес, тези наблюдения предполагат, че катастрофалният протеостатичен стрес е причината за смъртността, предизвикана от LA. В съответствие с тази хипотеза, ние показваме, че nuc1∆ ski3∆ мутанти проявяват LA-зависима чувствителност към азетидин-2-карбоксилна киселина (AZC), аналог на пролин, за който е известно, че причинява ортостатичен стрес (38). Освен това, ние демонстрираме антивирусна функция за HSF1, запазен транскрипционен фактор, който усеща и насочва реакцията към ортостатичен стрес. Интересното е, че човешкият Hsf1 също играе важна роля в репликацията и/или патогенността на различни вируси, включително HIV, SARS-Cov-2 и вирус на денга, въпреки че механизмите са неясни (39). Тези открития предоставят нови примери за вродена имунна консервация от микроби към хора и по-нататък високо леки дрожди като мощна моделна система за откриване на нови антивирусни системи.

Резултати

Антивирусните системи за дрожди NUC1, SKI и XRN1 си сътрудничат за предотвратяване на патогенезата на LA.

Предишните ни проучвания на NUC1 бяха фокусирани върху мейотичните клетки (27). За да изследваме антивирусната функция на NUC1 във вегетативно растящи дрожди, ние изследвахме броя на копията на LA в митотични хаплоидни клетки в фона на референтния щам BY4742. Ние наблюдавахме нивата на LA dsRNA, използвайки оцветяване с етидиев бромид на електрофореза РНК и открихме, че nuc1∆ ski3∆ двоен мутант показва голямо увеличение на LA dsRNA (фиг. 1A). Ние потвърдихме тези констатации с помощта на имунофлуоресцентна микроскопия с dsRNA антитяло, използвано за откриване на репликиращи РНК вируси (40, 41). Тези изображения показват, че LA dsRNA се натрупва във фокуси, напомнящи за местата на "вирусна фабрика" на вирусна репликация, наблюдавана в човешки клетки (Фиг. 1B и SI Приложение, Фиг. S1) (42). В съответствие с предишни констатации в други щамове (24, 27, 43), Western blotting показа, че нивата на Gag протеин са повишени в nuc1∆ и ski3∆ мутанти (фиг. 1C). Освен това, ние показахме, че nuc1∆ ski3∆ двоен мутант натрупа масово повишени нива на Gag (фиг. 1C). Тези данни показват, че NUC1 и SKI3 участват в отделни антивирусни пътища и че загубата на двата пътя води до силно повишено LA вирусно натоварване.

За да определим дали високото вирусно натоварване на LA влияе върху годността на клетките, ние изследвахме растежа на дрождите, използвайки тестове за растеж на място. Фините дефекти на растежа на nuc1∆ и ski3∆ единични мутанти се наблюдават при 37 градуса, когато клетките се отглеждат с глицерол, а не с глюкоза като източник на въглерод, състояние, при което дрождите разчитат на митохондриално дишане (фиг. 1D). Забележително е, че въпреки че двойните мутанти nuc1∆ ski3∆ растат нормално при 30 градуса, те показват условна смъртност при 37 градуса, независимо от източника на въглерод (фиг. 1D). Както се очакваше, жизнеспособността при висока температура беше възстановена на nuc1∆ ski3∆ двоен мутант от NUC1-експресиращ плазмид, който предизвика съответно намаляване на нивата на Gag (фиг. 1 C и D). За да потвърдим, че дефектът на растежа на двойния мутант nuc1∆ ski3∆ е причинен от LA, ние конструирахме изогенен щам, излекуван от LA (LA0) и анализирахме неговия растеж при високи температури. Ние открихме, че дефектът на растежа е напълно облекчен, което предполага, че условната смъртност е резултат от неограничена репликация на LA (фиг. 1D). За да оценим ефектите от високия брой копия на LA върху годността на клетките при оптимални условия на растеж, ние измерихме скоростите на пролиферация в течна култура. Тези проучвания разкриха намалена скорост на растеж в nuc1∆ ski3∆ двойни мутанти в сравнение с дивия тип при 30 градуса, която беше обърната в L-A0 щамове, демонстрирайки, че високото LA натоварване е вредно за годността дори в нестресирани клетки (SI Приложение, Фиг. S2).

растение цистанче, повишаващо имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

За да характеризираме допълнително как NUC1 взаимодейства с известни антивирусни пътища, тествахме връзката му с XRN1. Ние открихме, че nuc1∆ xrn1∆ двоен мутант е натрупал значително повишени нива на Gag в сравнение с единичния мутант и е показал LA-зависима условна смъртност при висока температура (SI Приложение, Фиг. S3 A ​​и B), което предполага, че NUC1 и XRN1 действат в паралелни пътища за отслабване на LA. Отразявайки техните ключови неизлишни роли в регулирането на обемната иРНК, двоен мутант xrn1∆ ski3∆ е нежизнеспособен, дори в щамове без LA (44). За да определим дали XRN1 представлява антивирусна система, независима от NUC1 и SKI3, ние използвахме плазмид с високо копие за свръхекспресия на XRN1 в nuc1∆ ski3∆ двоен мутант. Наистина, ние наблюдавахме значително намаляване на нивата на Gag и потискане на условната смъртност на nuc1∆ ski3∆, използвайки свръхекспресия на XRN1, управлявана от плазмид (фиг. 1 C и D). Ние заключаваме, че Nuc1, Ski3 и Xrn1 конвергентно се противопоставят на репликацията на LA и че масово увеличеният вирусен товар на LA в мутанти nuc1∆ ski3∆ или nuc1∆ xrn1∆ причинява смъртоносна патогенеза при високи температури (фиг. 1E).

Генетичен скрининг, базиран на биоинформатика, идентифицира нови антивирусни фактори.

LA-зависимата условна смъртност на nuc1∆ ski3∆ двойни мутанти повдигна възможността други антивирусни фактори да могат да бъдат идентифицирани чрез комбинаторни мутантни изследвания. За да идентифицираме нови кандидат-антивирусни фактори, потърсихме в подбрана база данни за генетично взаимодействие за генни делеции, които причиняват дефект на синтетичен растеж, когато се комбинират с nuc1∆ в най-малко две високопроизводителни скринингови проучвания (45). В допълнение към очакваното присъствие на XRN1 и SKI делеции в този набор от данни, открихме шестнадесет допълнителни гена. Използвахме генетично кръстосване, за да направим тройни мутанти, комбинирайки делеции на всеки от тези шестнадесет гена с nuc1∆ ski3∆ и потвърдихме шест, които причиняват сериозни дефекти в растежа (Таблица 1). Установихме, че фенотипите на синтетичен растеж, причинени от всеки от тези гени, са обърнати в LA0 щамове, което предполага, че те кодират антивирусни протеини (Таблица 1). По-долу описваме потвърждението на няколко от тези екранни попадения като нови антивирусни фактори.

Един ген, идентифициран в нашия екран, REX2, кодира 3′-5′ РНК екзонуклеаза, запазена от бактерии за хора (35). Както Rex2, така и неговият човешки хомолог REXO2 се локализират в митохондриите и съдържат домен EXOIII, широко разпространен в прокариотни и еукариотни протеини, включително интерферон-стимулирания антивирусен протеин ISG20 (36, 37, 46–48). Ние открихме, че rex2∆ nuc1∆ щам с двоен мутант е натрупал значително повишени нива на Gag в сравнение с единичен мутант и показва LA-зависими дефекти на растежа, включително смъртност при висока температура (Фиг. 2 A и B, и SI Приложение, Фиг. S2). Щам rex2∆ с единичен мутант показва леко повишаване на нивата на Gag, въпреки че този ефект е незначителен (Фиг. 2B). За да проучим стриктно последствията от rex2∆ за броя на копията на LA, ние количествено определихме LA RNA, използвайки RT-qPCR. Тези измервания потвърждават, че щамовете rex2∆ nuc1∆ натрупват значително повишени нива на LA, въпреки че те също така разкриват, че един единствен мутант rex2∆ не натрупва повишена LA РНК (фиг. 2C). Тези констатации предполагат, че антивирусната роля на Rex2 е очевидна само при липса на функция NUC1. Забележително е, че тройните мутанти nuc1∆ ski3∆ rex2∆ и nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ са нежизнеспособни при всички условия на растеж и тези дефекти са обърнати в L-A0 щамове (фиг. 2D). Тези констатации демонстрират тежкия патогенен потенциал на LA миковируса и идентифицират нова антивирусна роля за силно запазена митохондриално локализирана РНК екзонуклеаза.

Фиг. 1. Атенюацията на LA предпазва дрождите от летална патогенеза. (A) Показан е оцветен с етидиев бромид гел от обща РНК, получена от посочените щамове, с 4,6 kb LA dsRNA лента, посочена със стрелка. (B) Имунофлуоресценцията се използва за визуализиране на LA dsRNA (оранжево) в клетки от посочените генотипове. Тези щамове бяха излекувани от слабо изобилния L-BC dsRNA вирус, за да се елиминира фоновото оцветяване (детайли на метода). DAPI оцветяването на ДНК е в синьо. (Мащабна лента, 1 μm.) (C) Показано е Western blotting на нивата на LA Gag и 3-фосфоглицерат киназа (Pgk1) протеини в посочените щамове. Маркерите за молекулно тегло са посочени вдясно. (D) Показани са анализи на точков тест за растеж на щамовете от 1C. Щамовете се забелязват върху -Leu среда, съдържаща или глюкоза, или глицерол, и се отглеждат при посочените температури. (E) Митохондриалният протеин Nuc1 си сътрудничи с цитозолните протеини Xrn1 и SkiC, за да регулира нивото на LA протеин и да осигури годност на клетката.

Друг ген, идентифициран в нашия екран, беше MYG1, дрождевият хомолог на човешки MelanocYte пролиферационен ген 1, 3′-5′ РНК екзонуклеаза, която има хомолози във всички таксони (34). Мутантни щамове, комбиниращи myg1∆ и nuc1∆, показват големи увеличения на Gag протеин и LA РНК в сравнение с единичните мутанти и показват тежки LA-зависими дефекти на растеж при висока температура и в течна култура (Фиг. 2C и SI Приложение, Фигури S2, S4 А и В). Подобно на rex2∆, myg1∆ единичен мутантен щам показва малко увеличение на нивото на Gag и никаква промяна в LA РНК (Фиг. 2C и SI Приложение, Фиг. S4C). Успяхме да възстановим nuc1∆ ski3∆ myg1∆ тройни мутанти, въпреки че те растяха изключително бавно при 30 степен и натрупаха дори по-високи нива на Gag (SI Приложение, Фиг. S4 A и C). Тези дефекти в растежа също бяха обърнати в L-A0 щамове (SI Приложение, Фиг. S4A). По този начин MYG1 представлява нов антивирусен фактор, действащ паралелно както на NUC1, така и на SKI комплекса.

Таблица 1. Идентифициране на нови кандидат-антивирусни фактори с помощта на биоинформационен подход

Мутациите, водещи до свръхекспресия на човешки MYG1, са свързани с автоимунното разстройство витилиго, което предполага, че MYG1 може да играе известна роля в човешкия вроден имунитет (49, 50). Ние проучихме тази възможност, използвайки плазмид, експресиращ човешки MYG1 под контрола на конститутивен промотор на дрожди (34) и открихме, че човешкият MYG1 спасява условния дефект на растеж на nuc1∆ myg1∆ мутант (SI Приложение, Фиг. S4D). Тези констатации показват, че антивирусната функция на дрожди MYG1 може да бъде постигната от човешки MYG1, което предполага потенциална антивирусна функция за MYG1 при хора.

Фигура 2. Нови антивирусни фактори са идентифицирани чрез използване на патогенезата на LA. (A) Показан е точков анализ на щамове, дефектни в NUC1 и REX2. Щамовете се забелязват върху SC среда, съдържаща или глюкоза, или глицерол, и се отглеждат при посочената температура. (B) Western blotting на LA Gag и Pgk1 протеинови нива на щамове на Фиг. 2A. Маркерите за молекулно тегло са посочени вдясно. (C) LA RNA се определя количествено чрез qPCR и се нормализира до ендогенна ACT1 RNA. Показани са средно ниво на РНК и SD. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (тест на Стюдънт без двойка). (D) Показан е точков анализ на щамове, дефектни в три паралелни антивирусни пътя, съдържащи плазмид, експресиращ NUC1. Щамовете се забелязват върху -URA среда или синтетична пълна (SC) среда, допълнена с 0,1% 5-флуороротова киселина (5-FOA).

Друга генна категория, идентифицирана с помощта на нашия биоинформационен екран, беше генната експресия. CDC73 и SPT3 кодират субединици на консервативните свързани с хроматин комплекси PAF1 и SAGA, съответно. Както cdc73∆, така и spt3∆ причиняват LA-зависима смъртност, когато се комбинират с nuc1∆ ski3∆ (Таблица 1). Тъй като е доказано, че SAGA (SptAda-Gcn5-ацетилтрансфераза) повишава експресията на антивирусен ген в гъбата Cryphonectria parasitica по кестеновата мана, ние проучихме този комплекс допълнително (51). Spt3∆ nuc1∆ двойно мутантен щам натрупва повишени нива на Gag и показва LA-зависима смъртност при високи температури (SI Приложение, Фиг. S4 B и C). SAGA е голям протеинов комплекс и ние потвърдихме, че делециите в няколко други гени, кодиращи субединица SAGA, имат същите фенотипни последици като spt3∆ (SI приложение, таблица S1 и S4C). Заедно с констатациите от C. parasitica, тези резултати предполагат, че комплексът SAGA контролира експресията на антивирусен ген в различни гъбични видове.

Скринингът за високо потискане на копирането идентифицира антивирусните фактори на дрождите, които са също антивирусни при хората.

Тъй като свръхекспресията на XRN1 потиска дефектите на растежа на щам nuc1∆ ski3∆, ние предположихме, че свръхекспресията на други антивирусни фактори ще доведе до подобен ефект, който може да се използва като екран за идентифициране на нови антивирусни системи. Ние използвахме екран за потискане на плазмид с високо копие, за да открием гени, чиято свръхекспресия облекчава условната смъртност на щам nuc1Δ ski3Δ (подробности за метода). Използвайки този екран, идентифицирахме SRO9, SLF1 и PAB1 като супресори с високо копие на nuc1∆ ski3∆, всички от които кодират свързани с рибозома РНК свързващи протеини (фиг. 3A) (52, 53). Sro9 и Slf1 са паралогични протеини, съдържащи домейн на лупус-автоантиген (La), широко разпространени в еукариотите. Трябва да се отбележи, че техният човешки хомолог, Larp1, наскоро беше идентифициран в скрининг за протеини, свързани към SARS-Cov-2 плюс верига ssRNA или нуклеокапсид (32, 54). Larp1 беше основен фокус в едно от тези проучвания и беше показано, че намалява репликацията на SARS-Cov-2 в човешките клетки, въпреки че механизмът му не е известен (32). PAB1 кодира високо консервативния PolyA-свързващ протеин, който е обща цел за вирусно инхибиране при хора чрез различни механизми (33). Ние открихме, че свръхекспресията на PAB1 или SRO9 значително намалява нивата на Gag в nuc1∆ ski3∆ мутант, обяснявайки техните спасителни фенотипове (фиг. 3B). Любопитно е, че въпреки че свръхекспресията на SLF1 спаси дефекта на растежа на nuc1∆ ski3∆ също толкова добре, колкото SRO9, това не доведе до никакво намаляване на нивата на Gag (фиг. 3 A и B). Тези открития предполагат, че PAB1 и SRO9 спасяват клетки чрез потискане на репликацията на LA и че SLF1 защитава клетките от патогенните последици от повишената вирусна репликация.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Високият брой копия на LA води до цитотоксичен протеостатичен стрес.

За да придобием представа за различните механизми на Sro9 и Slf1 антивирусните дейности, ние разгледахме какви могат да бъдат физиологичните последици от патогенезата на LA и как SRO9/SLF1 може да им повлияе по различен начин. Отбелязахме предишно проучване, в което делеции на NUC1 или на SKI-комплекс гени доведоха до слаба индукция на GFP репортерен ген, контролиран от Hsf1 (55), запазен транскрипционен фактор, който усеща протеостатичен стрес и активира отговора на генната експресия (56–58). ). Използвайки поточна цитометрия с този репортер (HSE-GFP), ние потвърдихме тези резултати и установихме, че двоен мутант nuc1∆ ski3∆ причинява синергично и LA-зависимо активиране на HSE-GFP (Фиг. 3C и SI Приложение, Фиг. S5). Ние предположихме, че масивното производство на Gag, наблюдавано в nuc1∆ ski3∆ мутанти, обяснява този протеостатичен отговор на стреса. В подкрепа на това, активирането на HSE-GFP на двоен мутант nuc1∆ ski3∆ беше възстановено чрез свръхекспресия на PAB1 или SRO9, отразявайки последствията на тези гени за натрупване на Gag (фиг. 3 B и C). По-специално, свръхекспресията на SRO9 паралога SLF1 не предотвратява активирането на HSE-GFP. Еволюционната дивергенция на паралогичните SRO9 и SLF1 гени по този начин е довела до различни антивирусни механизми, като SRO9 потиска натрупването на вирусен протеин и свързания протеостатичен стрес и SLF1 изглежда защитава клетките от токсичните последици от индуцирания от вируса протеостатичен стрес.

Фиг. 3. Свръхекспресията на транслационните контролни фактори облекчава патогенезата на LA. (A) Показани са анализи на точков тест за растеж на супресорите с високо копие SRO9, SLF1 и PAB1. Щамовете се забелязват върху –LEU среда, съдържаща или глюкоза, или глицерол, и се отглеждат при посочените температури. (B) Western blotting за LA Gag, Pgk1, Sro9 и Slf1 протеинови нива в щамовете от 3A. Маркерите за молекулно тегло са посочени вдясно. (C) Използвана е поточна цитометрия за измерване на експресията на HSE GFP в посочените щамове (n {{10}}). Първият и третият квартил са маркирани със сивите полета. Средният интензитет на GFP е маркиран от черните ленти вътре. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (несдвоен t тест на Student). (D) Флуоресцентна микроскопия на Hsp104-GFP в посочени щамове. Клетките се оцветяват с DAPI за визуализиране на ядра. (Мащабна лента, 1 μm.) Процентът на клетките с 3+ GFP фокуси е показан вдясно. n=3. 75 до 140 клетки бяха преброени за всяко повторение.

Протеостатичният стрес често се свързва с натрупването на цитотоксични протеинови агрегати, които могат да бъдат визуализирани с помощта на GFP, слят с протеиновата дезагрегаза Hsp104, директна цел на транскрипционното активиране на Hsf1, за която е известно, че се локализира заедно с протеинови агрегати (59, 60). За по-нататъшно изследване на протеостатичните дефекти, свързани с патогенезата на LA, използвахме флуоресцентна микроскопия, за да визуализираме Hsp104-GFP фокуси в различни щамове. Както се очакваше, клетките от див тип, отглеждани при 30 градуса, рядко натрупват видими Hsp104-GFP огнища. Докато nuc1∆ и ski3∆ единични мутанти приличаха на див тип, поразително, nuc1∆ ski3∆ двоен мутант показва повече от 25% от клетките с три или повече Hsp104-GFP фокуса (фиг. 3D). Както при всички други фенотипове, които сме наблюдавали за nuc1∆ ski3∆, натрупването на Hsp104-GFP фокуси зависи от наличието на LA (фиг. 3D). Тези констатации показват, че високото вирусно натоварване, причинено от делеция на NUC1 и SKI3, е довело до натрупване на Hsp104-GFP фокуси, показателни за агрегация на цитотоксични протеини.

Тъй като патогенезата на LA е свързана с протеостатични дефекти, ние предположихме, че Hsf1 ще функционира като антивирусен фактор. Делецията на HSF1 е смъртоносна, така че ние използвахме чувствителния към температурата алел hsf1-848, получен от предишна публикувана колекция от щамове (61). Алелът hsf1-848 показва липса на растеж при 39 градуса, междинен фенотип на растеж при 37 градуса и липса на видим дефект в растежа при 35 градуса (фиг. 4А). Точковите тестове показват, че фенотипите на растеж на hsf1-848 при 35 градуса и 37 градуса са значително подобрени, когато се комбинират с nuc1∆ или ski3∆ и че тези дефекти на растежа са обърнати в щамове без LA вирус (фиг. 4A) . Както се очакваше, нежизнеспособността на всички hsf1-848 мутантни щамове се запази в клетки, отглеждани при 39 градуса, независимо от наличието на LA. Освен това, използвайки тетрадни дисекции, ние показахме, че hsf1-848 nuc1∆ ski3∆ тройни мутанти са нежизнеспособни при допустимата температура, ако са били заразени с LA, но здрави, ако са получени от LA0 щам (SI Приложение, фиг. S6). Използвайки Western blotting, открихме, че hsf1-848 nuc1∆ и hsf1-848 ski3∆ натрупват увеличени количества LA Gag в сравнение с единичните мутанти (Фиг. 4B). Заедно с нашите клетъчни биологични изследвания, тези открития предполагат, че Hsf1-регулираната реакция на протеостатичен стрес функционира като антивирусна система в дрождите, противопоставяйки се на патогенните последици от необузданата репликация на LA.

Тъй като е известно, че протеостатичните дефекти се обострят и водят до цитотоксичност при високи температури (59), един прост модел приписва смъртоносните последици от патогенезата на LA при високи температури на катастрофален протеостатичен стрес. За по-нататъшно тестване на този модел, ние третирахме щамове с азетидин-2-карбоксилова киселина (AZC), аналог на пролин, който е включен в протеини, водещи до ортостатичен стрес (38). Тези експерименти показват, че nuc1∆ ski3∆ проявява силна чувствителност към AZC по начин, зависим от LA вируса (Фиг. 4C и SI Приложение, Фиг. S6). Освен това открихме, че nuc1∆ ski3∆ проявява чувствителност към 5% етанол, състояние, което също причинява протеостатични дефекти, но не и към 0.5 M NaCl, което причинява осмотичен стрес (SI Приложение, Фиг. S6). Тези констатации предполагат, че леталните последици от патогенезата на LA се дължат конкретно на огромния протеостатичен стрес.

Фиг. 4. Реакцията на топлинен шок потиска патогенезата на LA. (A) Показан е точков анализ на щамове, дефектни в HSF1, NUC1 и SKI3 със или без LA. Щамовете се забелязват върху SC среда, съдържаща глюкоза, и се отглеждат при посочената температура. (B) Western blotting за LA Gag и Pgk1 протеинови нива на посочените щамове. Маркерите за молекулно тегло са посочени вдясно. (C) Показан е точков анализ на щамове, третирани с протеотоксичния пролинов аналог, азетидин-2-карбоксилова киселина (AZC). Щамовете бяха набелязани върху SC среда, съдържаща глюкоза, допълнена с или без 0.1 mg/mL AZC и отгледана при 30 градуса.

Дискусия

Въпреки повсеместното му присъствие в лабораторни щамове, проучванията на вируса LA dsRNA са ограничени поради неговата очевидно доброкачествена природа. Тук показваме, че LA има дълбоки последици за дрождите, когато репликацията им е неконтролирана и че различни вродени имунни системи поддържат репликацията на LA на приемливо ниво. По-конкретно, ние показваме, че в щамове, на които липсват паралелно действащи NUC1 и SKI3 антивирусни гени, репликацията на LA е масово регулирана нагоре, което води до ортостатичен стрес и условна смъртност при високи температури. Възползвайки се от това ново откритие, използвахме биоинформатични и предни генетични екрани, за да идентифицираме нови гени на дрожди, които функционират, за да ограничат репликацията на LA или да предпазят клетките от патогенните последици от неограничената репликация на LA. Тъй като тези екрани не са насищащи, геномът на дрождите вероятно кодира множество други антивирусни фактори. Проведени са много проницателни проучвания при дрожди, изучаващи репликацията на екзогенно въведени вирусни РНК от други организми и ще бъде интересно да се определи дали антивирусните фактори на LA действат по подобен начин върху тези вирусни РНК (62, 63).

Като се има предвид ясният риск от инфекция с LA, как въпреки това тя продължава да съществува на фона на постоянно присъстващата антивирусна активност е озадачаващо. Обяснение за този парадокс може да бъде, че LA осигурява уравновесяваща полза. Едно възможно предимство на LA е, че позволява на някои щамове да поддържат сателитни вируси, които кодират секретирани токсини, които убиват съседни незаразени клетки. Въпреки това, LA присъства в много щамове, които нямат "Killer" сателити, така че това обяснение е недостатъчно, за да обясни устойчивостта на LA инфекцията. Поради това ние спекулираме, че Лос Анджелис може да има някаква загадъчна полза, която уравновесява неговия вреден потенциал.

Нашето откритие на Rex2 като фактор за отслабване на вируса разширява арсенала от известни митохондриални антивирусни фактори извън Nuc1 и предполага, че митохондриите са ключов антивирусен център в дрождите. Наистина митохондриите играят централна роля във вирусната защита като програмиран регулатор на клетъчната смърт и като платформа за антивирусно сигнализиране при хората. Как митохондриалните нуклеази атенюират вирус, който се намира в цитозола в дрождите? Една от възможностите е, че тези ензими, макар и насочени към митохондриите, могат въпреки това да се натрупат до ниски, но достатъчни нива в цитозола, за да осъществят директно отслабване на LA. В съответствие с тази хипотеза, преди това показахме, че Nuc1 се натрупва в цитозола на мейотичните клетки, въпреки че нашите методи не можаха да го открият в цитозола на митотичните клетки (27). Друга хипотеза е, че някои аспекти от цикъла на репликация на LA възникват в тясна връзка с митохондриите. Например, LA транскриптите могат да се свържат с и евентуално да преминат през митохондриите, излагайки ги на Nuc1 и/или Rex2. Нашите резултати подчертават потенциалното общо значение на митохондриите за вирусния вроден имунитет при еукариотите и позиционират системата дрожди-LA като мощен модел за по-нататъшни изследвания на тази тема.

Антивирусният SKI комплекс, свързан с транслацията на рибозоми и нашата идентификация на Pab1, Sro9 и Slf1 като супресори с високо копие на патогенезата на LA, допълнително разкриват транслацията на рибозома като ключов център на антивирусната активност на дрождите. Откритието, че PAB1 (polyA свързващ протеин) потиска LA е изненадващо предвид липсата на polyA опашки в LA транскрипти, което предполага, че Pab1 не действа директно върху LA. Предишни констатации показват, че LA транскриптите се конкурират с полиА+ дрождеви иРНК за улавяне на 60S рибозомни субединици за образуване на транслиращи 80S комплекси (64). Един модел, обясняващ нашите открития, е, че Pab1 подобрява транслацията на мРНК, съдържаща полиА опашка, което след това изчерпва наличността на 60S субединици за LA транскрипти за транслация. Ролите на Sro9 и Slf1 в превода са по-малко разбрани, но техните функции могат по подобен начин да са свързани с конкуренцията на LA транскрипти за 60S субединици. Важно е, че хомолозите на Pab1 и Sro9/Slf1 участват в човешката вирусна защита и по-нататъшни изследвания на тези гени в дрождите ще хвърлят светлина върху антивирусните механизми, запазени от дрождите към хората.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Ние идентифицирахме антивирусна роля за запазения транскрипционен фактор HSF1 заедно с LA-индуциран протеостатичен стрес отговор, включващ натрупването на Hsp104-GFP фокуси, HSF1-активиран маркер на цитотоксични протеинови агрегати. Тези резултати подкрепят модела, при който патогенезата на LA е причинена от протеотоксичен стрес. Ние също така открихме антивирусна функция за комплекса SAGA, за който е доказано, че действа като коактиватор на индукцията на Hsf1 целеви ген след топлинен шок (65, 66). Тези наблюдения предполагат, че високите нива на LA водят до SAGA-зависимо активиране на Hsf1 целеви гени, които след това изпълняват антивирусната функция, осветявайки потенциална програма за антивирусна генна експресия в пъпкуващи дрожди. Този модел прави много проверяеми прогнози, които могат да бъдат от значение за вирусната патогенеза в други организми. Наистина, човешкият HSF1 също контролира експресията на протеолитични регулаторни фактори. Докато антивирусните функции на човешкия HSF1 са описани, не е ясно каква роля играе реакцията на ортостатичен стрес в това (39). Нашите открития осветяват мощна система за разпознаване на антивирусната функция на Hsf1 по отношение на ролята му в активирането на реакцията на протеостатичен стрес.

препратки

1. T. Nakayashiki, CP Kurtzman, HK Edskes, RB Wickner, Дрождените приони [URE3] и [PSI+] са болести. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 102, 10575–10580 (2005).

2. RB Wickner, T. Fujimura, R. Esteban, Вируси и приони на Saccharomyces cerevisiae. адв. Virus Res. 86, 1–36 (2013).

3. Т. Фуджимура, Р. Естебан, Механизъм за изтръгване на шапка в дрожден LA двойноверижен РНК вирус. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 108, 17667–17671 (2011).

4. JD Dinman, T. Icho, RB Wickner, -1 рибозомно изместване на рамката в двуверижен РНК вирус на дрожди образува gag-pol слят протеин. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 88, 174–178 (1991).

5. A. Bernheim et al., Прокариотните пепелини произвеждат различни антивирусни молекули. Nature 589, 120–124 (2021).

6. A. Bernheim, R. Sorek, Пан-имунната система на бактериите: Антивирусна защита като ресурс на общността. Нац. Rev. Microbiol. 18, 113–119 (2020).

7. AG Johnson et al., Бактериалните ръководители разкриват древен механизъм на клетъчна смърт. Science 375, 221–225 (2022).

8. BR Morehouse et al., STING cyclic dinucleotide sensing произхожда от бактерии. Nature 586, 429–433 (2020).

9. G. Ofir et al., Антивирусна активност на бактериални TIR домени чрез имунни сигнални молекули. Nature 600, 116–120 (2021).

10. KM Slavik et al., cGAS-подобни рецептори усещат РНК и контролират 3'2'-cGAMP сигнализирането в Drosophila. Nature 597, 109–113 (2021).

11. AT Whiteley et al., Бактериалните cGAS-подобни ензими синтезират различни нуклеотидни сигнали. Nature 567, 194–199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' mRNA екзонуклеаза Xrn1 контролира натрупването на двойноверижна РНК и антивирусните отговори. Микроб клетъчен гостоприемник. 17, 332–344 (2015).

13. SC Eckard et al., SKIV2L RNA екзозома ограничава активирането на RIG-I-подобните рецептори. Нац. Immunol. 15, 839–845 (2014).

14. M. Miyashita, H. Oshiumi, M. Matsumoto, T. Seya, DDX60, DEXD/H box helicase, е нов антивирусен фактор, насърчаващ RIG-I-подобно рецептор-медиирано сигнализиране. Mol. Cell Biol. 31, 3802–3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Пространствено-времева характеристика на антивирусната активност на агрегацията XRN1-DCP1/2 срещу цитоплазмени РНК вируси за предотвратяване на клетъчна смърт. Клетъчна смърт Differ 27, 2363–2382 (2020).

16. RE Rigby, J. Rehwinkel, разграждане на РНК при антивирусен имунитет и автоимунитет. Тенденции Immunol. 36, 179–188 (2015).

17. F. Shiromoto et al., IL-1beta/ATF3-медиираната индукция на експресия на Ski2 усилва разграждането на вируса на хепатит B x mRNA. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 503, 1854–1860 (2018).

18. JT Brown, X. Bai, AW Johnson, Дрождените антивирусни протеини Ski2p, Ski3p и Ski8p съществуват като комплекс in vivo. RNA 6, 449–457 (2000).

19. DC Masison et al., Примамване на системата за разграждане на cap-mRNA чрез двойноверижен РНК вирус и наблюдение на поли(A)-mRNA чрез антивирусна система на дрожди. Mol. Cell Biol. 15, 2763–2771 (1995).

20. C. Schmidt et al., Крио-ЕМ структурата на рибозома-Ski2-Ski3-Ski8 хеликазен комплекс. Наука 354, 1431–1433 (2016).

21. AM Searfoss, RB Wickner, 3' poly(A) не е необходимо за превод. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 97, 9133–9137 (2000).

22. EA Toh, P. Guerry, RB Wickner, Хромозомни суперубийствени мутанти на Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 136, 1002–1007 (1978).

23. А. Зиновиев, Р. К. Аюпов, И. С. Абаева, КЪТ Хелън, Т. В. Пестова, Екстракция на иРНК от застойни рибозоми от ски комплекса. Mol. Клетка 77, 1340–1349 e1346 (2020).

24. SG Ball, C. Tirtiaux, RB Wickner, Генетичен контрол на броя на копията на La и L-(Bc) Dsrna в системи убийци на SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Генетика 107, 199–217 (1984).

25. R. Esteban, L. Vega, T. Fujimura, 20S RNA narnavirus противодейства на антивирусната активност на SKI1/XRN1 в Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, 25812–25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 е видово-специфичен вирусен рестрикционен фактор в дрождите. PLoS Pathog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao et al., Мейотично вирусно отслабване чрез апоптотичен път на предците. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Ендонуклеаза G е апоптотична ДНКаза, когато се освобождава от митохондриите. Nature 412, 95–99 (2001).

29. BJ Thomson, Вируси и апоптоза. Вътр. J. Exp. Патол. 82, 65–76 (2001).

30. MD Eastwood, SW Cheung, KY Лий, J. Moffat, MD Meneghini, Програмирано в развитието ядрено унищожаване по време на гаметогенезата на дрождите. Dev. Клетка 23, 35–44 (2012).

31. MD Истууд, MD Meneghini, Координация на развитието на диференциация на гамети с програмирана клетъчна смърт в спорулиращи дрожди. Eukaryot Cell 14, 858–867 (2015).

32. N. Schmidt et al., SARS-CoV-2 РНК-протеинов интерактом в инфектирани човешки клетки. Нац. Microbiol. 6, 339–353 (2021).

33. RW Smith, NK Gray, Poly(A)-свързващ протеин (PABP): Обща вирусна цел. Biochem. J. 426, 1–12 (2010).

34. R. Grover et al., Myg1 екзонуклеазата свързва ядрените и митохондриалните транслационни програми чрез обработка на РНК. Nucleic Acids Res. 47, 5852–5866 (2019).

35. EV Koonin, Запазен древен домейн се присъединява към нарастващото суперсемейство от 3'-5' екзонуклеази. Curr. Biol. 7, R604–606 (1997).

36. M. Szewczyk et al., Human REXO2 контролира къси митохондриални РНК, генерирани от машини за обработка и разпадане на mtRNA, за да се предотврати натрупването на двойноверижна РНК. Nucleic Acids Res. 48, 5572–5590 (2020).

37. Y. Zuo, MP Deutscher, Ексорибонуклеазни суперсемейства: Структурен анализ и филогенетично разпределение. Nucleic Acids Res. 29, 1017–1026 (2001).

38. EW Trotter, L. Berenfeld, SA Krause, GA Petsko, JV Gray, Неправилно нагъване на протеини и повишаване на температурата причиняват спиране на G1 чрез общ механизъм, зависим от фактора на топлинен шок в Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 98, 7313–7318 (2001).

39. A. Reyes, AJ Navarro, B. Diethelm-Varela, AM Kalergis, PA Gonzalez, Има ли роля за HSF1 при вирусни инфекции? FEBS Open Bio 12, 1112–1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, Двуверижната РНК се произвежда от положително-верижни РНК вируси и ДНК вируси, но не и в откриваеми количества от отрицателно-верижни РНК вируси. J. Virol. 80, 5059–5064 (2006).

41. S. Welsch et al., Състав и триизмерна архитектура на местата за репликация и сглобяване на вируса на денга. Микроб клетъчен гостоприемник. 5, 365–375 (2009).

42. И. Фернандес де Кастро, Р. Тенорио, С. Риско, Фабрики за сглобяване на вируси в света на липидите. Curr. мнение Virol. 18, 20–26 (2016).

43. YX Liu, CL Dieckmann, Свръхпроизводство на вирусоподобни частици от дрожди от щамове с дефицит на митохондриална нуклеаза. Mol. Cell Biol. 9, 3323–3331 (1989).

44. AW Johnson, RD Kolodner, Синтетичната смъртност на sep1 (xrn1) ski2 и sep1 (xrn1) ski3 мутанти на Saccharomyces cerevisiae е независима от вируса убиец и предполага обща роля на тези гени в контрола на транслацията. Mol. Cell Biol. 15, 2719–2727 (1995).

45. C. Stark et al., BioGRID: Общо хранилище за набори от данни за взаимодействие. Nucleic Acids Res. 34, D535–539 (2006).

46. ​​L. Espert et al., ISG20, нова интерферон-индуцирана РНКаза, специфична за едноверижна РНК, дефинира алтернативен антивирусен път срещу РНК геномни вируси. J. Biol. Chem. 278, 16151–16158 (2003).

47. T. Hanekamp, ​​PE Thorsness, YNT20, байпас супресор на yme1 yme2, кодира предполагаема 3'-5' екзонуклеаза, локализирана в митохондриите на Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet 34, 438–448 (1999).

48. A. van Hoof, P. Lennertz, R. Parker, Три запазени члена на семейството на RNase D имат уникални и припокриващи се функции при обработката на 5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP и RNase P RNAs в дрожди . EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, Корелация на повишената експресия на MYG1 и неговия полиморфизъм на промотора с прогресията на заболяването и по-високата чувствителност при пациенти с витилиго. J. Dermatol. Sci. 71, 195–202 (2013).

50. K. Kingo et al., MYG1, нов ген, свързан с меланоцитите, има повишена експресия при витилиго. J. Dermatol. Sci. 44, 119–122 (2006).

51. IB Andika, A. Jamal, H. Kondo, N. Suzuki, SAGA комплексът медиира транскрипционната регулация нагоре на антивирусното РНК заглушаване. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 114, E3499–E3506 (2017).

52. SG Sobel, SL Wolin, Два протеина, съдържащи La мотив на дрожди, са РНК-свързващи протеини, които се свързват с полирибозоми. Mol. Biol. Клетка 10, 3849–3862 (1999).

53. A. Proweller, JS Butler, Рибозомна асоциация на поли(А)-свързващ протеин в поли(А)-дефицитен Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271, 10859–10865 (1996).

54. DE Gordon et al., Карта на протеиново взаимодействие на SARS-CoV-2 разкрива цели за повторно използване на лекарства. Nature 583, 459–468 (2020).

55. O. Brandman et al., Комплекс за контрол на качеството, свързан с рибозома, задейства разграждането на зараждащите се пептиди и сигнализира за стрес при транслация. Клетка 151, 1042–1054 (2012).

56. J. Anckar, L. Sistonen, Регулиране на функцията на HSF1 в реакцията на топлинен стрес: Последици при стареенето и заболяването. Annu. Rev. Biochem. 80, 1089–1115 (2011).

57. J. Li, J. Labbadia, RI Morimoto, Преосмисляне на HSF1 при стрес, развитие и здраве на организма. Trends Cell Biol. 27, 895–905 (2017).

58. PK Sorger, HR Pelham, Пречистване и характеризиране на топлинен шок елемент свързващ протеин от дрожди. EMBO J. 6, 3035–3041 (1987).

59. EJ Solis et al., Определянето на основната функция на дрождите Hsf1 разкрива компактна транскрипционна програма за поддържане на еукариотна протеостаза. Mol. Клетка 63, 60–71 (2016).

60. JR Glover, S. Lindquist, Hsp104, Hsp70 и Hsp40: Нова система за шаперон, която спасява преди това агрегирани протеини. Клетка 94, 73–82 (1998).

61. Z. Li et al., Систематично изследване на основната функция на дрождения ген с чувствителни към температура мутанти. Нац. Биотехнология. 29, 361–367 (2011).

62. RY Zhao, Дрожди за изследване на вируси. Microb. Клетка 4, 311–330 (2017).

63. T. Panavas, E. Serviene, J. Brasher, PD Nagy, Дрождевият геномен екран разкрива различни набори от гостоприемни гени, засягащи репликацията на РНК вируси. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 102, 7326–7331 (2005).

64. Y. Ohtake, RB Wickner, Размножаването на дрожден вирус зависи критично от концентрацията на свободната 60S рибозомна субединица. Mol. Cell Biol. 15, 2772–2781 (1995).

65. SB Kremer, DS Gross, SAGA и Rpd3 комплекси за модификация на хроматин динамично регулират генната структура и експресия на топлинен шок. J. Biol. Chem. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach et al., Hsf1 и Hsp90 организират зависимо от температурата глобално транскрипционно ремоделиране и хроматинова архитектура в Candida albicans. Нац. Общ. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Агрегирането на CAT опашки блокира тяхното разграждане и причинява протеотоксичност в S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. L. Magtanong et al., Мрежите за генетично взаимодействие с потискане на дозата подобряват функционалните схеми на свързване на клетката. Нац. Биотехнология. 29, 505–511 (2011).

69. V. Bilanchone et al., Ty3 ретротранспозон отвлича чифтосващи дрожди, обработващи РНК тела, за да зарази нови геноми. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan et al., Цитозолна протеостаза чрез внасяне на неправилно нагънати протеини в митохондриите. Nature 543, 443–446 (2017).