Ехинакозидът индуцира апоптотична смърт на ракови клетки чрез инхибиране на саниращия ензим MTH1 на нуклеотидния пул

Първа част Как ехинакозидът инхибира клетъчната апоптоза и подобрява паметта

За повече информация, моля, свържете се с: Ali.ma@wecistanche.com

Резюме:Инхибирането на дезинфекциращия ензим MTH1 на нуклеотидния пул причинява обширни окислителни увреждания на ДНК и апоптоза в раковите клетки и следователно може да се използва като противоракова стратегия. Тъй като естествените продукти са богат източник на медицински химикали, в настоящото проучване ние използвахме катализираната от MTH1-ензимна реакция като високопроизводителен in vitro скринингов анализ за търсене на естествени съединения, способни да инхибират MTH1.Ехинакозид, съединение, получено от лечебните растения Cistanche и Echinacea, ефективно инхибира каталитичната активност на MTH1 в in vitro анализ. Лечение на различни човешки ракови клетъчни линии сЕхинакозиддоведе до значително повишаване на клетъчното ниво на окисления гуанин (8-оксогуанин), докато нивото на клетъчните реактивни кислородни видове остава непроменено, което показва, чеЕхинакозидсъщо инхибира активността на клетъчния MTH1. Следователно,Ехинакозидлечението предизвиква незабавно и драматично увеличение на маркерите за увреждане на ДНК и регулиране нагоре на G1/S-CDK инхибитора p21, които са последвани от изразена апоптотична клетъчна смърт и спиране на клетъчния цикъл при рак, но не и при неракови клетки. Взети заедно, тези проучвания идентифицираха естествено съединение като инхибитор на MTH1 и предполагат, че естествените продукти могат да бъдат важен източник на противоракови агенти.

Ключови думи:Ехинакозид, MTH1, 8-oxoG, увреждане на ДНК,апоптоза, спиране на клетъчния цикъл.

Кликнете, за да използвате Cistanche за памет

Въведение

Клетъчният и митохондриалният нуклеозид трифосфат (NTP) и дезоксинуклеозид трифосфат (dNTP) пул е значителна цел на различни реактивни кислородни видове (ROS).1-3 Тъй като специфичността на ДНК полимеразите е по-малко от съвършена,4,5 окислените dNTPs могат да бъдат включени в новосинтезирана ДНК, за да причинят генетични аберации, ако не бъдат фиксирани.6 Например, основната окислена база в нуклеотидния пул, 8-оксогуанин (8-oxoG), може да се сдвои с цитозин и аденин. Когато се вмъкне в срещуположния аденин по време на репликация на ДНК, той потенциално може да причини T: A=G: C трансверсия,7 което е една от най-честите мутации, открити при човешки рак.8,9 Въпреки че повечето от окислените свободни dNTPs се отстраняват от дезинфекциращи ензими за нуклеотиден пул, проучвания в миналото разкриха, че нуклеотидният пул все още е важен източник на окислени бази в ДНК молекулите и значително допринася за окислителните увреждания на ДНК.3,10 Клетките на бозайниците са въоръжени със сложни защитни механизми, за да минимизиране на ROS-индуцирани геномни лезии. Ензимите за дезинфекция на нуклеотидния пул хидролизират окислените dNTPs и NTPs, като по този начин предотвратяват включването им в ДНК и РНК молекули.11,12 MTH1, член на суперсемейството Nudix хидролаза (следователно наричан също NUDT1),13 е трифосфатаза, отговорна за отстраняването на окислени пуринови NTPs и dNTP (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP и 2-OH-ATP) от нуклеотидните пулове.14 Тъй като 8-оксогуанин (8-oxoG) е основната окислена база вътре в клетките, MTH1 е най-важният ензим за дезинфекция на нуклеотидни пулове.15 Независимо от това, дори под наблюдението на дезинфекциращите ензими на нуклеотидния пул, значителна част от окислените dNTPs са включени в ДНК, а базите в ДНК молекулите също могат да бъдат окислени директно от ROS.6 Клетките след това разчитат на по-разработени стратегии, включващи различни ДНК гликозилази, като OGG1 и MUTYH, и процеси на възстановяване на ДНК, включително възстановяване чрез ексцизия на основата (BER) и несъответствие ремонт (MMR), за фиксиране на проблемни бази в ДНК молекули.10, 16,17 BER и MMR обикновено възстановяват множество окислени бази в ДНК на ден и по този начин играят важна роля в защитата на целостта и стабилността на генома.

В клетки, които са подложени на повишен оксидативен стрес, повишеното включване на окислени нуклеотиди в ДНК може да надвие клетъчния възстановителен капацитет и да предизвика отговор на увреждане на ДНК (DDR).18 Устойчивото DDR сигнализиране ще доведе до спиране на клетъчния цикъл, преждевременно клетъчно стареене или апоптоза, като по този начин поставяйки бариера за туморогенезата.19 И все пак, въпреки че раковите клетки показват силно повишено окислително напрежение и генерират потенциално смъртоносно бреме от окислени нуклеотиди,20 те могат да преживеят свързаното с DDR стареене или апоптоза.21 Голям брой проучвания показват, че MTH1, чрез ефективно премахване на опасно изобилните 8-oxodGTP и 2-OH-dATP в туморните клетки, играе ключова роля в развитието на рак.22 Установено е, че MTH1 е свръхекспресиран при различни видове рак,23– 25 и нивата на 8-oxoG и степента на оксидативни ДНК лезии е по-ниска в туморите, отколкото в околните нормални тъкани. 26–28 Функционално, свръхекспресията на MTH1 значително намалява изтръпването er на ДНК мутации, наблюдавани в MMR-дефицитни миши ембрионални фибробласти10 и позволява на клетките да преодолеят онкогенното Ras-индуцирано преждевременно клетъчно стареене и апоптоза;29 докато потискането на MTH1 предотвратява развитието на рак при OGG1-дефицитни мишки30 и насърчава ROS -индуцирана DDR и клетъчно стареене в Ras-трансформирани клетки.3,29,31 По този начин, въпреки че MTH1 играе защитна роля чрез предотвратяване на ROS-индуцирани мутации в здрави клетки, тези проучвания установяват, че MTH1 е особено необходим за появата и оцеляването на рак клетки. Последните проучвания предоставят повече доказателства в подкрепа на ролята на MTH1 в развитието на рак.31–34 Потискането на MTH1 от RNAi или инхибитори на малки молекули в различни ракови клетъчни линии води до значително повишено включване на 8-oxodG в геномна ДНК, което води до до големи увреждания на ДНК, апоптотична клетъчна смърт и намалено оцеляване на раковите клетки. 32,33 При проучвания върху миши ксенотрансплантати, инхибирането на MTH1 ефективно потиска растежа на раковите експланти. Важно е, че потискането на MTH1 не повлиява растежа и оцеляването на нормалните клетки, вероятно защото нормалните клетки имат по-ниска ROS и следователно са по-малко зависими от MTH1 за оцеляване. 32, 33 Тези открития предполагат, че инхибирането на MTH1 е обещаваща нова стратегия за борба с рака .

Естествените продукти са били богат източник на лечебни съединения.35 Много съвременни терапевтици, включително противоракови лекарства, са получени от билкови или ботанически препарати.36–39 Въпреки това голям брой традиционни билки, за които се предполага, че притежават различни терапевтични свойства, остават които трябва да бъдат характеризирани, до голяма степен поради трудности при контролирането на техния състав, за да се определи недвусмислено тяхната ефикасност и механизми на действие.40 Необходими са нови подходи, които позволяват откриване на активни съединения и анализ на молекулярни механизми. В това отношение, насоченият към целта високопроизводителен in vitro скрининг може да бъде инструмент за намиране на механично дефинирани лекарствени съединения от природни ресурси. В настоящото изследване използвахме катализираната от MTH1-ензимна реакция като високопроизводителен in vitro анализ за търсене на естествени съединения, които могат да инхибират MTH1. Изненадващо, прожекцията разкри товаЕхинакозид, естествен продукт, който е най-известен със своята мощна антиоксидантна активност, е способен да инхибира MTH1.

Материали и методи

Материали

Естествените билкови съединения са закупени от Yuanye Biological Technology Co., Шанхай, Китайска народна република. Името, каталожният номер, регистрационният номер на Chemical Abstracts Service (CAS) и чистотата на всяко съединение са изброени в Таблица S1. Изходните разтвори на съединенията се приготвят в 100 процента диметилсулфоксид (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), а работните разтвори се приготвят в буфер за анализ или пълна среда за клетъчна култура. Същият разтвор без тестваното съединение, но съдържащ същото количество DMSO, се използва като контролен носител. (S)-кризотиниб е закупен от Selleck Chemicals, Хюстън, Тексас, САЩ.

Ин витро скрининг

Ензимният анализ in vitro, използван за скрининг на естествени билкови съединения, следваше процедурите, описани от Gad et al.32 Накратко, бяха приготвени серийни разреждания на отделни съединения в буфера за анализ, състоящ се от 100 mM Tris- ацетат (рН 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg ацетат, 0,005 процента Tween 20 и 1 mM DTT. След това се добавят 0,5 nM рекомбинантен човешки MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и 0,2 U/mL неорганични пирофосфатази (Thermo Fisher Scientific) и плочите се инкубират върху шейкър за 1 час при стайна температура. Крайният реакционен обем беше 100 μL върху 96-ямкова плака. В края на реакцията се добавя малахитово зелено (J&K Scientific, Пекин, Китайска народна република) 41 и плочите се инкубират при стайна температура за още 15 минути. Абсорбцията при 630 nm се измерва с четец на микроплаки BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ). Стойностите на инхибиторната концентрация (IC50) се определят чрез нелинеен регресионен анализ с помощта на софтуера GraphPad Prism.

Клетъчна култура

Човешки MG-63 остеосарком, SK-HEP-1 хепатокарцином, MCF7 рак на гърдата, SW480 колоректален рак, HEK293 ембрионален бъбрек и миши NIH/3T3 фибробластни клетъчни линии са от Американската колекция от типови култури и човешките нормални чернодробна клетъчна линия L-O2 е закупена от KenGen Biotech, Nanjing, Китайска народна република. Тези клетки се поддържат при 37 градуса във влажна атмосфера с 5 процента CO2, следвайки инструкциите, дадени от доставчиците. Не се изисква етична декларация от институционалния съвет за преглед за използването на тези клетъчни линии.

Измерване на вътреклетъчния 8-oxoG

Вътреклетъчните нива на {{0}}oxoG се измерват чрез оцветяване с Cy3-конюгиран авидин.42 Общо 1 × 104 клетки се посяват върху кръгло покривно стъкло в 12-ямкови плаки. На следващия ден клетките бяха третирани с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM или 80 μMЕхинакозидза 5 часа, 12 часа или 24 часа и след това се фиксират с ледено студен метанол за 20 минути, последвано от инкубиране в Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS) с 0.1 процента Triton X -100 (Sigma-Aldrich) за 15 минути. Пробите бяха блокирани в TBS с 0.1 процента Triton X-100 и 15 процента фетален говежди серум за 1 час при стайна температура и след това оцветени с Cy3-конюгиран авидин (0,5 ug/ mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) в блокиращ разтвор за 1 час при 37 градуса. След промиване във фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) 3 пъти в продължение на 5 минути, покривните стъкла се запечатват върху предметни стъкла във VECTASHIELD Монтажна среда с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (Vector Laboratories, Burlingame, CA , САЩ). Изображенията бяха направени и анализирани с конфокален микроскоп Zeiss LCM 510.

Измерване на вътреклетъчната ROS

Вътреклетъчните нива на ROS се измерват чрез поточна цитометрия, като се използва клетъчно базиран комплект за анализ на ROS (Beyotime Biotechnology, Haimen, Китайска народна република). Клетки, отгледани в плаки с шест ямки, бяха третирани с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM или 80 μMЕхинакозидза 5 часа, 12 часа или 24 часа, промити два пъти с PBS и инкубирани с 10 μM дихлорофлуоресцеин диацетат за 30 минути при 37 градуса. След това клетките бяха трипсинизирани и анализирани от FACSCaliber поточен цитометър (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Вътреклетъчно-клетъчните нива на ROS се изразяват като средния интензитет на флуоресценция на дихлоро ди-хидрофлуоресцеин на клетките. Показаните числа са средни от три независими експеримента.

Имунофлуоресцентно оцветяване

Клетки, отгледани върху покривни стъкла, бяха третирани с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM или 80 μMЕхинакозидза 5 часа, 12 часа или 24 часа и след това се промива веднъж с PBS, фиксира се с 4 процента параформалдехид в PBS за 20 минути и се блокира в TBS с 0,1 процента Triton X-100 и 15 процента фетален говежди серум за 1 час при стайна температура. Фиксираните клетки се оцветяват в продължение на 2 часа при стайна температура с първично антитяло срещу 8-oxoG (миши моноклонален анти-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (заешки анти-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , Тексас, САЩ), или активна каспаза-3 (заешка анти-каспаза-3, Bioss, Пекин, Китайска народна република), последвано от оцветяване с Alexa 488-конюгирана магарешка антимишка ( Abcam) или Cy3-конюгирано козе анти-заешко антитяло (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, САЩ) вторично антитяло за 1 час при стайна температура. След промиване в PBS 3 пъти в продължение на 5 минути, покривните стъкла се запечатват върху предметни стъкла във VECTASHIELD монтажна среда с DAPI (Vector Laboratories). Изображенията са направени с конфокален микроскоп Zeiss LCM 510.

Тест за образуване на колонии

В деня преди третирането, клетките се посяват в плоча с шест ямки в концентрация от 1 × 104 клетки на ямка. След това те бяха третирани с 0 μM, 60 μM или 80 μM ехинакозид в продължение на 7 дни. След промиване с PBS, клетките се фиксират с ледено студен метанол и се оцветяват с разтвор на кристално виолетово (Sigma Aldrich) (0,5 процента в 25 процента метанол). Изображенията бяха фотографирани след изсушаване на плаките за една нощ. Кристално виолетовите кристали се разтварят чрез добавяне на 70 процента етанол и абсорбцията при 595 nm се измерва с четец на микроплаки BioRad 680. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера GraphPad Prism.

МТТ анализ

Един ден преди третирането клетките се посяват в 96-плаки с ямки в концентрация 1 × 104 клетки на ямка, последвано от третиране със серийни разреждания на ехинакозид за 24 часа или 48 часа или с 60 μM ехинакозид за 5 часа , 12 часа или 24 часа. Средата се отстранява и клетките се промиват с PBS и след това 20 μL 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,

Разтвор на 5-дифенил тетразолиев бромид (MTT) (5 mg/mL в PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) се добавя към всяка ямка. Плаките се инкубират при 37 градуса за още 4 часа. В крайна сметка разтворът на МТТ се отстранява и към всяка ямка се добавят 150 μL DMSO. Плаките се инкубират на шейкър за плочи за 10 минути и абсорбцията при 570 nm се измерва с четец на микроплаки BioRad 680. Всеки експеримент се провежда два пъти в три екземпляра. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера GraphPad Prism. IC50 стойностите се определят чрез нелинеен регресионен анализ.

Анализ на клетъчния цикъл

Клетките в плочи с шест ямки бяха третирани с 0 μM, 6{{10}} μM или 80 μM ехинакозид за 24 часа, събрани с трипсин (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) , промит два пъти с PBS и след това фиксиран с ледено студен етанол (70 процента) за 2 часа при -20 градуса. Фиксираните клетки се промиват два пъти в студен PBS и се ресуспендират в 300 μL прясно приготвен PBS с 0,1 процента Triton X-100, 0,2 mg/mL свободна от ДНКаза РНКаза А (Sigma Aldrich), 10 ug/mL пропидиев йодид (PI ) (Hoffman-La Roche Ltd., Базел, Швейцария). След инкубиране при 37 градуса на тъмно в продължение на 20 минути, клетките се филтруват през найлонова мрежа Falcon (BD Biosciences), зареждат се в FAC-Calibur поточен цитометър и се анализират с помощта на софтуера ModFit (BD Biosciences).

ДНК фрагментационен анализ

Клетки, отгледани в плочи с шест ямки, бяха третирани с 0 μM, 60 μM или 80 μM ехинакозид за 24 часа и фиксирани в леденостуден 4 процента параформалдехид (Sigma-Aldrich) за 20 минути. След промиване с PBS, клетките бяха запечатани във VECTASHIELD монтажна среда с DAPI (Vector Laboratories). Ядрената морфология е фотографирана с флуоресцентен микроскоп Olympus. За откриване на фрагментация на ДНК върху агарозни гелове, ДНК се екстрахира с помощта на QIAamp DNA micro kit (Qiagen NV, Venlo, Холандия) и се извършва електрофореза върху 2% агарозни гелове, съдържащи 0,1 ug/mL етидиев бромид.

Анализ на апоптоза чрез поточна цитометрия

Апоптозните клетки бяха изследвани с помощта на комплект за откриване на апоптоза Annexin V-FITC (Best, Шанхай, Китайска народна република), следвайки инструкциите на производителя. Клетки, отгледани в 96-плаки с ямки, бяха третирани с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM или 160 μM ехинакозид за 2 часа, 5 часа, 12 часа или 24 часа, промит два пъти с PBS и след това ресуспендиран в свързващ буфер. След това се добавят последователно 5 μL анексин V-FITC и 5 μL PI (Roche) и клетките се инкубират за 15 минути на тъмно при стайна температура. Клетките бяха заредени в FACSCalibur поточен цитометър (BD Biosciences) и данните бяха анализирани с помощта на софтуера Cell Quest (BD Biosciences).

Western blot анализ

Клетки, отгледани в плочи с шест ямки, бяха третирани с 0 μM, 6{{10}} μM или 80 μM ехинакозид за 5 часа, 12 часа или 24 часа, промива се два пъти с PBS и се изстъргва от плаката, като се използва 100 μL буфер за радиоимунопреципитация (150 mM NaCl, 1,0 процента IGEPAL CA-630, 0,5 процента натриев деоксихолат, 0,1 процента натриев додецил сулфат и 50 mM Tris, рН 8.0) (Sigma-Aldrich), съдържащ 1 mM фенилметан сулфонил флуорид. Пробите се центрофугират при 12,000× g за 20 минути при 4 градуса. Концентрациите на протеин в супернатантите се определят с реактива на Брадфорд (Dingguo, Changchun, Китайска народна република). Пробите се денатурират при 95 градуса за 10 минути и се разделят на 12 процента натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел електрофореза гел. След електрофореза, протеините се прехвърлят към мембрани от поливинилиден флуорид (Millipore), последвано от блокиране в Tris-буфериран физиологичен разтвор с Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 процента Tween 20), съдържащ 5 процента (w/v) обезмаслено мляко за 1 час на стайна температура. Блотовете бяха изследвани с първични антитела срещу p21 (Abcam), поли (ADP-рибоза) полимераза (Bioss) или активирана каспаза -3 (Bioss), последвани от вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Сигналите са разработени с помощта на комплекта за откриване на хемилуминесценция Western blotting (Trans gen Biotech, Чанчун, Китайска народна република). Експериментите се повтарят три пъти.

Измерване на митохондриални

мембранен потенциал

Потенциалът на митохондриалната мембрана беше измерен с помощта на багрилото JC{{0}} (биотехнология), следвайки инструкциите на производителя. Клетките, отгледани в плаки с шест ямки, се третират с 0 μM, 60 μM или 80 μM ехинакозид за 5 часа, 12 часа или 24 часа, промиват се два пъти в PBS и след това се инкубират с JC-1 за 20 минути. Изображенията са направени с помощта на флуоресцентен микроскоп Olympus.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер GraphPad Prism. Значимостта се изчислява с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ и P0.05 се счита за статистически значимо. Резултатите бяха изразени като средно ± стандартно отклонение.

Резултати

Идентифициране на ехинакозид като инхибитор на MTH1

За търсене на естествени съединения, способни да инхибират MTH1, ние използвахме MTH1-катализираната ензимна реакция като високоефективен в скрининговия анализ Vitro. Освен окислените пуринови нуклеотиди, MTH1 може също да хидролизира нормалния деоксигуанозин трифосфат, за да генерира деоксигуанозин монофосфат и пирофосфат. В присъствието на излишък от неорганична пирофосфатаза, всички пирофосфати се превръщат в неорганични фосфати, които могат да бъдат количествено определени с помощта на тест за абсорбция на основата на малахитово зелено,41 което позволява индиректно измерване на активността на MTH1.32 За да тестваме системата за анализ, първо измерихме ефект на (S)-кризотиниб, съединение с доказана ефективност като MTH1 инхибитор.33 Резултатът показа, че (S)-кризотиниб наистина силно инхибира MTH1 (Фигура 1A) с IC50 от 500 nM, което е седем пъти по-високо от докладваното от Huber et al (72 nM).33 Това вероятно се дължи на разликите в методите за откриване или източниците на химикали и ензими. Ние възприехме по-малко чувствителен хромогенен подход, докато Huber et al използваха високочувствителен биолуминесцентен метод.33 Имайки това предвид, ние скринирахме 12 налични в търговската мрежа природни съединения (Таблица S1), всяко от които е основна съставка на традиционните билки с потенциален антитуморен ефект дейност. Ехинакозид, съединение, пречистено от паразитното лечебно растение Cistanche salsa (Фигура 1C), значително инхибира реакцията (Фигура 1B), с IC50 от 7,01±2,13 μM (Фигура 1D). Добавянето на 50 пъти повече пирофосфатаза не оказва влияние върху резултата, докато добавянето на пет пъти повече MTH1 протеин значително намалява степента на инхибиране, което предполага, че Echinacoside специфично инхибира активността на MTH1 в in vitro ензимния анализ.

Ехинакозидът инхибира клетъчния MTH1, за да увеличи вътреклетъчния 8-oxoG

След това попитахме дали ехинакозидът може да инхибира вътреклетъчната активност на MTH1. Инхибирането на клетъчния MTH1 ще увеличи вътреклетъчния 8-oxoG. Доказано е, че авидин се свързва с 8-oxoG с висока специфичност;42 следователно използвахме имунофлуоресцентно оцветяване с Cy3-конюгиран авидин, за да сравним вътреклетъчните нива на 8-oxoG в различни ракови клетъчни линии преди и след лечение с ехинакозид. Човешки MG-63 остеосарком, SK-HEP-1 хепатокарцином, MCF{{10}} рак на гърдата и SW480 колоректални ракови клетки бяха третирани с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM или 80 μM ехинакозид за 5 часа, 12 часа или 24 часа. Оцветяването с Cy3-конюгиран авидин разкри, че лечението с 60 μM ехинакозид за 24 часа ясно и значително повишава нивото на клетъчния 8-oxoG (Cy3-авидин реактивно вещество) в тези ракови клетки ( Фигура 2A и B). По-висока концентрация (80 μM) на ехинакозид доведе до по-силно клетъчно 8-oxoG оцветяване (Фигура 2B), което предполага връзка доза-отговор. Подобни резултати са получени чрез имунофлуоресцентно оцветяване с мише моноклонално анти-8-oxoG антитяло (Фигура S1A).43 Концентрацията на ехинакозид (60 μM), необходима за значително увеличение на клетъчния 8-oxoG, е много по-висока от IC50 (7,01 μM) от in vitro анализа. Това вероятно се дължи на разликата в чувствителността на двата анализа. Имунофлуоресцентното оцветяване е много по-малко чувствително от in vitro ензимния анализ; освен това, броят на инхибиторните молекули, които могат да достигнат и взаимодействат с клетъчния MTH1, се влияе от сложни биологични процеси; освен това, в in vitro теста, по-малко предпочитаният dGTP се използва като субстрат и следователно може да бъде по-лесно (вземете по-малко инхибитори) да се инхибира MTH1, което води до по-нисък IC50 в in vitro теста.

Клетъчният {{0}}oxoG се генерира от ROS, който е антагонизиран от антиоксиданти. По този начин увеличаването на клетъчните ROS или потискането на активността на антиоксидантите също би довело до повишаване на клетъчното ниво на 8-oxoG. Самият ехинакозид е мощен антиоксидант44,45 и по този начин трябва да засили, а не да потисне активността на антиоксидантите. За да се провери дали клетъчното ниво на ROS е променено от лечението с ехинакозид, същите ракови клетки се третират с 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM или 80 μM ехинакозид за 5 часа, 12 часа или 24 часа и след това се анализират чрез поток цитометрия след оцветяване с флуоресцентна сонда 2',7'-дихлорофлуоресцеин диацетат. Резултатите показват, че нито едно от тези лечения не променя клетъчното ниво на ROS (Фигура 2C и D). По този начин повишеното клетъчно ниво на 8-oxoG най-вероятно е резултат от инхибирането на MTH1 от Echinacoside.

Ехинакозидът причинява големи увреждания на ДНК, специално в раковите клетки. Включването на {{0}}oxoG в ДНК ще стимулира BER и MMR, които генерират прекъсвания на едноверижна ДНК (SSB) и пропуски.16,17 Обикновено тези прекъсвания, и празнините се запечатват чрез възстановителни механизми, включващи запълване на празнини и лигиране от ДНК полимерази и лигази. 46, 47 Въпреки това, бързото увеличаване на клетъчния SSB може да насити клетъчния възстановителен капацитет, което води до образуването на многобройни двуверижни скъсвания на ДНК (DSB)18 и DDR сигнализация. За да проверим дали индуцираното от ехинакозид увеличение на клетъчния 8-oxoG причинява увреждане на ДНК, ние изследвахме един от ранните маркери за увреждане на ДНК, 53BP1, който се свързва с местата на DSB като най-ранния клетъчен отговор на DSB.48 MG -63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 ракови клетъчни линии и неракови клетъчни линии човешки нормален черен дроб L-O2,49 човешки ембрионален бъбрек HEK 293 и миши фибробласт NIH /3T3 бяха третирани с 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM или 80 µM ехинакозид за 5 часа, 12 часа или 24 часа. Флуоресцентното имунооцветяване показа, че лечението с 60 μM ехинакозид за 24 часа специфично увеличава броя на клетките с пет или повече силно оцветени ядрени 53BP1 огнища във всички видове рак, но не и в нито една от нераковите клетъчни линии (Фигура 2E и F). Значително увеличение на броя на 53BP1 плюс клетките се наблюдава още 5 часа след започване на лечението с Echinacoside (Фигура 2F). По-висока концентрация (80 μM) на ехинакозид или по-дълго време на лечение (12 часа и 24 часа) доведе до по-големи увеличения както на броя на 53BP1 плюс клетките (Фигура 2F), така и на броя на клетъчните огнища на 53BP1. Заедно тези резултати предполагат, че инхибирането на MTH1 от Echinacoside причинява 8-натрупване на оксо и обширни увреждания на ДНК при рак, но не и в неракови клетки.

Ехинакозидът потиска пролиферацията на раковите клетки

В цикличните клетки неремонтираните разкъсвания на ДНК вериги ще причинят колапс на вилиците за репликация на ДНК, което след това ще доведе до блокиране на клетъчната пролиферация чрез индуциране на спиране на клетъчния цикъл и апоптоза.50 За да проверим ефектите на Echinacoside върху клетъчния растеж и пролиферация, ние първо анализира растежа на третирани с ехинакозид MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 ракови клетки чрез анализ за образуване на колонии. Резултатите показват, че раковите клетки, третирани с 60 µM или 80 µM ехинакозид, образуват много по-малко колонии и образуваните колонии са много по-малки (Фигура 3A и B), което показва силно потиснат потенциал за растеж. След това анализирахме пролиферацията на тези ракови клетки, заедно с L-O2, HEK 293 и NIH/3T3 неракови клетки чрез МТТ анализ. Резултатите показват, че ехинакозидът в зависимост от дозата инхибира пролиферацията на рак, но не и на нераковите клетки (Фигура 3C). Проучване във времето на ракови клетки, третирани с 60 μM ехинакозид, показа, че след 5 часа няма значителна разлика между нелекувани и лекувани групи, но след 12 часа пролиферацията на ракови клетки е значително инхибирана от 60 μM ехинакозид (Фигура 3D).

Спиране на клетъчния цикъл, предизвикано от ехинакозид

В съответствие с наблюденията върху клетъчния растеж и пролиферация, Western blot анализът показа, че 24-часовото лечение с 60 μM и 80 μM Echinacoside значително повишава протеиновото ниво на G1 /S-CDK блокер и инхибитор на синтеза на ДНК p21Cip/ WAF1 в раковите клетки MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 (Фигура 4A и B). Освен това, подобно на 53BP1, значително увеличение на нивото на протеин p21 се наблюдава още 5 часа след започване на лечението с Echinacoside (Фигура 4B). Анализът на броя на клетките на различни етапи от клетъчния цикъл чрез поточна цитометрия разкри, че лечението с ехинакозид дозозависимо намалява процента на клетките както в S, така и в G2 /M фазите, докато процентът на клетките във фазата G1 се увеличава (Фигура 4C и D). След третиране с 80 μM ехинакозид на MG-63 клетки в продължение на 24 часа, клетките във фаза G2/M намаляват от 15 процента до почти нула, а клетките във фаза S намаляват от 37 процента на 17 процента, докато клетките в G0/ 1 фаза се увеличи от 43 процента на 80 процента (Фигура 4E). Тези резултати показват, че лечението с Echinacoside предизвиква спиране на клетъчния цикъл и блокира раковите клетки във фазата G1.

Ехинакозид индуцира апоптоза в раковите клетки

В съответствие с наблюденията върху клетъчната пролиферация, Western blot анализът показа, че лечението с 60 μM и 80 μM ехинакозид за 24 часа повишава нивата на активната каспаза-3 и разцепените поли (ADP-рибоза) полимеразни протеини в раковите клетки (Фигура 5A и B), което предполага индуциране на зависима от каспаза апоптоза. След това изследвахме няколко клетъчни маркера на апоптоза. Първо, ядрената морфология на третирани с ехинакозид ракови клетки беше разкрита чрез оцветяване с ДНК багрилото DAPI, което показа, че 24-часово третиране с 60 μM и 80 μM ехинакозид увеличава броя на отличителните белези на апоптозата, включително пикноза и кондензиран хроматин (по-ярки ядра ) (Фигура 5C). Второ, ДНК, извлечена от подобно третирани ракови клетки, беше анализирана чрез електрофореза върху агарозен гел, което разкри типичен модел на апоптотична стълба (Фигура S1B). И накрая, клетъчно активната каспаза -3 беше открита чрез имунофлуоресцентно оцветяване, което разкри силни активирани каспаза-3 сигнали в третирани с ехинакозид ракови клетки (Фигура S1C). След това процентът на апоптотичните клетки се измерва чрез анексин V-FITC и PI двойно оцветяване и поточна цитометрия. Анализ на клетки, третирани с 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM, 80 µM или 160 µM ехинакозид за 2 часа, 5 часа, 12 часа или 24 часа, показва, че 60 µM или по-високи концентрации на ехинакозид индуцират значителна апоптоза в раковите клетки MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 (Фигура 6A), но не и в нераковите клетки L-O2, HEK 293 и NIH/3T3 (Фигура S2). След третиране на MG-63 клетки с 60 µM, 80 µM или 160 µM ехинакозид за 24 часа, процентът на апоптотичните клетки се повишава съответно от 8,89 процента до 33,72 процента, 39,01 процента и 48,12 процента (Фигура 6А) . Проучването на времевия курс показа, че след 5 часа няма значителна разлика между нелекуваните и лекуваните групи, но се наблюдава значителна апоптоза след лечение с 60 μM или по-високи концентрации на ехинакозид за 12 часа (фигури 6B и S3).

И накрая, измерването на потенциала на митохондриалната мембрана с JC-1 флуоресцентно багрило ясно показва значителна загуба на потенциал на митохондриалната мембрана след третиране с 60 μM ехинакозид за 12 часа (Фигура 6C), но не и след 5 часа, което показва активирането на присъщият път на апоптоза, следващ уврежданията на ДНК, причинени от повишен 8-oxodG.