Първа част|Инхибитор на NF-κB и агонист на AMPK: мрежово прогнозиране и интегриране на мулти-омика за извличане на сигнални пътища за актеозид срещу болестта на Алцхаймер

Първа част|Актеозиди: как да се лекува болестта на Алцхаймер като една от ефективните съставки на Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* и Fei Li1,2 * 1 ключ за състояние Лаборатория по естествени лекарства, Китайски фармацевтичен университет, Нанкин, Китай, 2 колеж по фармация, Медицински университет Синдзян, Урумчи, Китай

Болестта на Алцхаймер (AD) е най-често срещаният тип деменция.Актеозид (ДЕЙСТВАЙ) е съединение, изолирано отCistanche tubulosa, който притежава отлични невропротективни свойства. Въпреки това, основният механизъм наДЕЙСТВАЙв регулирането на поляризацията на микроглията остава неясно дефинирана. Следователно беше създаден изчислителен мрежов модел за идентифициране на движещите цели наДЕЙСТВАЙи предскажете механизма му чрез интегриране на множество налични бази данни. Индуцираният от AlCl3- модел на AD в ларви на риба зебра беше успешно съставен, за да демонстрира терапевтичната ефикасност на ACT. Впоследствие LPS-индуцираните BV-2 клетки разкриха положителната роля на ACT в М1/М2 поляризацията. Пътищата на NF-κB и AMPK бяха допълнително потвърдени чрез транскриптомичен анализ, метаболомичен анализ, техники на молекулярна биология и молекулярно докинг. Изследването предостави инфузивен механизъм на ACT и разкри връзката между метаболизма и поляризацията на микроглията от гледна точка на митохондриалната функция. По-важното е, че той предоставя систематичен и всеобхватен подход за откриване на лекарствени цели, включително промените в гените, метаболитите и протеините.

Ключови думи: актеозид, BV-2 клетки, метаболизъм, RNA-seq, митохондрии, невровъзпаление

За повече информация, моля, свържете се с: ali.ma@wecistanche.com

Кликнете върху Cistanche DHT за памет

ВЪВЕДЕНИЕ

Със застаряването и бързото нарастване на населението броят на случаите на деменция в света показва тенденция на нарастване.Болест на Алцхаймер(AD) е често срещано невродегенеративно заболяване, придружено от когнитивно увреждане и дискинезия (Perea et al., 2020), което е най-честият тип деменция. Характеризира се с тежка загуба на неврони, сенилни плаки и неврофибриларни възли (Shiao et al., 2017). Патогенезата наБолест на Алцхаймере многоизмерен и се свързва с невровъзпалението. Невровъзпалението се задвижва от активирането на глиалните клетки, което е тясно свързано с появата и развитието на AD (Hanslik и Ulland, 2020; Linnerbauer и Rothhammer, 2020). По време на прогресията и екзацербацията на невровъзпалението, микроглията се счита за ключов фактор. Микроглиите са първичните имунни клетки в централната нервна система, които са тясно свързани с каскада от процеси като развитие на мозъка, поддържане на невронната среда, както и реакции при нараняване и възстановяване (Perea et al., 2020). Освен това, микроглията може да бъде стимулирана до M1 фенотип и да увеличи експресията на провъзпалителни цитокини, когато възникнат заболявания, свързани с невровъзпаление, като AD (Tsukahara et al., 2020). Проучванията също така показват, че поляризацията към фенотипа M1 често е придружена от метаболитни нарушения (Li L. et al., 2020), водещи до дисбаланс на енергийния метаболизъм и митохондриална дисфункция (Agrawal and Jha, 2020). Тези неблагоприятни промени са резултат от невродегенерация, дори болестта на Алцхаймер.

Актеозид (ACT), a фенилетаноиден гликозид, се извлича предимно отCistanche tubulosa. Все повече доказателства предполагат, че ACT притежава многобройни фармакологични дейности, включителноневрозащитен(Wei et al., 2019),противовъзпалително(Lai et al., 2019) иантиоксидант(Ji et al., 2019) ефекти. По-специално, доказано е, че Acteoside можеподобряване на ученето и паметтаувреждане, както и регулиране на енергийния метаболизъм при индуцирани от стрептозотоцин плъхове (Chen J. et al., 2020). В допълнение, той може също така да инхибира невроналната апоптотична клетъчна смърт и увреждане на митохондриите при експериментални мишки с автоимунен енцефаломиелит (Li W. et al., 2020). Въпреки това, рядко се съобщава за ефекта на ACT върху поляризацията на микроглия M1 / ​​M2 и неговия механизъм. Досега механизмите като възстановяването на функцията на митохондриите и регулирането на клетъчния метаболизъм са неясни и са необходими допълнителни научни изследвания, за да се изясни точният механизъм.

Целта на настоящия доклад е да изследва терапевтичната ефикасност на ACT, както и основния молекулен механизъм на ACT върху AD. Тук е установен систематичен in silico метод за идентификация на лекарствената цел въз основа на консолидираните бази данни. Ние допълнително изследваме възможните механизми на ACT на молекулярно биологично ниво чрез интегриране на РНК-секвениране (RNA-seq) с метаболомични методи и техники на молекулярна биология. Комбинацията от in silico, in vivo и in vitro стратегии за систематичен скрининг осигурява нов протокол за обективно откриване на многоцелеви съединения на традиционната китайска медицина.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Мрежово моделиране

Четири онлайн платформи бяха комбинирани за прогнозиране и откриване на целите наАктеозид, а именно GeneCards1, ансамбъл подход за сходство (SEA2), SwissTargetPrediction3 и PharmMapper4. Всички генни асоциации на AD бяха независимо събрани от DisGeNET5 и GeneCards. След анализа на взаимодействието между целта и целта, извършен от String база данни6, мрежата беше допълнително интегрирана от софтуера Cytoscape (Версия 3.8.2). Анализът на обогатяване на GO и KEGG беше извършен в базата данни DAVID7 за анотиране и копаене на мрежата.

Групиране на животни и модели

Див тип риба зебра (щам AB, на възраст 4 месеца) бяха избрани в това проучване (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Те бяха поддържани при 14/10-h цикъл светлина/тъмнина при 28◦C, следвайки предишния метод (Li YQ et al., 2020). Всички експерименти с риба зебра бяха проведени под наблюдението на Комитета по етика на животните на Китайския фармацевтичен университет. Ларвите на зебрата бяха разделени на шест групи и третирани от 3 дни след оплождането (dpf) до 7 dpf: контролна група, моделна група, модел плюс донепезил хидрохлорид (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) група и модел плюсАктеозид(HPLC чистота по-голяма или равна на 98 процента, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) групи. Контролната група се поддържа в среда с 0.2 процента DMSO и моделната група се третира със 150 цМ AlCl3 (рН 5,8). Моделът плюс DPZ групата беше третирана съвместно с AlCl3 и 8 цМ DPZ. Моделът плюсАктеозидгрупите бяха третирани съвместно с AlCl3 и различни концентрации на ACT (200, 100 и 50 цМ).

Поведенчески анализ

Движенията на ларвите на зебрата бяха записани от поведенчески анализатор на ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) при 28 ◦C. Накратко, поведенческите параметри и обработката на резултатите бяха в съответствие с метода, който установихме по-рано (Li YQ et al., 2020). Тук средната скорост (AS), промяната на скоростта (1S), скоростта на възстановяване на дискинезия (DRR) и ефективността на реакцията (RE, процент) бяха избрани за оценка на възстановяването на дискинезия при риба зебра.

Определяне на ацетилхолинестеразната и холин ацетилтрансферазната активност

След третиране от 3 до 7 dpf, ларвите на зебрата бяха събрани за измерване на активността на ацетилхолинестераза (AChE) и холин ацетилтрансфераза (ChAT). Въз основа на протокола на производителя активността е открита от комплектите за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай)

Клетъчни култури и лечения

Клетъчна линия BV-2 е закупена от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Съединени щати). Те бяха култивирани в DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Китай). Средата беше допълнена с 10 процента FBS (Gibco, Grand Island, NY, Съединени щати), 100 U/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин, придружени с 95 процента въздух/5 процента CO2 при 37 °C. BV-2 клетките се инкубират с ACT (50, 25 и 12,5 µM) или се стимулират с липополизахарид (LPS, 1 µg/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Съединени щати) в продължение на 24 часа. Клетките се наблюдават под обърнат микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti2, Япония).

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Анализ на комплект за броене на клетки-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Китай) беше използван за оценка на клетъчната жизнеспособност. Накратко, абсорбцията беше измерена при 450 nm с четец на микроплаки (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Съединени щати).

Анализ на производството на азотен оксид

Азотният оксид (NO) се определя чрез измерване на нивата на нитрит в BV-2 супернатантата на културата с помощта на Griess реактив. Накратко, средата (100 µl) се прехвърля в нова 96-плака с ямки, към всяка ямка се добавя същият обем реагент на Griess и се оставя да реагира в продължение на 15 минути на тъмно. Абсорбцията при 540 nm се определя от четец на микроплаки.

Нива на възпалителни цитокини в супернатанта

Концентрациите на TNF-, IL-1 и IL-10 в BV-2 клетъчния супернатант се определят чрез комплекти ELISA съгласно инструкциите на производителя.

Определяне на клетъчния метаболизъм чрез HPLC-Q-TOF-MS анализ

BV{{0}} клетки се посяват в блюдо с шест ямки отделно (n=6/група). След третирането средата се отстранява и клетките се промиват три пъти със студен PBS. След това те веднага бяха изложени на течен азот, за да потиснат клетъчния метаболизъм. Клетките бяха събрани с 8{{30}} процента студен метанол. За да се улесни утаяването на протеини, клетките бяха енергично завихрени за 1 минута и центрофугирани при 13, 000 rpm (15 минути, 4 ° C). Клетъчната суспензия се изсушава под поток от азот. Изсушеният остатък се разтваря в 150 µl предварително охладен 25 процента ацетонитрил. За да се гарантира стабилността и точността на анализа на последователността, всяка клетъчна проба с еднакъв обем (10 µl) се комбинира като проби за качествен контрол. По време на откриването на метаболит, тези проби се инжектират след всеки шест проби, за да се потвърди тяхната стабилност. 1-µl аликвотна част се инжектира за HPLC-Q-TOF-MS. Анализът беше извършен на Agilent 1290 HPLC система, свързана с Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) масспектрометър (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Разделянето беше извършено на колона ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 min × 100 mm, 1.7 µm). Подвижната фаза се състои от 0,1 процента мравчена киселина-вода (v/v; A) и ацетонитрил (B). Съответната скорост беше настроена на 0.4 ml/min със следните условия на оптимално градиентно елуиране: 0 до 2 min, 5 процента В; 2 до 20 минути, 5 до 95 процента B (режим на положителни йони); 0 до 2 минути, 5 процента В; 2 до 20 минути, 5 до 95 процента B (режим на отрицателни йони). Работните параметри на масспектрометъра бяха зададени, както следва: температура на газа, 320 ◦C; изсушаващ газ, 10 L/min; пулверизатор, 35 psi; VCap, 4, 000 V; фрагмент, 120 V. Суровите данни бяха обработени под MassHunter Workstation Software версия B.07.00 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, Съединени щати). Суровите данни бяха предварително обработени от платформата XCMS. Анализ на основните компоненти (PCA) и частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (PLS-DA) на нормализираните данни бяха проведени с MetaboAnalyst8. В комбинация с литературата диференциалните метаболити (VIP > 1, t-тест p <0,05) бяха="" идентифицирани="" на="" hmdb9.="" накрая="" беше="" извършен="" анализ="" на="" пътя="" с="">

Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана

Потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP) беше открит с помощта на FL флуоресцентна сонда JC-1 (Beyotime, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя. Накратко, клетки от различни групи бяха изплакнати с PBS и инкубирани с JC-1 оцветяващ разтвор за 20 минути при 37°C. След оцветяване, клетките се промиват два пъти с помощта на оцветяващ буфер. След това, FL флуоресцентни сигнали бяха открити чрез друга цитометрия (BD Accuri C6).

Измерване на митохондриален аденозин 50 -трифосфат

Концентрацията на аденозин 50 -трифосфат (ATP) в митохондриите беше открита с комплект за анализ на ATP (Beyotime, Китай). Накратко, културалната среда на BV-2 клетки от различни групи беше изхвърлена и клетките бяха хомогенизирани с лизисен буфер върху лед. Супернатантата, получена след центрофугиране (12,000 g, 5 минути) се използва за определяне на концентрацията на АТР. Луминесценцията беше открита от EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Измерване на ниво на вътреклетъчни реактивни кислородни видове

Комплектът за анализ на реактивни кислородни видове (ROS) (Beyotime, Китай) беше използван за измерване на нивата на ROS. Клетките от различни групи се инкубират с DCFH-DA (10 µM) в продължение на 20 минути при 37 °C. След зареждане на сондата, клетките се промиват три пъти с DMEM. След това, FL флуоресцентни сигнали бяха открити чрез друга цитометрия (BD Accuri C6).

Трансмисионна електронна микроскопия

BV{0}} клетки се посяват в блюдо с шест ямки. Средата се отстранява и 1 ml от 2,5 процента глутаралдехид се добавя бързо към всяка ямка. След това клетките бяха събрани и фиксирани с нов 2,5 процента глутаралдехид при 4 °C за една нощ. След фиксиране, дехидратация и вграждане, клетките се наблюдават с трансмисионен електронен микроскоп HT7800 (Hitachi, Токио, Япония).

RNA-Seq и биоинформационен анализ на данни

Общата РНК от BV-2 клетки се екстрахира с помощта на реагент Trizol (Vazyme Biotech, Китай). Всички аналитични проби бяха изпратени до Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) за анализ на РНК последователността. Данните са анализирани на онлайн платформата на Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 беше използван за количествено определяне на изобилието на ген. По същество, диференциално изразяване

анализът е извършен с помощта на DESeq2/DEGseq/EdgeR с Q стойност, по-малка или равна на 0.05; DEG с|log2FC| > 1 и Q стойност По-малко или равно на 0.05 (DESeq2 или EdgeR)/Q стойност По-малко или равно на 0,001 (DEGseq) се считат за значително различни експресирани гени. В допълнение, бяха извършени анализи на функционално обогатяване, включително GO и KEGG, за да се идентифицират кои DEGs са значително обогатени в GO термини и пътища при p-стойност, коригирана с Bonferroni, по-малка или равна на 0, 05 в сравнение с фона на целия транскриптом. Оригиналните данни за последователността са изпратени в базата данни на NCBI Sequence Read Archive.

Количествена полимеразна верижна реакция в реално време

Общата РНК на BV{0}} клетки беше събрана с помощта на RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Китай) и реакцията на обратна транскрипция беше проведена с FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Китай). Реакциите се извършват съгласно протокола на производителя. cDNA беше подложена на количествени анализи на полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR) със специфични праймери и TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Китай). Праймерите са изброени в допълнителна таблица 1 и -актинът е използван като вътрешен контрол. Методът 22 1 1 CT беше използван за количествен анализ.

Уестърн блот анализ

BV-2 клетките бяха лизирани от RIPA лизисен буфер (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Китай), съдържащ 1% коктейл от протеазен инхибитор (Thermo Fisher), за да се получи общ протеин. Протеините бяха разделени с 10 процента SDS-PAGE и прехвърлени към NC мембрани. След блокиране с 5 процента обезмаслено мляко/BSA, мембраните се инкубират с AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal) или GAPDH (ABclonal) антитела в 5 процента TBST при 4°C за една нощ. Мембраните се инкубират с вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (ABclonal) при стайна температура в продължение на 1 час. Субстратът ECL Western blotting с висок знак (Tanon, Китай), системата за гел изображения (Tanon, Китай) и софтуерът ImageJ бяха използвани за визуализация и количествено определяне.

Молекулярен докинг

Молекулярният докинг анализ беше извършен с помощта на софтуер Autodock (Версия 4.2). Афинитетът между ACT и протеините се наблюдава от софтуера AutodockTools. Триизмерните (3D) протеинови структури на AMPK (PDB ID: 5g5j) и NF-κB (PDB ID: 4q3j) бяха извлечени от Protein Data Bank12.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средно ± стандартно отклонение и са анализирани от GraphPad Prism Software (Версия 8.0.1). Разликите между групите бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от теста за множествено сравнение на Tukey. p < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

РЕЗУЛТАТИ

ACT-AD е насочена към мрежа за взаимодействие и прогнозиране на пътя

Чрез консолидирането на множество бази данни бяха получени 253 цели на ACT, докато бяха събрани общо 1697 цели, свързани с AD. След картографиране на целевата мрежа, общо 70 цели бяха абсорбирани в мрежата за целево взаимодействие ACT-AD (Фигура 1А). Анализът на обогатяване на KEGG предполага, че ACT може да има широкоспектърен и многоцелеви ефект (Фигура 1B). Той също така предполага, че ACT има множество пътища, целеви точки и елементи в лечението на AD. Класифицирайте тези пътища, за да получите точна интерпретация на механизмите. ACT може главно да корелира със сигналната трансдукция, ендокринната система, имунната система и клетъчния растеж и смъртта, за да играе конфронтационна роля срещу AD (Фигура 1C). Струва си да се отбележи, че по-голямата част от тези пътища са свързани с възпалителни реакции. Спекулира се, че противовъзпалителното действие на ACT може да бъде неделима част от неговата конфронтационна роля срещу AD.

ACT облекчи дискинезията и подобри функцията на холинергичната система в ларвите на AD Zebrafish

За проверка на мрежовия модел беше използван моделът на AD, индуциран от AlCl3- в ларви на риба зебра, за да се демонстрира ефектът от ACT. Наблюдавано е движението на ларвите на зебрата в рамките на циклите светлина/тъмнина и техните пътеки за плуване са записани (Фигура 1D). Резултатите показват, че ACT ефективно повишава AS и 1S на рибката зебра и синергичният ефект се увеличава с увеличаването на дозите (Фигура 1E). DRR и RE разкриха по-интуитивно сравнение на ACT и DPZ (Фигура 1F). Съответно, ACT облекчава дискинезията, проявявайки подобни ефекти като DPZ. Общоприето е, че холинергичната система играе важна роля в процесите на учене и памет. По този начин дейностите на AChE и ChAT бяха използвани за разкриване на ефекта на ACT. Излагането на AlCl3 в риба зебра беше изобразено с мозъчна холинергична промяна (Фигура 1G). Важно е, че лечението с ACT потиска активността на AChE. В допълнение, активността на ChAT показва намаление след лечение с ACT. Следователно, ACT показа дълбоко въздействие върху AlCl3-индуцирани AD ларви на риба зебра.

ACT потиска M1 поляризацията и насърчава M2 поляризацията в LPS-индуцирани BV-2 клетки

За по-нататъшно потвърждаване на мрежата, противовъзпалителният ефект на ACT беше изследван in vitro с помощта на BV-2 микроглиални клетки. След третиране с LPS в продължение на 24 часа, жизнеспособността на BV-2 клетки намалява значително. За щастие, ACT повишава клетъчната жизнеспособност на LPS-индуцирани BV-2 клетки (Фигура 2А). Освен това се наблюдава морфологията на BV-2 клетките. След 24 часа LPS стимулация, това показа, че BV-2 клетките са претърпели M1 поляризационно състояние. Морфологичните промени бяха предотвратени чрез съвместно лечение с ACT (Фигура 2В).

Освен това, резултатите показват, че за разлика от BV-2 клетките, стимулирани от LPS, BV-2 клетките, третирани съвместно с ACT, значително потискат TNF-, IL-1 и NO (Фигура 2C) експресии в клетъчния супернатант. Това са класически провъзпалителни цитокини като индикатори за M1 поляризация на микроглия. Подобно на резултатите от ELISA, резултатите от qPCR откриха, че TNF-, азотен оксид синтаза (iNOS), IL-1 и CD86 mRNA експресии са значително инхибирани от ACT лечение в сравнение с LPS групата (Фигура 2D). Освен това, ние измерихме нивото на поляризация на M2 микроглия чрез ELISA (Фигура 2C) и qPCR (Фигура 2E) и резултатите показват, че ACT значително повишава нивата на експресия на свързания с микроглия M2 маркер (IL-10, CD206, TGF- и Arg-1). С една дума, тези резултати показаха товаДЕЙСТВАЙпотиска M1 поляризацията на микроглията и насърчава M2 фенотипа.

ACT регулирана M1/M2 поляризация чрез инхибиране на NF-κB пътя

Транскриптомният анализ беше извършен от RNA-seq за изследване на механизма на ACT в BV-2 клетки от цялостно ниво. PCA илюстрира, че контролните, LPS и ACT групите могат да бъдат добре разграничени (Фигура 3A). Той разкрива 899 диференциално експресирани гени (DEG) между контролната група и LPS групата и 49 DEG между LPS групата и ACT групата (Фигура 3B). Последователно анализът на обогатяване на GO (Фигура 3C) и KEGG (Фигура 3D) разкри, че ефектът на ACT е включен в пътя на NF-κB. Наборът от гени, свързани с пътя на NF-κB, беше допълнително потвърден и тяхната хомеостаза със сигурност беше повлияна от LPS. Както се очакваше, ACT значително повлия на техните изрази (Фигура 3E). Пътят на NF-κB е класически път за регулиране на прогресията на възпалението, което в крайна сметка води до освобождаване на провъзпалителни фактори. За да се получи механична подкрепа, ключовият протеин на NF-кВ пътя беше оценен чрез Western blot. Стимулирането на LPS доведе до активиране на NF-κB, свързано с насърчаване на M1 поляризацията. В съответствие с RNA-seq анализа, ACT инхибира LPS-стимулираното NF-кВ фосфорилиране (Фигура 3F). Следователно, ACT може да облекчи LPS-индуцираната M1 поляризация чрез NF-κB пътя в BV-2 клетки.

ACT Нарушен биосинтез на аргинин, както и биосинтез на пантотенат и CoA

Мрежовото прогнозиране на ACT разкрива, че е свързано с метаболизма на аргинин (Arg) и пролин (Фигура 1B). RNA seq демонстрира, че пътищата, засегнати от ACT, също включват биосинтеза на Arg, както и биосинтеза на пантотенат и CoA (Фигура 3D). Предполага се, че нарушенията на метаболизма на BV-2 клетките, индуцирани от LPS стимулация, са свързани с М1 поляризация (Orihuela et al., 2016). По този начин, ненасочен клетъчен метаболом чрез HPLC-Q-TOF-MS беше използван за идентифициране на ефекта на ACT върху клетъчния метаболизъм. PCA и PLS-DA (Фигура 3G) показват, че контролните, LPS и ACT групите могат да бъдат добре разграничени въз основа на вътреклетъчни метаболити. Нивата на различни метаболити в LPS-индуцирани BV-2 клетки бяха променени след лечение с ACT (Фигура 3H). В сравнение с контролната група, имаше 11 метаболита, които се промениха значително в групата на LPS (допълнителна таблица 2), докато 14 метаболита бяха отчетливо променени след лечението на ACT (допълнителна таблица 3), включвайки 11 метаболитни пътя (Фигура 3I). Ефектът на ACT се състои главно в регулиране на метаболизма на аминокиселините, метаболизма на нуклеотидите, енергийния метаболизъм и метаболизма на кофакторите и витамините. Интересното е, че метаболитните пътища, получени от метаболома, са в съответствие с прогнозирането на мрежата и RNA-seq, включително биосинтеза на Arg, както и биосинтеза на пантотенат и CoA. Горното показва, че ACT може да регулира биосинтезата на Arg, както и биосинтезата на пантотенат и CoA в LPS-стимулирани BV- 2 клетки.

ДЕЙСТВАЙСмекчена LPS-индуцирана BV-2 митохондриална дисфункция

Митохондриите са в основата на метаболитните пътища. Развиващите се доказателства показват, че митохондриите са ключов играч в микроглиалната М1/М2 поляризация. Преглед на статуса на митохондриите в морфологията и разпределението на клетките беше оценен чрез ТЕМ. След LPS стимулация, хроматинът на BV-2 клетките беше кондензиран и цитоплазмата и митохондриите бяха намалени (Фигура 4А). В допълнение, митохондриалните кристи на LPS групата са били разстроени или дори изчезнали, показвайки частична кристолиза, намаляване на размера и морфология с кръгла форма. Интересно е, че ACT лечението може да облекчи индуцираните от LPS морфологични промени в митохондриите. На свой ред, ние изследвахме функцията на митохондриите на третирани с LPS BV-2 клетки, включително производството на MMP и ATP. Производството на MMP (Фигура 4B) и ATP в митохондриите (Фигура 4C) е значително подобрено в групата на ACT в сравнение с тези в групата на LPS. Митохондриалната дисфункция може да бъде свързана с повишеното ниво на ROS в клетката. Анализът на поточната цитометрия разкрива, че съдържанието на ROS е претоварено в LPS групата (Фигура 4D). За щастие, ACT елиминира прекомерния ROS. Това предполага, че ACT може да възстанови функцията на митохондриите чрез изчистване на ROS.

ACT възстановява функцията на митохондриите чрез регулиране нагоре на PGC-1 и UCP-2

Пероксизомен пролиферативно-активиран рецептор-ко-активатор-1 (PGC-1) играе важна роля в митохондриалната биогенеза (Bi et al., 2019). Стимулирането на LPS намалява експресията на PGC-1, проявявайки митохондриална дисфункция. Забележително е, че иРНК и протеиновата експресия на PGC-1 гена бяха значително обърнати чрез ACT лечение в третирани с LPS BV-2 клетки (Фигура 4E).

Известно е също, че протеинът за разединяване на митохондриите-2 (UCP-2) регулира митохондриалната функция. Като протеин надолу по веригата на PGC-1, той може да контролира LPS-индуцираната MMP деполяризация и производството на ROS. Последните доклади показват, че той е централен за процеса на микроглиална активация, с противоположна регулация на M1 и M2 поляризацията (De Simone et al., 2015). Резултатите от Western blot показват, че нивото на UCP-2 протеин е намалено след LPS стимулация. Съвместното лечение на LPS и ACT може да повиши експресията на UCP-2 в сравнение с лечението с LPS. Нивото на експресия на иРНК на UCP-2 също показва подобни промени (Фигура 4F). За да обобщим, ACT възстанови функцията на митохондриите чрез регулиране нагоре на PGC-1 и UCP-2.

ACT Репресирана микроглия M1

Поляризация чрез AMPK активиране

Като ключов сензор за клетъчна енергия, AMP-активираната протеин киназа (AMPK) играе важна роля в поддържането на баланса на клетъчния метаболизъм. В същото време PGC-1 е протеин надолу по веригата на AMPK. Както е показано в анализа на мрежовия модел,ДЕЙСТВАЙможе да регулира пътя на AMPK (Фигура 1B). Резултатите разкриха, че LPS инхибира активирането на AMPK, което води до нарушения на клетъчния метаболизъм и митохондриална дисфункция. Трябва да се отбележи, че ACT може в зависимост от дозата да увеличи протеиновата експресия на p-AMPK (Фигура 5А). Предполага се, че ACT може да повиши експресията на PGC-1 и да възстанови митохондриалната функция чрез активиране на AMPK сигналния път. В това проучване, за да се изследва дали активирането на AMPK е допринесло за регулиращия ефект наДЕЙСТВАЙвърху М1/М2 поляризацията, съединение С (СС) се използва за инхибиране на ефекта на AMPK. За разлика от пониженото ниво на NO в групата на лечение с ACT, CC частично блокира ефекта на ACT върху нивото на NO (Фигура 5B). Въз основа на тези резултати, ACT може да регулира M1/M2 поляризацията на BV-2 клетки чрез активиране на AMPK.

ДЕЙСТВАЙСвързване към и инхибиран NF-κB, както и активиран AMPK

Приложено е молекулярно докинг, за да се потвърди дали ACT се свързва с NF-кВ и AMPK протеините. Констатациите показват, че енергията на свързване наДЕЙСТВАЙи NF-κB беше -8.4 kcal/mol, докато този наДЕЙСТВАЙи AMPK беше -10,8 kcal/mol. Значителни афинитети потвърждават, че ACT е свързан директно с NF-кВ и AMPK (Фигури 5C, D, F, G). Впоследствие възможните режими на свързване и взаимодействията в аминокиселинните джобове бяха допълнително проучени, включително 11 аминокиселинни остатъка на NF-кВ (Фигура 5E), както и 12 аминокиселинни остатъка на AMPK (Фигура 5H). Тези резултати показват, че ACT може директно да повлияе на NF-κB и AMPK, за да намали M1 поляризацията на BV-2 микроглия и да насърчи M2 фенотипа.