Ехинакозидът забавя клетъчното стареене на човешките фибробластни клетки MRC-5

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Активната съставка на Cistanche: Как действа ехинакозидът против стареене?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

В това проучване бяха изследвани ефектите на ехинакозида, един от фенилетаноидите, изолиран от стъблата на Cistanches salsa, китайско традиционно билково лекарство, върху белодробни фибробластни MRC-5 клетки на човешки ембрион. Активността на клетъчната пролиферация беше оценена с Alamar Blue, което показва, че лечението с ехинакозид може да забави стареенето. Резултатите от поточната цитометрия показват, че ехинакозидът може да задейства клетките във фазата G1 да навлязат в фазата S и фазата G2 и може да подобри разграждането на ROS. Резултатите от кометния анализ показват, че ехинакозидът може да защити клетките от увреждане на ДНК, като частично изяснява механизма на неговите ефекти. Всички горепосочени резултати предполагат, че ехинакозидът има потенциална активност против стареене.

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Нормалните клетки, култивирани in vitro, пролиферират за ограничен брой удвоявания на популацията („лимитът на Hayflflick“) и навлизат в етап на репликативно стареене. Стареещите клетки претърпяват спиране на клетъчния растеж във фазата G1 и промяна в морфологията и метаболизма, включително клетъчно уголемяване, повишена лизозомна биогенеза и експресия на по-висока -галактозидазна активност при pH 6 (свързана със стареенето -галактозидаза, SA- - -Gal ) (Hayflflick и Moorhead 1961; Dimri 1995). Натрупването на стареещи клетки прогнозира свързания с възрастта спад втъкан/органфункции. За да получите достъп до начина за забавяне или обръщане на стареенето, усилията за откриване на активни вещества против стареене никога не са спирали.Ехинакозиде един от фенилетаноидите, изолиран от стъблата наCistanches салса, китайско традиционно билково лекарство, което има потенциална биологична активност както като антисерум, така и като антисеруманти умораагент (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Съобщава се също, че ин витро се държи като мощенБезплатнорадикаленчистач(Facino et al. 1995) и експонатиневрозащитендейностиin vitro и in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Ехинакозидът може да бъде кандидат за вещество против стареене, а активността против стареене може да бъде едно от неговите биологични свойства. По този начин ние третирахме старееща белодробна фибробластна клетъчна линия на човешки ембрион MRC-5 с ехинакозид, очаквайки, че той може да забави или да обърне стареенето.

2. Изследвания и резултати

Първо, добавихме ехинакозид в културалната среда, за да проверим влиянието му върху клетъчния растеж и клетъчните цикли. Беше наблюдавано, че жизнеспособността на клетките с 48-часово излагане на ехинакозид се увеличи очевидно спрямо контролата, тъй като концентрацията се увеличи (Фигура 1А), което показва, че ехинакозидът помага на стареещите клетки да пролиферират. Резултатът от SA-Gal оцветяването показа, че нивото на SA--Gal е намаляло очевидно след третиране с ехинакозид (данните не са показани), което предполага, че част от стареещите клетки са били обърнати от стареенето. За да се потвърди дали стареещите клетки наистина са били подтикнати да пролиферират от ехинакозид, беше въведена друга цитометрия, за да се провери фазовата промяна на клетъчния цикъл на стареещите MRC-5 клетки след третиране с ехинакозид. В нашето изследване наблюдавахме, че с увеличаване на концентрацията на ехинакозид, съотношението на клетките в периода G1 намалява постепенно. Напротив, повече клетки бяха принудени да навлязат в S фазата и G2 фазата (фиг. 1B). Натрупването на свързани със стареенето хетерохроматинови огнища (SAHF) е друг специфичен биомаркер на стареещите клетки (Shay and Wright 2001). Стареещите клетки показват прекъснати ДНК фокуси, които се визуализират чрез оцветяване на Hoechst (фиг. 1C). Обратно, MRC-5 клетките, третирани с ехинакозид, изглежда имат по-малко SAHF.

Нивото на реактивни кислородни видове (ROS) се увеличава, когато клетките се доближат до границата на Hayflflick (Hutter et al. 2002). Продължителното третиране на клетки със сублетални нива на ROS не само повишава нивото на продуктите от окислително увреждане като липофусцин (Sitte et al. 2001), но също така причинява трайно спиране на растежа, придружено от активирането на p53-инхибитора на растежа път (Toussaint et al. 2000). Следователно, на клетъчно ниво ROS играе ключова роля в предизвикването на стареене. FL флуоресцентното багрило DCFH-DA се използва за измерване на съдържанието на ROS с друга цитометрия. Беше показано, че в сравнение с контролата, съдържанието на ROS е намалено очевидно в клетки, инкубирани с ехинакозид (фиг. 2А). Тези резултати показват, чеехинакозидможе да действа като антиоксидант, намалявайки производството на ROS или ускорявайки отстраняването на ROS.

Натрупаните реактивни кислородни видове (ROS) причиняват забележително увреждане на макромолекулите в клетките, включително протеини, ДНК и теломери (Kovtun et al. 2007). Окислителните увреждания на ДНК предизвикват p53-зависимо спиране на растежа на G1, следвайки експресията на p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) и клетъчно стареене в нормални човешки фибробласти. Използвахме кометен анализ, за ​​да измерим увреждането на ДНК и нейното възстановяване. Размерът на ДНК фрагментите и броят на прекъсванията определят миграцията и модела на наблюдаваната комета. Съдържанието на ДНК на опашката (продукт на дължината на опашката и съдържанието на ДНК на опашката) се увеличава с увреждане. Нашите резултати показват, че предварителната обработка с ехинакозид може частично да насърчи възстановяването на увреждането на ДНК, поне да защити клетките от ДНК лезии, причинени от H2O2 (фиг. 2B). Въз основа на тези факти заключаваме, че ехинакозидът има активност против стареене поне в MRC-5 клетки. Резултатите от нашето проучване показват, че ехинакозидът може да намали натрупването на ROS, да защити клетките от увреждане на ДНК, да насърчи MRC-5 клетките от G1 фазата в S и G2 фазите и по този начин да подобри пролиферацията на клетките. Най-общо казано, ефектите на ехинакозида върху MRC-5 клетките могат да бъдат разделени на два аспекта: насърчаване на клетъчната пролиферация и намаляване на натрупването на ROS. Въпреки че точният механизъм на стареене на клетките все още е неизвестен и мрежата от регулиране на клетъчния цикъл остава спорна, ние показахме, че ехинакозидът може да защити клетките от окислително увреждане. Следователно ние спекулираме с товаехинакозидможе да бъде добър кандидат за регулиране на стареенето, въпреки че точният основен механизъм остава открит въпрос и се провеждат допълнителни проучвания.

3. Експериментален

3.1. Клетъчна култура и лечение

Белодробна фибробластна клетъчна линия на човешки ембрион MRC{{0}} (Институт по биохимия и клетъчна биология, SIBS, CAS) се поддържа в модифицирана минимална основна среда (Gibco/BRL) и се допълва с 10 процента фетален говежди серум. MRC-5 клетките претърпяват репликативно стареене след множество клетъчни пасажи, оценено чрез забавяне на метаболизма и спиране на деленето в рамките на 7 дни. Всички култури се посяват при клетъчна плътност от 104/cm2, освен ако не е отбелязано друго, и се оставят да пролиферират, необезпокоявани, в продължение на 7 дни. Различни концентрации на ехинакозид бяха добавени 48 часа преди изследването с разтворител като контрола, освен ако не е посочено друго. Концентрацията на DMSO в културите е по-малка от 0,3 процента (v/v). За третиране с H2O2 клетките се индуцират с 250 М H2O2 в продължение на 12 часа.

3.2. Анализ на степента на преживяемост

Клетките се култивират и третират с ехинакозид върху 96-ямкови плаки. Преди откриването, 10 процента Alamar BlueTM се добавя към средата и се инкубира в продължение на 4 часа. Абсорбцията се измерва със спектрофотометър.

3.3. Анализ с поточна цитометрия

Беше въведена поточна цитометрия за измерване на съдържанието на ДНК и вътреклетъчните нива на ROS, като се използва съответно пропидиев йодид и DCFH-DA. Клетките се посяват при плътност от 1 0 5 клетки/10 ml клетъчен разтвор в панички с диаметър 100 mm и се допълват с ехинакозид за 48 часа след клетъчно засяване. След 48 h третиране, клетките се събират и се промиват в PBS след центрофугиране, след това се ресуспендират в PBS разтвор с 0.1 процента РНКаза и 50 g/ml пропидиев йодид или културална среда, съдържаща 10 М DCFH-DA за 30 минути. След това съдържанието на ДНК или ROS се определя чрез FL флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране на Beckman Coulter Flow Cytometry System. Данните бяха анализирани от софтуера MultiCycle.

3.4. Оцветяване по Hoechst

Клетките се култивират и се третират с ехинакозид в продължение на 48 часа върху 96-ямкова плака. Средата се отстранява, клетките се промиват с PBS, след това се фиксират с 4% формалдехид в PBS за 20 минути, последвано от промиване с PBS веднъж и се оцветяват с багрило Hoechst за 10 минути. Снимките бяха заснети.

3.5. Едноклетъчна гел електрофореза (кометен анализ)

Кометният анализ беше проведен, както беше докладвано (Olive and Banath 2006). Индивидуалните изображения на комети бяха анализирани със софтуера CometScore. Благодарност: Тази работа беше подкрепена финансово от Националната програма за фундаментални изследвания (973 проект) на Китай (№ 2007CB507406), Националната природонаучна фондация на Китай (№ 30572341) и Фонда за медицински науки Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).