EDS1-взаимодействащият J протеин 1 е основен отрицателен регулатор на вродения имунитет на растенията при Arabidopsis

Резюме

Растенията са разработили точни механизми за оптимизиране на имунния отговор срещу патогени. ПОВИШЕНА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ КЪМ ЗАБОЛЯВАНИЯ 1 (EDS1) играе жизненоважна роля във вродения имунитет на растенията чрез регулиране на базалната резистентност и имунитета, предизвикан от ефектора. Нуклеоцитоплазменият трафик на EDS1 е необходим за подсилване на резистентността, но молекулярният механизъм остава неуловим. Тук показваме, че EDS1-INTERACTING J PROTEIN1 (EIJ1), който действа като DnaJ протеин-подобен шаперон в отговор на патогенна инфекция, функционира като основен отрицателен регулатор на растителния имунитет чрез взаимодействие с EDS1. Мутацията на загуба на функция на EIJ1 не повлиява растежа на растенията, но значително повишава устойчивостта на патогени. При заразяване с патоген, EIJ1 се премества от хлоропласта в цитоплазмата, където взаимодейства с EDS1, като по този начин ограничава трафика на EDS1, предизвикан от патогени, към ядрото и компрометира резистентността на ранен етап на инфекция. По време на развитието на заболяването EIJ1 постепенно се разгражда, позволявайки ядреното натрупване на EDS1 за подсилване на резистентността към транскрипция. Авирулентният щам Pst DC3000 (AvrRps4) премахна репресивното действие на EIJ1 чрез бързо индуциране на неговото разграждане в предизвикания от ефектора имунен отговор. По този начин нашите открития показват, че EIJ1 е основен EDS1-зависим отрицателен регулатор на вродения растителен имунитет и осигурява механично разбиране за това как ядреното спрямо цитоплазменото разпределение на EDS1 се регулира по време на имунния отговор.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

Въведение

Растенията са развили сложна мрежа, за да модулират своите имунни отговори. За да се защитят срещу патогени, растенията използват две основни регулаторни стратегии: имунитет, задействан от модел (PTI) и имунитет, задействан от ефектор (ETI). PTI се управлява от рецептори за разпознаване на образи (PRR), които разпознават молекулярни модели, свързани с патогени или микроби (Zipfel, 2008). За да улеснят инфекцията, вирулентните патогени потискат PTI чрез секретиране на патогенни ефектори и те манипулират клетките гостоприемници, за да улеснят придобиването на хранителни вещества и в крайна сметка възпроизвеждането (Tsuda and Katagiri, 2010). Ниското ниво на резистентност, което растението проявява към тези вирулентни патогени, се нарича базална резистентност (Jones and Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). От друга страна, ETI се медиира от растително кодирани протеини за устойчивост на болести (R), които могат директно или косвено да разпознаят присъствието на ефектори, секретирани от патогени (Tsuda и Katagiri, 2010). Повечето R протеини съдържат нуклеотидно-свързващо място и богат на левцин повтарящ се домен (NB-LRR). NB-LRR протеините, които съдържат N-терминален Toll/интерлевкин-1 рецептор (TIR) ​​домейн на взаимодействие протеин-протеин, са известни като TIR-NB-LRR (TNL) протеини и те съставляват най-голямата група от NB- LRR протеини (Caplan et al., 2008). В сравнение с базалната резистентност, ETI предизвиква по-силен и по-бърз защитен отговор срещу патогени и често е придружен от локална клетъчна смърт, характерна черта на свръхчувствителния отговор (HR; Dodds and Rathjen, 2010). ПОВИШЕНА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ КЪМ ЗАБОЛЯВАНИЯ 1 (EDS1), централен регулатор на растителния имунитет, помага да се контролира базалната резистентност чрез ограничаване на инвазията на биотрофни и хемибиотрофни патогени (Wiermer et al., 2005). EDS1 също играе важна роля в ETI, който се медиира главно от TNL класа на R протеини (Heidrich et al., 2012). EDS1 работи в тясно сътрудничество със своите корегулатори PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 и GENE 101, СВЪРЗАН С СТАРЕЕТО, в цитоплазмата и/или ядрото, за да регулира производството на вътреклетъчни реактивни кислородни видове (ROS), натрупването на салицилова киселина (SA) и други процеси, като по този начин засилва устойчивостта на патогени (Ruste ´rucci et al., 2001; Rietz et al., 2011; Wagner et al., 2013). Съответно, мутантът Arabidopsis eds1 е силно податлив на Pseudomonas syringae pv. доматен (Pst) щам DC3000 и показва компрометирана TNL-медиирана ETI, при която експресията на ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1; SA биосинтетичен ген) и биосинтезата на SA са инхибирани (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al. др., 2006). Освен това, EDS1 проявява трафик на протеини между цитоплазмата и ядрото, медииран от рецептори за ядрен транспорт (Garcı´a et al., 2010). Въпреки че ядрените функции на EDS1 включват базална резистентност и производство на ROS, програмираната клетъчна смърт и подсилването на резистентността изискват координиране на ядрената спрямо цитоплазмената локализация на EDS1 (Heidrich et al., 2011). Балансът между количеството EDS1 в цитозола и количеството в ядрото е важен за ефективната базална резистентност и имунитета, предизвикан от TNL (Garcı´a et al., 2010). Въпреки това, как EDS1 поддържа модела на нуклеоцитоплазменото разпределение по време на вродените имунни отговори на растенията остава неясно. DnaJ протеините (или J протеините) са протеини-шаперони (Pulido and Leister, 2018), които принадлежат към суперсемейството на домейни, богати на цистеин (Cys), и участват в сгъването и сглобяването на зараждащи се протеини, транспортирането на протеини през мембрани с последващо повторно нагъване и изхвърляне на разгънати или дефектни протеини (Bukau et al., 2006). Тези процеси са необходими за нормалната функция на повечето клетъчни протеини на различни етапи на развитие (Pulido and Leister, 2018). Изследвания в различни организми показват, че DnaJ протеините също играят различни роли в биотични и абиотични реакции на стрес, особено в имунни отговори. В Nicotiana benthamiana, DnaJ протеин Nb-MIP1 функционира като кохаперон в отговор на вирусни патогени (Du et al., 2013). Соевият (Glycine max L.) Gm-протеин на топлинен шок 40 (HSP40.1), локализиран в ядрото DnaJ протеин, е положителен регулатор на резистентност към вируса на соевата мозайка (Liu and Whitham, 2013). При доматите (Solanum lycopersicum) се съобщава, че локализираният в хлоропласт DnaJ протеин, Le-CDJ2, подобрява устойчивостта към бактериалния патоген, Pseudomonas solanacearum (Wang et al., 2014). В допълнение, Tsi1- взаимодействащ протеин1 (Tsip1), тютюнев (Nicotiana tabacum) DnaJ протеин, се съобщава, че регулира Tsi1-медиирана транскрипционна активация в отговор на стрес (Ham et al., 2006). Тези резултати показват ясно, че DnaJ протеините играят важна роля в растителния имунитет, въпреки че основните механизми изискват допълнително изследване. В това проучване ние изолирахме Arabidopsis thaliana EDS1 ВЗАИМОДЕЙСТВУВАЩ J PROTEIN 1 (EIJ1), HSP40-подобен DnaJ протеин, и показахме, че EIJ1 взаимодейства с EDS1 в planta. Мутантните растения със загуба на функция eij1 показват нормален растеж, по-силна резистентност към патогени и по-висока експресия на свързани с резистентност гени при инфекция от патогени в сравнение с растения от див тип. Въпреки това, мутацията на загуба на функция на EIJ1 не спаси чувствителния фенотип на eds1 мутанта при заразяване с Pst DC3000. Освен това протеинът EIJ1, който обикновено се локализира в хлоропласта, се освобождава от хлоропласта в цитоплазмата при инокулиране на патоген, където взаимодейства с EDS1, като по този начин предотвратява неговия предизвикан от патогена трафик към ядрото и следователно компрометира реакцията на резистентност в ранен етап етап на инфекция. Тези констатации изясняват важни детайли на регулаторния механизъм, лежащ в основата на модела на нуклеоцитоплазмено разпределение на EDS1 и осигуряват потенциално ефективна цел за развъждане на резистентни към болести култури.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

Резултати

EIJ1 взаимодейства с EDS1 in vitro и in vivo

Като основен компонент на защитните реакции на растенията, EDS1 се намира в ключов възел на мрежата за сигнализиране на вроден имунитет на растението. За да идентифицираме потенциални взаимодействащи протеинови партньори на EDS1, ние извършихме двухибриден скрининг на дрожди. EDS1 показа силно взаимодействие с Arabidopsis HSP40- подобен на шаперонов протеин (AT2G24860) с неизвестна функция (Фигура 1, A и B), принадлежащ към суперсемейството DnaJ (допълнителна фигура 1A); този протеин по-нататък се нарича EIJ1. Анализът на последователността показа, че EIJ1 съдържа 144 аминокиселинни остатъка, включително четири богати на Cys Zn пръстови мотива (CXXCXGXG; допълнителна фигура 1A). Въпреки че други видове покритосеменни имат хомолози на EIJ1, най-близките хомолози изглежда са ограничени до Brassicaceae (допълнителна фигура 1B и файл S1). По-специално, EIJ1 показа сходство на последователността с протеина N. tabacum Tsip1, който участва в резистентността на патогена (допълнителна фигура 1B; Ham et al., 2006). За идентифициране на функционалните домейни, отговорни за взаимодействието между EDS1 и EIJ1, две пресечени версии на тези протеини бяха използвани в двухибридни анализи на дрожди (Фигура 1А; Допълнителна фигура 1А). N краят на EIJ1 показа силно взаимодействие с EDS1 в пълна дължина, както и EDS1 N края, но слабо взаимодействие с EDS1 C края (Фигура 1B). Това предполага, че N краят на EDS1, съдържащ липазоподобен домен, и N краят на EIJ1 са необходими и достатъчни за тяхното взаимодействие. Въпреки че C краят на EIJ1 съдържа запазен Cys-богат Zn пръстов домейн, който може да улесни свързването му с ДНК или други протеини, той не допринася за взаимодействието с EDS1. Изтеглящите анализи допълнително потвърдиха взаимодействието между EDS1 и EIJ1 in vitro (Фигура 1C), докато анализите на ко-имунопреципитация (Co-IP) използваха 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG трансгенни растения потвърди тяхното взаимодействие в planta (Фигура 1D). Взети заедно, тези резултати показват, че EDS1 взаимодейства с EIJ1 както in vitro, така и in vivo. Характеризиране на EIJ1 За да определим субклетъчната локализация на EIJ1, ние сляхме отворената четяща рамка на EIJ1 с репортерния ген mCherry под контрола на 35S промотора на мозаечния вирус на карфиола, за да генерираме конструкцията 35Spro: EIJ1-mCherry. Тази конструкция се трансформира временно в листата на N. benthamiana чрез агроинфилтрация. Флуоресцентната микроскопия показа, че EIJ1-mCherry е локализиран както в хлоропласта, така и в ядрото (Фигура 2А). Този модел на локализация беше потвърден чрез имуноблот анализ на трансгенни 35Spro: EIJ1-6HA растения (допълнителна фигура 2). За да се изследва моделът на експресия на EIJ1, геномната последователност на EIJ1 беше слята с репортерния ген на ß-глюкуронидаза (GUS), за да се генерират EIJ1pro: EIJ1-GUS трансгенни линии на Arabidopsis. Силна GUS активност беше открита в розетъчни листа и корени; активността на GUS обаче е слаба в силикатите и неоткриваема в стъблата и цветята (Фигура 2B). Тези резултати са в съответствие с резултатите от експресията за EIJ1, който е изследван чрез количествена обратна транскрипция-PCR (RT-PCR) в различни тъкани (Фигура 2C). Като се има предвид, че EDS1 е централен регулатор на растителния имунитет (Saikat et al., 2011), ние изследвахме дали EIJ1, предполагаем кофактор на EDS1, също е ангажиран в отговора на патогенна инфекция. Нивото на транскрипт на EIJ1 се индуцира чрез третиране с хемибиотрофни бактерии Pst DC3000 или SA (Фигура 2D). Оцветяването с GUS разкри, че EIJ1 е индуциран и значително концентриран около трихомите в Pst DC3000-инокулирани листа (Фигура 2E–G), което предполага възможно биологично значение на EIJ1 в защитния отговор (Xin and He, 2013). След това изследвахме нивото на EIJ1 в 35Spro: EIJ1-HA растения, третирани с Pst DC3000 или SA. Интересно е, че при лечение с Pst DC3000 или SA, EIJ1 постепенно се разгражда след бърза индукция (Фигура 2, H и I). Този резултат не е в съответствие със стабилния модел на експресия на EIJ1-HA, наблюдаван в 35Spro: EIJ1-HA растения по време на патогенна инфекция (допълнителна фигура 3), което показва посттранскрипционна регулация на EIJ1. Заедно тези резултати предполагат, че EIJ1 участва в имунния отговор на растенията.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Мутация на загуба на функция на EIJ1 повишава резистентността към Pst DC3000 чрез SA пътя

За да изследваме ролята на EIJ1 в имунитета на растенията, ние идентифицирахме мутант на Arabidopsis (SALK_142975), съдържащ Т-ДНК вмъкване в третия екзон на EIJ1 (Фигура 3, A и B). Количественият RT-PCR анализ показа, че EIJ1 е слабо експресиран в този eij1 T-DNA инсерционен мутант; затова нарекохме този алел EIJ1 eij{{10}} (Фигура 3C). Впоследствие ние оценихме фенотипа на резистентност към болести на 3-седмични eij1-1 мутантни растения и Arabidopsis (A. thaliana) екотип Columbia (Col-0; див тип) растения чрез инокулация с Pst DC3000. Оценката на заразените листа 5 дни след инокулацията (dpi) разкри по-малко некротични лезии върху листата eij1-1, отколкото върху листата Col-0 (Фигура 3D). Последователно листата eij1-1 показват значително по-нисък бактериален титър от листата Col-0 при 5 dpi, въпреки че бактериалният титър не показва разлика между листата Col-0 и eij1-1 при 0 dpi (Фигура 3E). След това генерирахме eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA комплементарни линии чрез трансформиране на EIJ1 геномен фрагмент, слят с 6xHA таг последователност в фона на eij1-1. Линиите на комплементация напълно спасиха фенотипа на резистентност към патогени на eij1-1 (Фигура 3E), подкрепяйки, че eij1-1 е мутант със загуба на функция. За да се определи ефектът на EIJ1 върху апопластичния имунитет, фенотипът на резистентност към болести на тези допълващи линии също беше оценен чрез инфилтрация под налягане на Pst DC3000 и бяха получени подобни резултати (допълнителна фигура 4А). За да потвърдим функцията на EIJ1, ние след това идентифицирахме друг мутант на Arabidopsis eij 1-2 (WiscDsLox343G09), който съдържа T-DNA вмъкване в промоторната област на EIJ1 (допълнителна фигура 5, A и B). EIJ1 транскриптите са едва откриваеми в eij1-2 мутанта, което показва, че eij1-2 е нулев алел на EIJ1. Подобно на eij1-1, анализите на бактериалния растеж разкриха, че eij1-2 присъства при значително по-нисък бактериален титър от Col-0 (допълнителна фигура 5, D и E). В обобщение, тези резултати показват, че EIJ1 играе важна репресивна роля в имунния отговор на растенията.

Фигура 1 EIJ1 взаимодейства с EDS1 in vitro и in planta. (A) Схематична диаграма, показваща домейните, намерени в EIJ1, EDS1 и техните съкратени версии. (B) Дрождеви двухибридни анализи показват взаимодействията между EIJ1, EDS1 и техните съкратени версии. Трансформирани дрождеви клетки се отглеждат върху SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade и SD/-Trp/-Leu среда. Празни контроли само за вектори; AD, домейн за активиране; BD, ДНК-свързващ домен. (C) Изтеглящ се анализ, показващ директното взаимодействие между His-EIJ1 и GST-EDS1 слети протеини in vitro. His-EIJ1 протеините се инкубират с имобилизиран GST или GST-EDS1 протеин. Имунопреципитираните фракции се откриват съответно чрез анти-His и анти-GST антитела. (D) Co-IP, показващ взаимодействието на EIJ1 и EDS1 в листата на Arabidopsis. Общите протеини, извлечени от 3-седмично стари 35Spro: EIJ1-6HA (като генотипна контрола) и 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG листа са имунопреципитирани от или анти-FLAG антитяло, или преимунен серум (IgG). Коимунопреципитираните протеини се откриват, като се използват съответно анти-FLAG и анти-НА антитела. Представителните резултати, представени в (B–D), бяха повторени независимо три пъти.

Производството на водороден пероксид (H2O2), вид реактивни кислородни видове, е отличителен белег на успешното разпознаване на патогени и последващо активиране на защитните реакции на растенията, включително свързана с HR програмирана клетъчна смърт (Lam et al., 2001; Torres et др., 2006; Нанда и др., 2010). Затова наблюдавахме нивото на H2O2 в 3-седмично инокулирани с патоген Col-0, eij1-1 и eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA растения, използвайки метода на оцветяване с 3,3-диаминобензидин (DAB). Резултатите показват, че H2O2 се натрупва до високи нива в заразените растения, но не се открива в неинокулираните (фалшиви) растения (Фигура 3F). По-високо ниво на H2O2 беше открито в листата eij1-1, отколкото в листата на Col- 0 и допълващи линии, инокулирани с Pst DC3000 (Фигура 3F). Освен това, докато оцветяването с трипаново синьо разкрива, че клетъчна смърт (microHR, Alvarez et al., 1998) е настъпила в листата eij1-1 на 24-h след инокулация (HPI) с Pst DC3000, но не microHR се наблюдава в Col-0 и eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA растения (Фигура 3G). Инокулацията с авирулентен Pst DC3000 (AvrRps4) доведе до по-високо натрупване на H2O2 и повече microHR, въпреки че не се наблюдава видима разлика между тези три генотипа (Фигура 3, F и G). Тези резултати предполагат съществена роля на EIJ1 в базалната резистентност към патогени.

Фигура 2 Модел на експресия на EIJ1 иРНК и протеин. (A) Локализация на хлоропласт и ядро ​​на EIJ1. Слят протеин EIJ1-mCherry се експресира временно в листата на N. benthamiana и се анализира чрез конфокална микроскопия. DAPI флуоресценцията показва ядрото. Флуоресценцията на хлорофила е означена със зелен цвят. Лента=10 lm. (B) GUS оцветяване, показващо експресията на EIJ1 в корени, стъбла, розетни листа, цветя, силици и 10-дневни разсад (отляво надясно). Шина=1 mm. (C) Модел на експресия на EIJ1 в различни тъкани на Col растения, включително корени, стъбла, розетни листа, цветя и силици, както е открито от qRT-PCR. Относителната експресия се изчислява чрез нормализиране на нивото на транскрипция на изследвания ген спрямо това на ACTIN2 (същото като по-долу). Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики. Малки букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01; Допълнителен набор от данни 1). (D) Експресионен анализ на EIJ1 с използване на 3-седмични растения Col, инокулирани с потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.1) или напръскани с 0,05 mM SA. Данните са средната стойност ± SD от три биологични повторения (допълнителен набор от данни 1). (E–G) GUS оцветяването показва индуцирането на експресия на EIJ1 от патогени. Триседмични pEIJ1:EIJ1-GUS растения бяха фалшиво инокулирани (10 mM MgCl2; E) или инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.1; F). Шина=1 mm. Увеличената картина показва, че EIJ1-GUS се концентрира в областта на трихома в (G). Лента=100 lm. Листата при 4 hpi се събират и се инкубират с GUS оцветяващ разтвор. (H) и (I) Модел на експресия на EIJ1 след лечение с Pst DC3000 или SA. Общите протеини бяха извлечени от 3-седмично стари 35Spro: EIJ1-6HA растения, инокулирани с Pst DC3000 (OD600=0.1; H) или напръскани с 0,05 mM SA (I), и се открива с помощта на анти-НА антитяло. Долните панели показват оцветяване с Coomassie Brilliant Blue (CBB) като контрола на натоварването. Имуноблот анализите, представени в (H) и (I), се повтарят независимо три пъти.

Фигура 3 Идентификация на мутиралия алел eij1-1 на Arabidopsis EIJ1. (A) Схематична диаграма, показваща мястото на вмъкване на Т-ДНК в eij1-1 (SALK_142975). Екзоните са представени с кутии, а интроните с линии между кутиите. Черните кутии представят регионите за кодиране на EIJ1, а белите кутии представляват нетранслираната област. Триъгълникът показва мястото на вмъкване на Т-ДНК. (B) PCR амплификация на геномна ДНК потвърждава, че eij1-1 е хомозиготен инсерционен мутант. Използваните праймери (P1, P2) са показани в (A). LB показва Т-ДНК лявата граница на праймера и М показва ДНК молекулярните маркери. (C) qRT-PCR анализ на EIJ1 експресия. Общата РНК беше извлечена от 3-седмични листа eij1 и Col. Относителната експресия на EIJ1 в eij1-1 беше зададена на 1. Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики (допълнителен набор от данни 1). (D) Фенотипът на резистентност към болести на Col, eij1-1 и две представителни EIJ1 допълващи трансгенни линии eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Триседмични растения бяха инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.05). Показаните листа са заснети на 5 dpi. Решетки=5 mm. (E) Бактериален растеж на Pst DC3000 върху растения, описани в (D) при 0 и 5 dpi. cfu/g, образуващи колонии единици на g прясно тегло. Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики. Малки букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01, допълнителен набор от данни 1). (F) Изследване на нивата на H2O2 в листата на Col,

EIJ1 медиира растителния имунитет чрез потискане на активността на EDS1

За да разберем генетичната връзка между EDS1 и EIJ1, ние генерирахме eij1-1 eds1-22 двойни мутантни линии чрез кръстосване на eij1-1 мутанта с eds1-22, загуба на- функционален мутантен алел на EDS1-90 (AT3G48090; Col-0 фон), който проявява компрометирана резистентност към патогени (Yang and Hua, 2004). Не се наблюдава морфологична разлика между eij1-1, eds1-22 и eij1-1 eds1-22 мутантни растения при нормални условия на растеж (Фигура 4, A и B). След инокулиране с Pst DC3000, eij1-1 мутантните растения показват по-силна устойчивост от Col-0 растенията при 5 dpi (Фигура 4, A и B). Двойният мутант eij1-1 eds1-22 обаче показва забележителни некротични лезии и висок бактериален титър, сравним с единичния мутант eds1-22, което показва, че алелът eij1-1 не е в състояние за спасяване на податливия на заболяване фенотип на eds1-22 (Фигура 4, A и B). Устойчивостта на заболяване също беше оценена след инфилтрация под налягане на Pst DC3000 и бяха получени подобни резултати (допълнителна фигура 4B). Освен това използвахме нулевия алел EDS1, eds1-2; Col-0 фон; Bartsch et al., 2006), за генериране на eij1-1 eds1-2 двойни мутантни растения за генетичен анализ. Подобно на eij1-1 eds1-22, eij1-1 eds1-2 двойни мутантни растения също показаха забележителни некротични лезии и по-висок бактериален титър от eij1-1, което беше сравним с единичния мутант eds1-2 (допълнителна фигура 6). Тези генетични доказателства предполагат, че EDS1 е епистатичен към EIJ1. В съответствие с горните наблюдения, H2O2 се натрупва до високи нива в листата eij1-1, но до ниски нива в листата eds1- 22 и eij1-1 eds1-22, в сравнение с Col{{ 53}} листа, при инокулация с Pst DC3000 (Фигура 4C). Освен това, microHR в eij1-1 беше ясно потиснат от загубата на функция на EDS1 при 24 hpi с Pst DC3000 или авирулентен Pst DC3000 (AvrRps4; Фигура 4D). В съответствие с този резултат нивата на експресия на ICS1 и PR1 в растенията eij1-1 eds1-22 и eds1-22 са сравними, но значително по-ниски от тези в eij1-1 и Col{ {71}} растения (Фигура 4E). Тези резултати подкрепят, че EIJ1-медиираният вроден имунен отговор зависи от EDS1. За да изследваме ролята на взаимодействието EIJ1–EDS1 в имунния отговор на растението, направихме RNA-seq анализ на eij1-1, eds1-22 и Col-0 листа при 24 hpi с Pst DC3000 ; с неинокулирани Col-0 листа бяха използвани като фиктивно лечение. Общо 2762, 923 и 622 диференциално експресирани гена (DEG) бяха идентифицирани в Col_Pst DC3000 спрямо Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 срещу Col_ Pst DC3000 и eds1-22_Pst DC3000 срещу Col_Pst DC3000 сравнения. Тези гени по-нататък се наричат ​​съответно чувствителни към патогени, EIJ1-регулирани и EDS1-регулирани гени (допълнителна фигура 7A и набор от данни 2). Сред тези гени 471 са регулирани от EIJ1; 396 са регулирани от EDS1 (Фигура 4F; Допълнителен набор от данни 2); и 124 бяха съвместно регулирани от EIJ1 и EDS1 (Фигура 4F). Клъстерният анализ показа, че 93,5% (116) от ко-регулираните гени (124) са регулирани нагоре от EDS1 и регулирани надолу от EIJ1 (Фигура 4F; Допълнителна фигура 7B и набор от данни 2), подкрепяйки репресивната роля на EIJ1 върху EDS1 функция. Анализът на генната онтология (GO) допълнително разкри, че повечето от гените, регулирани антагонистично от EIJ1 и EDS1, участват главно в реакции на стрес и вродени имунни отговори (Фигура 4G; Допълнителна таблица S1). Тези анализи предполагат, че EIJ1 и EDS1 регулират гени, свързани с резистентност, по контрастиращ начин по време на патогенна инфекция. Значителна част от EDS1-регулираните гени (272/396) не са били регулирани от EIJ1, вероятно поради промяната на долната гънка (52) или EIJ1-независимата функция на EDS1.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 взаимодейства с EDS1 в цитоплазмата и инхибира ядрения трафик на EDS1

EIJ1 е локализиран в хлоропласта и ядрото на листните клетки (Фигура 2А), докато протеинът EDS1 показва модел на нуклеоцитоплазмено разпределение, срещащ се и на двете места (Garcı´a et al., 2010). За да проучим къде и как EIJ1 взаимодейства с EDS1 в planta, ние извършихме анализи на преходна експресия, използвайки протопласти на Arabidopsis. Интересно е, че въпреки че EIJ1 поддържа оригиналния си модел на субклетъчна локализация в хлоропласта и ядрото в присъствието на зеления флуоресцентен протеин (GFP; контрола), локализираният в хлоропласт EIJ1-mCherry се разпространява в цитоплазмата, когато се експресира съвместно с EDS{ {9}}GFP в протопласти (Фигура 5A, вижте репликите в Допълнителен файл 2). Това явление беше потвърдено в епидермални клетки на N. benthamiana, в които EIJ1-mCherry беше временно ко-експресиран или с EDS1-GFP, или с GFP контрола (допълнителна фигура 8, вижте репликите в допълнителен файл 2) . Тези наблюдения показват, че свръхекспресията на EDS1 може да доведе до субклетъчна релокализация на EIJ1. След това, за да определим субклетъчното местоположение, където EDS1 и EIJ1 си взаимодействат, направихме падащ анализ, използвайки рекомбинантния глутатион S-трансфераза (GST)-EDS1 слят протеин (примамка) и общ протеинов екстракт, обеднени на ядра фракции и ядра- обогатени фракции на 35Spro: EIJ1-HA трансгенни линии (протеини на плячка). Нашите резултати показаха, че EDS1 имунопреципитира с EIJ1-HA при използване на общия протеинов екстракт и фракции с изчерпани ядра от 35Spro: EIJ1-HA листа, но не и при използване на обогатени с ядра фракции (Фигура 5B), което предполага, че взаимодействието между EIJ1 и EDS1 се случва в цитоплазмата.

Фигура 4 EIJ1 и EDS1 противоположно регулират устойчивостта на растенията към патогени. (A) Фенотипът на устойчивост на болести на Col, eij1-1, eds1-22 и eij1-1 eds1-22. Триседмични растения бяха инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.05). Показаните листа са заснети на 5 dpi. Шина=5 mm. (B) Бактериален растеж на Pst DC3000 върху растения, описани в (A) при 0 и 5 dpi. Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики. Малки букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01, допълнителен набор от данни 1). (C) Изследване на нивата на H2O2 в Col, eij1-1, eds1-22 и eij1-1 eds1-22 растения. Триседмични растения се инокулират при потапяне с Pst DC3000 или Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) и след това се оцветяват с DAB при 24 hpi. Лента=500 lm. (D) Анализ на клетъчна смърт на растения Col, eij1-1, eds1-22 и eij1-1 eds1-22. Триседмични растения се дипинокулират с Pst DC3000 или Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) и след това се оцветяват с трипаново синьо при 24 hpi. Лента=500 lm.

Като се има предвид, че EIJ1 регулира отрицателно имунния отговор на растенията по начин, зависим от EDS1- (Фигура 4), след това изследвахме ефекта на патогените върху взаимодействието между EIJ1 и EDS1. Изненадващо, инфекцията с Pst DC3000 засили взаимодействието EDS1–EIJ1 в цитоплазмата, а не както в хлоропласта, така и в ядрото (Фигура 5C, вижте репликите в Допълнителен файл 2). Това откритие, заедно с модела на нуклео-цитоплазменото разпределение на EDS1 и ролята на ядрената локализация на EDS1 в подсилването на патогенната резистентност на транскрипционно ниво (Garcı´a et al., 2010), ни принуди да изследваме ролята на EIJ1 в субклетъчния трафик на EDS1 по време на патогенна инфекция. Когато временно експресирахме EDS1-3FLAG в протопласти на Arabidopsis, изолирани от eij1-1, свръхекспресия на EIJ1 и Col-0 растения, EIJ1 значително потисна трафика на EDS1 в ядрото (допълнителна фигура 9) . Освен това имуноблот анализът разкрива малка разлика в изобилието на общия протеин EDS1 между eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG и eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }FLAG трансгенни растения (Фигура 5D, вижте репликите в Допълнителен файл 2). Въпреки това, в сравнение с eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG трансгенни растения, Pst DC3000- инокулирани eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG растения показват значително увеличение в нивото на обогатен с ядра протеин EDS1 и намаляване на нивото на локализиран в цитоплазмата EDS1 (Фигура 5D, вижте репликите в Допълнителен файл 2), потвърждавайки репресивната роля на EIJ1 в трафика на EDS1 от цитоплазма към ядро. След това тествахме дали този процес на преразпределение, медииран от взаимодействието EIJ1-EDS1, повлиява транскрипционната регулация на свързаните с резистентност гени в растенията. Ефекторните конструкции 35Spro: EIJ1-mCherry и 35Spro: EDS1-3FLAG бяха трансформирани индивидуално или заедно с репортерните конструкции в епидермални клетки на листа на N. benthamiana (Фигура 5E). При 24 hpi с Pst DC3000, EDS1 активира експресията на PR1 и ICS1 (Фигура 5F), докато EIJ1 значително инхибира EDS1-индуцираната генна експресия (Фигура 5F). За разлика от EIJ1 с пълна дължина, N-терминалният край на протеина EIJ1, който е незасегнат в eij1-1, не е в състояние да инхибира индуцираната от EDS1- PR1 експресия (допълнителна фигура 10, A и B ), което показва, че интактната протеинова структура на EIJ1 е необходима за неговата репресивна функция. Заедно тези резултати подкрепят, че EIJ1 функционира като основен репресор в EDS1-медиирания резистентен отговор чрез регулиране на нуклеоцитоплазмения трафик на EDS1. Тъй като протеинът EIJ1 постепенно се разгражда в Pst DC3000-инокулирани или SA-третирани растения след бърза първоначална индукция (Фигура 2, H и I), ние изследвахме дали EDS1 от своя страна задейства разграждането на EIJ1 чрез взаимодействие протеин-протеин. Тестовете за безклетъчно разграждане и in vivo тестове за откриване на протеини, използващи eds1-22 35Spro: EIJ1-HA трансгенни растения показват, че нито отсъствието, нито присъствието на EDS1 повлиява разграждането на EIJ1 (допълнителна фигура 11), което предполага, че EDS1 не участва в предизвиканото от патогена разграждане на EIJ1.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Патогенната инфекция променя субклетъчната локализация на EIJ1

Засиленото взаимодействие между EIJ1 и EDS1 в цитоплазмата при инокулиране на патоген (Фигура 5, B и C) предполага възможна предизвикана от патоген преместване на EIJ1 в растителните клетки. За да тестваме тази възможност, ние изследвахме субклетъчната локализация на EIJ1 в листата на N. benthamiana, инокулирани с Pst DC3000. При неинфектирани условия EIJ1-mCherry е локализиран в хлоропласта и ядрото. Въпреки това, при 24 dpi, флуоресцентните сигнали бяха значително намалени в хлоропластите и бяха повишени в цитоплазмата (Фигура 6А). За по-нататъшно определяне дали патогените предизвикват дисасоциацията на EIJ1 от хлоропласта към цитоплазмата в листата, беше извършен имуноблот анализ на EIJ1 протеин с помощта на 35Spro: EIJ1-6HA трансгенни растения. Общи протеини, хлоропластни протеини и цитоплазмени протеини бяха изолирани от 35Spro: EIJ1-6HA трансгенни растения при 0 и 4 hpi с Pst DC3000. Изобилието на EIJ1 беше забележително повишено в цитоплазмената фракция, но намаля в хлоропластната фракция при 24 dpi (Фигура 6B, вижте репликите в Допълнителен файл 2), което показва отрицателна корелация между нивата на EIJ1 протеин в хлоропласта и цитоплазмата.

Фигура 5 EIJ1 взаимодейства с EDS1 в цитоплазмата, за да опосредства ядрения трафик на EDS1. (A) Анализ на преходна експресия, показващ локализацията на EDS1 и EIJ1 в протопластите на Arabidopsis. Лента=10 lm. (B) Изтеглящ се анализ на взаимодействието между EIJ1 и EDS1. Общи протеини, обеднени на ядра фракции и обогатени на ядра фракции, извлечени от 3-седмични eij1-1 35Spro: EIJ1-6HA трансгенни растения бяха инкубирани с имобилизирани GST-EDS1 или GST протеини , съответно. IP бяха открити с помощта на анти-HA или анти-GST антитела. PEPC и хистон H3 бяха използвани съответно като цитоплазмени и ядрени маркери. Звездичките показват лентите на GST-EDS1 протеини. (C) Pst DC3000 инфекцията засилва протеиновото взаимодействие на EDS1 и EIJ1 в цитоплазмата. Общи протеини, обеднени на ядра фракции, обогатени на ядра фракции и хлоропластни протеини бяха извлечени от 3-седмично стари EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG растения, инокулирани потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.1) или фалшиво инокулиран при 4 hpi и имунопреципитиран с помощта или на анти-FLAG антитяло, или на преимунен серум (IgG). Ко-имунопреципитираните протеини бяха открити с помощта на анти-НА и анти-FLAG антитела. N-изчерпани, обеднени на ядра фракции; Фракции, обогатени с N, обогатени с ядра. PEPC и хистон H3 бяха използвани съответно като цитоплазмени и ядрени маркери. (D) Имуноблот анализът показва, че EIJ1 медиира цитоплазменото спрямо ядреното разпределение на EDS1. Общите протеини, обеднените на ядра фракции и обогатените с ядра фракции бяха извлечени от 3-седмични издания1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG и eij1-1 издания{{59 }} EDS1pro: EDS1-3FLAG трансгенни растения, инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.1) или фалшиво инокулирани при 4 hpi и открити с помощта на анти-FLAG антитяло. Относителният интензитет на протеини от eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG с фалшива инокулационна обработка, зададена на 1. M, фалшива; P, Pst DC3000. PEPC и хистон H3 бяха използвани съответно като цитоплазмени и ядрени маркери. Резултатите, представени в (A), (C) и (D), бяха повторени независимо три пъти (допълнителен файл 2). (E) и (F) Преходен анализ на PR1 и ICS1 промоторната активност, регулирана от EIJ1 и EDS1. Различни конструкции, използвани в анализи на преходна експресия, са показани в (E). Или PR1pro: GUS, или ICS1pro: GUS беше котрансформиран с ефектори или празния вектор (контрола) в листа на N. benthamiana, стерилизирани с Pst DC3000 (OD600=0.1) за 24 часа. Относителната активност на GUS (GUS/луцифераза), която показва нивото на експресия на PR1 и ICS1, регулирани от различни ефектори, е показана в (F). Данните са средната стойност ± SD от три биологични повторения (допълнителен набор от данни 1). Малките букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01).

Дисоциацията на EIJ1, предизвикана от патогени от хлоропласта, предполага потенциална функция на EIJ1 в цитоплазмата. За да тестваме тази възможност, ние имобилизирахме протеина EIJ1 върху хлоропластите чрез прикрепване на последователността, насочена към хлоропласт (CTS; Lee et al., 2008) към N-терминалния край на EIJ1-mCherry репортерния ген. Сливането на CTS-EIJ1-mCherry след това се експресира в листата на N. benthamiana под контрола на нативния промотор. Флуоресценция беше открита само в хлоропластите, но не и в цитозола и ядрото на инокулирани с Pst DC3000- листа на N. benthamiana (допълнителна фигура 12А). Това наблюдение потвърждава, че CTStagged EIJ1 е задържан в хлоропласта и не е принуден в цитоплазмата от патогенна инфекция. Впоследствие генерирахме EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA трансгенни линии на Arabidopsis, за да оценим биологичната функция на CTS-EIJ1 в имунния отговор на растенията. Както се очакваше, за разлика от eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, линиите eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA не показаха значителна разлика в резистентността към патогени в сравнение с eij1-1, което показва, че EIJ1, имобилизиран в хлоропласта, не е в състояние да спаси фенотипа на устойчивост на болести на eij1-1 (Фигура 6C). В съответствие с това наблюдение, експресията на PR1 се поддържа на високо ниво в eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6HA трансгенни растения, подобно на eij1-1 (допълнителна фигура 12B). В допълнение, CTS-EIJ1 показва по-малка способност да потиска EDS1 транскрипционната активност от EIJ1 (Фигура 6, D и E). Тези резултати ни накараха да заключим, че ранният отговор на гостоприемника към патогенна инфекция задейства субклетъчната релокализация на EIJ1, което от своя страна модулира имунния отговор чрез потискане на трафика на EDS1 в ядрото.

EIJ1 регулира реакцията, предизвикана от ефектор на вирулентност

AvrRps4 ефекторният протеин на P. syringae, секретиран от секреторната система тип III, се разпознава от TIR-NB-LRR рецептора RPS4, за да инициира ETI, който е зависим от EDS1 (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Хайдрих и др., 2012). Ние инокулирахме листата eij1-1 с авирулентния Pst DC3000 (AvrRps4) или вирулентния Pst DC3000, за да преценим дали EIJ1 участва в ETI. Листата eij1-1 показват по-голяма устойчивост към вирулентния Pst DC3000, отколкото листата Col-0 (Фигура 7А). Въпреки това, не се наблюдава значителна разлика между Col-0 и eij1-1 листа по отношение на устойчивостта към авирулентен Pst DC3000 (AvrRps4), въпреки че и двата генотипа показват по-голяма устойчивост към авирулентен Pst DC3000 (AvrRps4), отколкото към Pst DC3000 ( Фигура 3, F и G; Фигура 7, A), което показва, че EIJ1 може да не е необходим за RPS4-индуцирана ETI. Ние също така определихме устойчивостта на растенията към Pst DC3000 hrcC, който съдържа дефектна система за секреция тип III и не успява да инжектира ефектори в клетките гостоприемници, за да потисне PTI (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Както мутантът eij1-1, така и листата Col-0 показват сходна резистентност към Pst DC3000 hrcC (допълнителна фигура 13), което предполага, че EIJ1 не участва в PTI.

Като се има предвид, че ядреното натрупване на EDS1 е необходимо за индуцираното от TIR-NB-LRR препрограмиране на експресията и резистентността на защитния ген (Garcı´a et al., 2010), ние проучихме дали EIJ1 регулира субклетъчното разпределение на EDS1 в отговор на ETI. Листата на 3-седмични eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG и eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG растения бяха инокулирани с Pst DC3000 или Pst DC3000 (AvrRps4), а обеднените с ядра и обогатените с ядра фракции се екстрахират при 0 и 4 к.с. В съответствие с предишното проучване (Garcı´a et al., 2010), се наблюдава увеличение на ядрената локализация на EDS1 в eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG растения, инокулирани с Pst DC3000 (AvrRps4), но не и при тези, инокулирани с Pst DC3000. Въпреки това, загубата на функция на EIJ1 не повлиява ETI-индуцираното ядрено натрупване на EDS1 (Фигура 7B; вижте репликите в Допълнителен файл 2). Това предполага, че авирулентният Pst DC3000 (AvrRps4) или задейства трафика на EDS1 в ядрото чрез заобикаляне на EIJ1, или премахва функцията на EIJ1 по неизвестен начин. За да тестваме тези възможности, ние изследвахме ефекта на авирулентния Pst DC3000 (AvrRps4) върху нивото на EIJ1. Подобно на резултатите, получени при използване на линии на свръхекспресия на EIJ1 (Фигура 2H), растенията eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, инокулирани с Pst DC3000, показват повишено натрупване на EIJ1 в ранен стадий на инфекция, въпреки че EIJ1 постепенно влошени след 8 hpi (Фигура 7C; вижте репликите в Допълнителен файл 2). Натрупването на EIJ1 е достатъчно, за да предотврати трафика на EDS1, предизвикан от Pst DC3000-, в ядрото на ранен етап на инфекция (Фигури 5, D и 7, B). В съответствие с този резултат, загубата на функция на EIJ1 ускори ядрената транслокация на EDS1 в заразени растения (допълнителна фигура 14). За разлика от това, Pst DC3000 (AvrRps4) премахна функцията на EIJ1 чрез бързо индуциране на разграждането на EIJ1 протеин, но не и чрез потискане на транскрипцията на EIJ1 ген (Фигура 7C; Допълнителна фигура 15), като по този начин насърчава повече ядрена транслокация на EDS1 в ранния стадий на инфекцията (Фигура 7B ). Наблюдението, че растения eij1-1, инокулирани с Pst DC3000, показват резистентност, сравнима с тази на Col-0 и eij1-1 растения, инокулирани с авирулентния Pst DC3000 (AvrRps4), подкрепя тази хипотеза. Това може да обясни, поне до известна степен, защо авирулентният щам, но не и вирулентният щам, може да монтира подсилената резистентност, за да предизвика реакция на ETI. Следователно, тези наблюдения предполагат, че EIJ1 участва в реакция, предизвикана от ефектор на вирулентност в клетките гостоприемници.

Фигура 6 Преместването на EIJ1 в цитоплазмата е необходимо за резистентност, зависима от EDS1-. (A) Инфекцията с Pst DC3000 променя субклетъчната локализация на EIJ1. EIJ1-mCherry се експресира временно в листа на N. benthamiana, стерилизирани с Pst DC3000 (OD600=0.1) или фалшиво инокулирани за 24 часа. Лента=10 lm. (B) Инфекцията с Pst DC3000 задейства отделянето на EIJ1 от хлоропласта. Общите протеини, цитоплазмените протеини и хлоропластични протеини бяха извлечени от 3-седмично стари EIJ1pro: EIJ1-6HA растения, инокулирани потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.1) или фалшиво инокулирани при 4 hpi и се открива от анти-НА антитялото. PEPC, хистон H3 и RbcL бяха използвани съответно като цитоплазмени, ядрени и хлоропластични маркери. Относителният интензитет на протеините с фиктивно третиране е настроен на 1. Резултатите, представени в (A) и (B), се повтарят независимо три пъти (допълнителен файл 2). (C) Имобилизираният EIJ1 в хлоропластите не е в състояние да възстанови устойчивостта на eij1-1. Триседмични растения бяха инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 (OD600=0.05). Определя се бактериален титър на Pst DC3000 при 0 и 5 dpi. CTS, сигнали за локализиране на хлоропласти. Данните са средната стойност ± SD от три биологични повторения (допълнителен набор от данни 1). (D) и (E) Преходен анализ на PR промоторната активност, регулирана от EIJ1, CTS-EIJ1 и EDS1. Различни конструкции, използвани в анализи на преходна експресия, са показани в (D). PR1pro: GUS се трансформира съвместно с ефектори или празен вектор (контрола) в листа на N. benthamiana, стерилизирани с Pst DC3000 (OD600=0.1) за 24 часа. Относителната активност на GUS (GUS/луцифераза), която показва нивото на експресия на PR1, регулирано от различни ефектори, е показано в (E). Лентите за грешки представляват стандартното отклонение на трикратни независими проби. Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики. Малки букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01, допълнителен набор от данни 1).

Фигура 7 EIJ1 и EDS1 модулират базалната устойчивост на растенията. (A) Бактериален растеж на Col и eij1-1 мутант. Триседмични растения бяха инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 или Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05). Определя се бактериален титър на Pst DC3000 при 0 и 5 dpi. Данните са средната стойност ± SD от три биологични реплики. Малки букви показват значителни разлики (еднопосочен ANOVA, P 5 0.01, допълнителен набор от данни 1). (B) EIJ1 почти не засяга предизвиканото от Pst DC3000 (AvrRps4) натрупване на EDS1 в ядрата. Фракциите с изчерпани ядра и фракциите, обогатени с ядра, бяха извлечени от 3-седмични издания1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG и eij1-1 изд1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG трансгенни растения при потапяне, инокулирани с Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), или фалшиво инокулирани при 4 hpi и открити с помощта анти-FLAG антитяло. PEPC и хистон H3 бяха използвани съответно като цитоплазмени и ядрени маркери. Относителният интензитет на протеини от растения с фиктивно третиране беше настроен на 1.M, макет; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Pst DC3000 (AvrRps4) инфекция насърчава разграждането на протеина EIJ1. Общите протеини бяха извлечени от 3-седмично стари eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA растения, инокулирани чрез потапяне с Pst DC3000 или Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) и се открива с помощта на анти-НА антитяло. Долният панел показва оцветяване с Coomassie Brilliant Blue (CBB) като контрола на натоварването. Представителните резултати, представени в (B) и (C), бяха повторени независимо още два пъти и изследвани с анти-ACTIN антитяло като контрола на натоварване (допълнителен файл 2). (D) Хипотетичен модел на EIJ1, регулиращ EDS1-зависимата базална устойчивост на растенията. Когато растенията са нападнати от патогени, EIJ1 бързо се освобождава от хлоропласта в цитоплазмата, където взаимодейства с EDS1. Взаимодействието EIJ1–EDS1 предотвратява преместването на EDS1 от цитоплазмата в ядрото и по този начин ограничава ядрената устойчивост на EDS1, позволявайки модулирането на EDS1-медиирани имунни отговори. Стрелките и затъпените линии показват съответно активиране и репресия.

Дискусия

За да увеличат максимално оцеляването, растенията са разработили прецизен механизъм за оптимизиране на растежа и за защита срещу нахлуващи патогени, въпреки че много подробности за тези механизми остават неясни. EDS1 заема ключова позиция в сигналната мрежа за вроден имунитет на растението, тъй като регулира резистентността към биотрофни и хемибиотрофни патогени (Wiermer et al., 2005). В това проучване ние идентифицирахме ген, EIJ1, който кодира шаперон DnaJ протеин и показа, че EIJ1 реагира на ранна патогенна инфекция и играе роля във вродения имунитет на растенията, като взаимодейства директно с EDS1. Въз основа на тези констатации предлагаме регулаторен модел за EIJ1 (Фигура 7D). Когато растенията са нападнати от патогени, EIJ1 бързо се освобождава от хлоропласта в цитоплазмата, където взаимодейства с EDS1. Това взаимодействие EIJ1–EDS1 предотвратява преместването на EDS1 от цитоплазмата в ядрото и това ограничава ядрената резистентност на EDS1, позволявайки модулирането на EDS1-медиираните имунни отговори като индукция на биосинтеза на SA и изразяване на резистентност -свързани гени. Когато растенията страдат от непрекъснати стимули от нахлуващи патогени, EIJ1 постепенно се разгражда, което води до повишено ядрено натрупване на EDS1 за подсилване на устойчивостта. Тези констатации илюстрират съществена репресивна роля на EIJ1 по време на ранния отговор на гостоприемника към патогенна инвазия, запълвайки празнината в нашето разбиране за това как субклетъчната локализация на EDS1 се регулира, за да придаде резистентност.

Анализът на последователността разкрива, че EIJ1 е DnaJ протеин. Геномът на Arabidopsis кодира седем различни класически типа DnaJ протеини (Pulido and Leister, 2018). Предишни проучвания показват, че DnaJ протеините играят важни и различни роли в растителния имунитет. Например, соята (Glycine max) GmHSP40 положително регулира клетъчната смърт и устойчивостта към болести (Liu and Whitham, 2013). Обратно, протеинът Os-DjA6 от ориз (Oryza sativa L.) регулира отрицателно вродения имунитет на растенията чрез пътя на разграждане на протеазома, медииран от убиквитиниране (Zhong et al., 2018). Специфичният за P. syringae ефектор на вирулентност Hopl1, който съдържа J домен, е насочен към хлоропласта, където взаимодейства с механизма за отговор на стреса на растението (Jelenska et al., 2007). Тези проучвания показват, че DnaJ протеините играят различни роли в защитния отговор на растенията. Tsip1, N. tabacum DnaJ протеин, хомоложен на EIJ1, регулира Tsi1-медиираната транскрипционна активация на гени в отговор на стрес (Ham et al., 2006). Tsi1 кодира транскрипционен фактор тип APETALA2 (AP2), който функционира като важен регулатор както в биотични, така и в абиотични реакции на стрес в N. tabacum (Park et al., 2001). SA задейства преместването на Tsip1 от хлоропласта в цитоплазмата, което улеснява взаимодействието между Tsip1 и Tsi1 и последващото навлизане на комплекса Tsip1-Tsi1 в ядрото за транскрипционно активиране на гени, свързани със стреса (Ham et al., 2006) . За разлика от Tsip1, EIJ1 е локализиран в хлоропласта и ядрото при нормални условия в това изследване. Ние показахме, че патогенната инфекция задейства преместването на EIJ1 от хлоропласта в цитоплазмата и че взаимодействието между EIJ1 и EDS1 в цитоплазмата инхибира EDS1-медиираната ядрена резистентност. В съответствие с това откритие, eij1 мутантът със загуба на функция показва по-силна резистентност към патогени, отколкото дивия тип (Col-0). Това потвърждава, че EIJ1 играе отрицателна роля във вродения имунитет на растенията. Според предишни проучвания, координираните ядрени и цитоплазмени дейности на EDS1 са от съществено значение за растенията, за да завършат вродения имунен отговор към патогени (Garcı´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). Ядрената локализация на EDS1 е необходима за TNL-индуцирано резистентно транскрипционно препрограмиране, за да се индуцират SA-свързани и други защитни реакции на растенията (Wirthmueller et al., 2007). Цитоплазменият EDS1 пул също се поддържа по време на процеса на инфекция за пълна резистентност към патогени (Garcı´a et al., 2010). Тези наблюдения пораждат значителна загриженост относно това как растенията точно регулират разпределението на EDS1 между цитоплазмата и ядрото за правилни защитни реакции, когато са предизвикани от патогенна инфекция. Тук показваме, че точното разпределение на EDS1 към различни субклетъчни отделения се регулира отчасти от EIJ1 чрез взаимодействие протеин-протеин. Мутацията на загуба на функция на EIJ1 по-специално насърчава трафика на EDS1 към ядрото (Фигури 5, D и 7, B), което води до повишена устойчивост на болести.

Тъй като EIJ1 бързо се индуцира в ранен стадий на патогенна инфекция и впоследствие се разгражда по време на развитието на болестта, ние предполагаме, че EIJ1 е важен отрицателен регулатор на имунитета, който позволява на растенията да усъвършенстват своите оптимални защити. EIJ1-медиираната репресия на активността на EDS1 може да предотврати предизвикването на ненужни имунни отговори към краткотрайна стимулация, като например случайна атака от патогенни бактерии. Алтернативно, патогенните бактерии могат да манипулират имунитета на гостоприемника чрез задействане на дисоциацията на EIJ1 от хлоропласта, вероятно чрез секретиране на вирулентни ефектори. Не можем да изключим възможността EIJ1 да изпълнява неизвестна функция в хлоропласта. Както знаем, SA, растителен хормон и сигнална молекула, замесена в резистентността към биотрофични патогени, се биосинтезира предимно в хлоропласта и след това се изнася в цитоплазмата от EDS5, преносител на множество лекарства и токсини (Serrano et al., 2013). EIJ1 вероятно е отрицателен регулатор на натрупването на SA, тъй като регулира надолу експресията на биосинтетичния ген на SA ICS1 при инокулация на патоген (Фигура 4E). В допълнение към EIJ1-медиираната транскрипционна репресия чрез взаимодействието му с EDS1, възможно е EIJ1 също да играе пряка роля в биосинтезата на SA или транспорта на SA от хлоропласта по неидентифициран начин. Не би било изненадващо, ако се установи, че EIJ1 и процесът на биосинтеза на SA са свързани в бъдещо проучване. Интересното е, че EIJ1 също е локализиран в ядрото. Въпреки че EIJ1 не взаимодейства с EDS1 в ядрото, вероятно поради липсата на основни кофактори или модификации, функцията на локализирания в ядрото EIJ1 заслужава по-нататъшно изследване.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Патогенните бактерии произвеждат вътреклетъчни ефектори, за да подкопаят PTI на гостоприемника чрез насочване към патогенни резистентни протеини като PRRs, докато растителните цитоплазмени NOD-подобни рецептори усещат тези ефектори, за да инициират ETI (Dou and Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Предишни проучвания и нашите резултати показаха, че авирулентният Pst DC3000 (AvrRps4) насърчава трафика на цитоплазмения EDS1 в ядрото (Garcı´a et al., 2010). Освен това, нашите резултати не показват значителна разлика в предизвиканото от Pst DC3000 (AvrRps4) ядрено натрупване на EDS1 и последваща устойчивост на патогени между Col-0 и eij1-1 мутантни растения (Фигура 7, A и B) . В допълнение, резистентността, проявявана от мутанта eij1-1, е сравнима с тази, проявявана от Col-0 растения, инокулирани с дефектен тип III секреционна система Pst DC3000 hrcC щам (допълнителна фигура 12). Освен това, натрупването на EIJ1 е значително по-ниско в растения, инокулирани с авирулентен Pst DC3000 (AvrRps4), отколкото в растения, инокулирани с вирулентен Pst DC3000 (Фигура 7C), което показва, че EIJ1 е основен регулатор на имунен отговор, предизвикан от ефектор на вирулентност в клетките на гостоприемника. Тъй като растенията, инокулирани с Pst DC3000-eij1-1, имитират фенотипа на устойчивост на Pst DC3000 (AvrRps4)-инокулирани Col-0 растения (Фигури 3, F, G, 4, C, D и 7, A), EIJ1 може да функционира като бариера за предотвратяване на индуцирането на ETI от вирулентни щамове. В заключение, ние идентифицирахме EIJ1, шаперон DnaJ протеин и показахме, че той участва в ранен имунен отговор към растителни патогени. Взаимодействието между EIJ1 и EDS1 потиска ядрения трафик на EDS1, вероятно или за предотвратяване на краткосрочно стимулиране от ненужни имунни отговори на растенията, за улесняване на патогенната инвазия чрез манипулиращ механизъм, или и двете. Независимо от основния механизъм, алелът EIJ1 може да се използва като ефективна потенциална цел за модификация на вродения имунитет на растенията при развъждане, устойчиво на болести. Тъй като EIJ1 не засяга нормалния растеж на растенията, отслабването на функцията на EIJ1 чрез редактиране на генома може значително да повиши нивото на устойчивост на болести на културите с малък ефект върху растежа.

Препратки

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Реактивните кислородни междинни продукти посредничат в системна сигнална мрежа при установяването на имунитет на растенията. Клетка 92: 773–784

An, C, Mou, Z (2011) Салицилова киселина и нейната функция в имунитета на растенията. J Integr Plant Biol 53: 412–428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Йонният антипорт ускорява фотосинтетичната аклиматизация при променлива светлина среди. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) Независима от салицилова киселина ПОВИШЕНА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ КЪМ ЗАБОЛЯВАНЕ1 сигнализирането в имунитета на Arabidopsis и клетъчната смърт се регулира от монооксигеназата FMO1 и хидролазата Nudix NUDT7. Растителна клетка 18: 1038–1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) Водороден пероксид, произведен от NADPH оксидази увеличава натрупването на пролин по време на сол или манитолен стрес в Arabidopsis thaliana. Нов фитол 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Молекулярни шаперони и контрол на качеството на протеина. Клетка 125: 443–451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Растителни NB-LRR имунни рецептори: от разпознаване до транскрипционно препрограмиране. Клетъчен гостоприемник микроб 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Растителен имунитет: към интегриран поглед върху взаимодействията растение-патоген. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Фитопатогенни ефектори, подкопаващи имунитета на гостоприемника: различни врагове, подобно бойно поле. Микроб клетъчен гостоприемник 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) Тип I J-домен NbMIP1 протеини са необходим както за инфекция с вируса на тютюнева мозайка, така и за вроден имунитет на растенията. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Специфични взаимодействия между K домейните на AG и AGLs, членове на семейството на домейни MADS на ДНК свързващи протеини. Растение J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Директно взаимодействие между сигнализиращите протеини за резистентност към заболяване на Arabidopsis, EDS1 и PAD4. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) Необходими са балансирани ядрени и цитоплазмени активности на EDS1 за пълен вроден имунен отговор на растението. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Генът за бактериална резистентност Arabidopsis RPS4 е член на семейството TIR-NBS-LRR от гени за резистентност към болести. Растение J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime´nez-Go´mez, JM (2014) Глупости- медиираното разпадане на иРНК модулира нивата на имунния рецептор, за да регулира антибактериалната защита на растенията. Микроб клетъчен гостоприемник 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tobacco Tsip1, Zn пръстов протеин от DnaJ тип, се набира и потенцира Tsi1-медиирана транскрипционна активация. Растителна клетка 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume´, S, Parker, JE (2012) Молекулярни и пространствени ограничения върху NB-LRR рецепторното сигнализиране. Curr Opin Plant Biol 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 свързва разпознаването на патогенен ефектор със специфични за клетъчното отделение имунни отговори. Наука 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Гиберелините играят съществена роля в късната ембриогенеза на Arabidopsis. Nat Plants 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 медиира постембрионалното развитие чрез взаимодействие с PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR4. Растителна клетка 27: 3099–3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) Вирулентният ефектор на домейн AJ на Pseudomonas syringae ремоделира хлоропластите на гостоприемника и потиска защитите. Curr Biol 17: 499–508

Jones, J, Dangl, J (2006) Имунната система на растенията. Nature 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) За предпазители, примамки, примамки и капани: възприемане на патогени в растенията чрез ефекторни сензори тип III. Curr Opin Microbiol 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) Ядрената локализация на NPR1 е необходима за активиране на експресията на PR ген. Растителна клетка 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis е податлив на инфекция от гъбички от плесен. Растителна клетка 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Програмирана клетъчна смърт, митохондрии и свръхчувствителен отговор на растенията. Nature 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Ядрено-кодираните пластидни транзитни пептиди на Arabidopsis съдържат множество подгрупи на последователности с отличителни мотиви на последователности, насочени към хлоропласт. Растителна клетка 20: 1603–1622