Оценка на ефекта върху лигавичния имунитет на субединична ваксина срещу вирусна вирусна диария E2Fc и E2Ft

Резюме:

Класифицирана като инфекциозна болест от клас B от Световната организация за здравеопазване на животните (OIE), вирусната диария по говедата/болест на лигавицата е остро, силно заразно заболяване, причинено от вируса на вирусна диария по говедата (BVDV). Спорадичните ендемии на BVDV често водят до огромни икономически загуби за млекопреработвателната промишленост и производството на говеждо месо. За да хвърлим светлина върху превенцията и контрола на BVDV, ние разработихме две нови субединични ваксини чрез експресиране на слети рекомбинантни протеини E2 на вируса на говежда вирусна диария (E2Fc и E2Ft) чрез суспендирани HEK293 клетки. Ние също така оценихме имунните ефекти на ваксините. Резултатите показват, че и двете субединични ваксини предизвикват интензивен лигавичен имунен отговор при телета. Механично, E2Fc се свързва с Fc рецептора (Fc RI) на антиген-представящи клетки (APCs) и насърчава секрецията на IgA, което води до по-силен Т-клетъчен имунен отговор (Th1 тип). Титърът на неутрализиращите антитела, стимулиран от мукозно-имунизираната ваксина E2Fc субединица, достига 1:64, което е по-високо от това на ваксината E2Ft субединица и тази на интрамускулно инактивираната ваксина. Двете нови субединични ваксини за мукозен имунитет, разработени в това проучване, E2Fc и E2Ft, могат да бъдат допълнително използвани като нови стратегии за контрол на BVDV чрез повишаване на клетъчния и хуморален имунитет.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ключови думи: BVDV; субединична ваксина; лигавична ваксинация; молекулярни адюванти; Fc рецептор; феритин

1. Въведение

Вирусът на вирусна диария по говедата (BVDV), заедно с вируса на граничната болест (BDV) и вируса на чумата по свинете (CSFV), принадлежи към рода Pestivirus от семейство Flaviviridae [1]. Комбинацията от персистираща инфекция (PI) и цитопатична инфекция при телета често води до тежко мукозно заболяване със смъртност до 100% [2]. BVDV се разпространява широко в света, с относително висок процент положителни антитела. В Китай преобладаващите типове са 1B, 1M и 1Q от типа -1 BVDV [3–5]. Филогенетичният анализ разкри, че вирусът на вирусна диария по говедата тип 1 е внесен в Китай през 60-те години на миналия век и че най-малко осем BVDV-1 генотипа са в обращение в Китай. Сред тях 1B и 1m са основните генотипове [6]. Това е в съответствие с нашето епидемиологично изследване на BVDV в Тибет. Сферичният вирион на BVDV е приблизително 40-60 nm в диаметър и е обвит от капсула. Единичният плюс-верижен вирусен РНК геном на BVDV е с дължина приблизително 12,5 KB. Вирусният полипротеин впоследствие се разцепва чрез комбинация от гостоприемникови и вирусни протеази на четири структурни (C, E0, E1, E2) и осем неструктурни (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) протеини [7, 8]. BVDV-E2 притежава силна имуногенност и доказателствата показват, че неутрализиращи антитела (NAbs), индуцирани при заразени животни, са насочени главно към E2 [9]. Междувременно многовалентните E2 субединични ваксини, насочени към основните циркулиращи щамове на BVDV, могат да осигурят частична защита срещу хомоложни щамове. Рекомбинантна херпесвирусна ваксина, конструирана с BVDV E2 протеин и говежди херпесвирус 1 (BoHV-1) D протеин, индуцира специфични имунни отговори към двата вируса в гостоприемника след интраназална небулизация [10]. Следователно, може да е добра стратегия за контролиране на BVDV чрез използване на имунодоминантния BVDV E2 протеин като субединица ваксина. Носната кухина е богата на лимфоцити и антиген-представящи клетки, осигурява подходяща микросреда за мукозна имунизация и предпазва протеиновите ваксини от дестабилизиране от киселини и основи. В допълнение, интраназалната ваксина, индуцирана от имуноглобулин А (IgA) и резидентните В и Т лимфоцити на паметта в горните дихателни пътища са способни ефективно да блокират вирусната репликация [11]. Имунизацията през носната кухина не само предизвиква мукозен имунитет, но също така стимулира системни имунни отговори, които упражняват имунозащитни ефекти. Предишни проучвания са установили, че антигените могат да бъдат напълно доставени в лигавичния епител чрез насочване на субединични ваксини към неонаталния Fc рецептор (FcRn) на М клетки на лигавичния епител, като по този начин ефективно стимулират специфични имунни отговори [12–14]. Имунизиращите ефекти на спрея за нос са значително подобрени чрез използване на разтворима рекомбинантна ваксина, образувана чрез сливането на молекулярен адювант и имунен антиген [15]. IgGFc взаимодейства с FcRn на повърхността на имунните клетки, за да участва в транспорта на IgG през мукозни повърхности, подобрявайки имуногенността на Fc-слети протеини при бозайници [16]. Съобщава се, че IgGFc слетите протеини образуват стабилни димери чрез дисулфидни връзки в шарнирната област на Fc, за да увеличат полуживота и стабилността на рекомбинантните протеини, като по този начин подобряват клетъчния, мукозния и хуморалния имунен отговор [17,18]. Нови ваксини, медиирани от IgGFc, са успешно приложени към вируса на грип А (HA-HuFc) [19] и вируса на чума по свинете (CSFV-E2Fc) [20].

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Подходящата повърхностна модификация позволява на наночастиците да пребивават стабилно в кръвоносната система [21]. Характеризиращ се с голяма повърхност и куха сферична структура, се съобщава, че феритинът (Ft) образува наночастици от 24 идентични полипептида чрез самосглобяване с различни експресирани слети протеини, което насърчава разпознаването и усвояването на антиген от антиген-представящите клетки, като по този начин предизвикване на силен имунен отговор [22,23]. Феритинът намира широко приложение при разработването на ваксини. Ковалентна интеграция на антигена на рецептор-свързващия домен (RBD) на шиповия протеин SARS-CoV-2 и самосглобения нехем феритин на Helicobacter pylori води до мощно производство на неутрализиращи антитела. Феритиновите протеинови наночастици също имат силна способност да подобряват стабилността на антигена, да преодоляват биологичните бариери и да постигат целево доставяне. Тъй като нановаксините могат да бъдат ефективно уловени от дендритни клетки и макрофаги [24], феритиновите наночастици са нова и обещаваща платформа за доставяне на антиген. Понастоящем основните налични ваксини за BVDV са инактивирани ваксини и субединични ваксини, като и двете изискват времеемка и трудоемка ваксинация чрез интрамускулно инжектиране. Междувременно инактивираните ваксини, произведени чрез MDBK клетки, са склонни да индуцират неонатална панцитопения при говеда (BNP) [25]. Субединичните ваксини обаче са показали превъзходни профили на безопасност [26]. Доказано е, че интраназалната имунизация насочва антигени към Fc R рецептора, причинявайки мукозен и системен имунен отговор [15,16]. Въпреки това, имунните ефекти на интраназалната имунизация с BVDV ваксини и ефективността на BVDV-E2 в комбинация с молекулярни адюванти (IgGFc и Ft) остават слабо проучени. Следователно, разработването на мукозни ваксини с BVDV-E2 протеин за подобряване на тяхната имунна ефикасност е основен приоритет в тази област. В настоящото проучване, E2 протеин-кондензирани Fc или Ft субединични ваксини са генерирани в HEK293 клетки. Констатациите показват, че назалната ваксинация с BVDV E2Fc субединица ваксина е по-ефективна от назалната ваксинация с E2Ft субединица ваксина, което допълнително подкрепя индикациите, че E2Fc слетият протеин е по-мощен вариант за субединица ваксина.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

2. Резултати

2.1. Експресията на рекомбинантни протеини в суспендирани HEK293 клетки

Структурните диаграми на E2, E2Ft и E2Fc са показани на фигура 1A. Индиректните имунофлуоресцентни анализи бяха проведени първо с използване на запазено моноклонално антитяло (mAb) BVDVE2 за проверка на имуно-експресията на рекомбинантни слети протеини. Клетки, трансфектирани с плазмиди, съдържащи E2, E2Ft или E2Fc гени, излъчват флуоресцентен сигнал, докато фалшиво третирани клетки не показват флуоресцентен сигнал (Фигура 1B). Това показва силна експресия на E2, E2Ft и E2Fc в HEK293 клетки. За да се определи дали тези протеини са секреторно експресирани, супернатантите на HEK293 клетки, трансфектирани с плазмиди, съдържащи E2, E2Ft или E2Fc гени, се събират след 6 дни. Нивата на имуноекспресия на всеки протеин се анализират чрез Western blot с BVDV-E2 антитяло. Резултатите показват, че клетки, трансфектирани с плазмиди, съдържащи гени на E2, E2Ft и E2Fc, експресират съответните протеини с молекулни маси съответно 45 kDa, 60 kDa и 80 kDa (Фигура 1C). Резултатите от SDS-PAGE и Coomassie blue оцветяване показват, че ивиците на всяка проба са в съответствие с резултатите от блотирането (Фигура 1D). За да се гарантира специфичността и точността за откриване на имуноекспресията на протеина, първо бяха проведени анализи за предварителна абсорбция на BVDV-E2 mAb и последвани от анализи на вирусна репликация и Western blot, за да се удостовери специфичността на BVDV E2 mAb. Резултатите разкриха, че антитялото може да реагира само на протеина BVDV-E2 (Фигура S1). Взети заедно, доказателствата показват, че рекомбинантните протеини E2, E2Fc и E2Ft са експресирани изобилно в HEK293 клетки.

Фигура 1. Имуно-експресия и идентифициране на E2, E2Ft и E2Fc протеини в HEK293 клетки. (A) Конструктивните диаграми на BVDV-E2, BVDV-E2Ft и BVDV-E2Fc. (B) Откриване на имуно-експресия на рекомбинантни протеини чрез IFA; 48 часа след трансфектиране с E2, E2Fc или E2Ft, HEK293 клетките бяха фиксирани за IFA. BVDV E2 моноклонално антитяло и FITC-кози анти-миши IgG бяха приложени съответно като първично и вторично антитяло. Ядрото се оцветява с DAPI (синьо). Скалата представлява 20 µm. (C) Откриване на пречистени рекомбинантни протеини чрез Western blot. (D) Идентифициране на пречистени рекомбинантни протеини чрез SDS-PAGE.

2.2. Активиране на APC-Fc RI от BVDV-E2Fc

Антигенното разпознаване на BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) от макрофагите играе важна роля в активирането на имунния отговор. За да се открие ефектът на активиране на слетия протеин върху имунната система, функцията на разпознаване и фагоцитната активност на слетия протеин от говежди алвеоларни макрофаги (BAM) бяха проверени in vitro. Резултатите показват, че CD64 (Fc RI), открит от Cy3-маркирани кози анти-заешки IgG антитела (червени) маркери, е локализиран в цитоплазмата и клетъчната мембрана в говежди макрофаги. E2Fc беше открит с помощта на кози анти-миши IgG (зелена флуоресценция). Изображенията бяха обединени за анализ на ко-локализацията на CD64 (Fc RI) и E2Fc в говежди алвеоларни макрофаги (жълт цвят; Фигура 2А). Обратно, CD64 не се локализира съвместно с E2 или E2Ft. Резултатите показват, че транслокацията на слетия протеин E2Fc през мукозната бариера е медиирана от Fc RI.

Фигура 2. Активиране на APC-Fc RI от BVDV-E2Fc. (A) Анализ на съвместна локализация на CD64 (Fc RI) с E2Fc протеин на BAM беше открит чрез конфокална микроскопия. CD64 (Fc RI) върху BAM се оцветява със заешки анти-CD64 и Cy3-маркирани кози анти-заешки IgG като първични и вторични антитела, съответно.

Фагоцитозата, поглъщането на частици от макрофагите, се измерва като скорост на фагоцитоза. Степента на фагоцитоза на FITC-конюгирани микросфери, E2 протеин, E2Ft и E2Fc от говежди алвеоларни макрофаги е съответно 28,9%, 55,6%, 57,1% и 65,6%. С други думи, степента на фагоцитоза на E2Fc е по-висока от тази на E2Ft, което допълнително доказва, че улавянето на антигени от моноцити е завършено чрез свързване на специфичен рецептор на неговата повърхност със съответните лиганди. Въпреки това, говеждите алвеоларни макрофаги не притежават рецептори за E2 и E2Ft протеини и те само отстраняват чужди тела чрез фагоцитоза, което е най-основният защитен метод на тялото (Фигура 2B).

2.3. Мощни мукозни и хуморални имунни отговори, индуцирани от E2Fc in vivo

Процедурата за имунизиране на телета е изобразена на Фигура 3А. Нивата на IgA и SIgA, произведени от телета, имунизирани със слетия протеин, се откриват чрез индиректен ELISA. Проби от серум, изпражнения и назална лигавица бяха събрани и открити с търговски комплект ELISA. Групата, имунизирана с E2Fc, показва най-високите нива на IgA и SIgA в серума и лигавицата, както при интрамускулно, така и при имунизирани с лигавица животни (p < 0.01) (Фигура 3B, C). Не са наблюдавани значителни разлики в нивата на IgA между E2- E2-имунизираната група и E2Ft-имунизираната група, но те се различават в нивата на SIgA (p <0,05). В заключение, слетият протеин E2Fc е в състояние да индуцира по-мощни мукозни и хуморални имунни отговори, отколкото други протеини.

2.4. E2Fc може да индуцира по-силни Т-клетъчни имунни отговори (Th1 тип) срещу BVDV в сравнение с E2Ft In Vivo

Th{{0}}тип цитокин IFN-, експресиран от Т клетки и NK клетки, медиира клетъчния имунитет, който е от съществено значение за изчистването на вируса. За да се открие разпределението на IFN-експресиращи CD4+ и CD8+ Т клетки при телета, лимфоцитите бяха изолирани от PBMC на телета 35 дни след имунизацията. Лимфоцитите бяха стимулирани с инактивиран BVDV и впоследствие беше приложена поточна цитометрия за идентифициране на IFN- -секретиращите CD4+ и CD8+ Т клетки. Мукозно-имунизирани групи с E2Fc и E2Ft показват значително по-високи пропорции на IFN- -секретиращи CD4+ и CD8+ Т клетки в сравнение с групата Е2. Групата, която беше имунизирана срещу мукоза с E2Fc, имаше по-високо ниво на IFN- -секретиращи CD3+ CD8+ Т клетки, отколкото групата, имунизирана с инактивиран BVDV (p <0,05) (Фигура 4). Въпреки това, не се наблюдава значителна разлика в IFN- -секретиращите CD3+ CD4+ Т клетки между групите с имунизиран срещу лигавица E2Fc и с инактивиран BVDV. В обобщение, както интрамускулната инжекция, така и мукозната имунизация с E2Fc индуцират по-силни Т-клетъчни имунни отговори (Th1 тип) срещу BVDV в сравнение с E2Ft.

Фигура 3. Блок-схема на експериментите с имунизация на телета и мукозни и хуморални имунни отговори, индуцирани от E2Fc in vivo. (A) Конструиране на BVDV субединица ваксина и схема на експеримента за имунизация на телета. (B, C) Измерването на нивата на (B) IgA и (C) секреторни IgA в назални тампони, изпражнения и серумни проби, събрани на 14-ия ден след вторична имунизация чрез ELISA. n=5, * p < 0.05 и ** p < 0,01

Фигура 4. Т-клетъчни имунни отговори срещу BVDV in vivo. Процент на (A) CD4+ IFN- + Т клетки и (B) CD8+ IFN- + Т клетки след стимулация в говежди мононуклеарни клетки от периферна кръв. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 и ** ** p < 0,0001.

2.5. Имунизацията с рекомбинантни субединични ваксини повишава съдържанието на цитокини от Th1-тип

За да проверим ефекта на рекомбинантната субединица ваксина върху клетъчните имунни отговори, ние анализирахме нивата на пролиферация на лимфоцити и цитокини в периферната кръв на имунизираните телета. Първо, антикоагуланти бяха събрани от телета 49 дни след имунизацията. Лимфоцитите бяха стимулирани от ултравиолетово инактивирания BVDV след разделяне и бяха измерени корелирани индекси. В сравнение с PBS групата, индексите на лимфоцитна стимулация (SI) на групите, имунизирани с субединични ваксини (E2, E2Fc и E2Ft), всички бяха повишени в различна степен, с най-високия индекс на лимфоцитна стимулация (p < 0. 001) в имунизираните с E2Fc и групите с инактивирана ваксина (Фигура 5А). Освен това бяха приложени търговски двойни антитела сандвич ELISA комплекти срещу говежди IFN-, IL-2 и IL-4 за откриване на нивата на цитокини тип Th1- и Th2- в периферна кръв на имунизирани телета. В сравнение с телета, третирани с PBS, нивата на IFN- и IL-2, експресирани в имунизираните телета, са значително по-високи от IL-4 на 49-ия ден след имунизацията. Нивата на IFN- бяха по-високи в групата с IN-E2Fc, отколкото в групата с инактивирана ваксина (p <0,05), но нямаше разлика в IL-2 и IL-4 между IM-E2Fc и групите с инактивирана ваксина (Фигура 5B–D). Тези резултати предполагат, че IN-E2Fc субединичната ваксина значително насърчава Th1-тип клетъчен имунен отговор при телета.

Фигура 5. Увеличаване на съдържанието на Th1-тип цитокини след имунизация с рекомбинантни субединични ваксини. (A) Клетъчната пролиферация на лимфоцити от периферна кръв на телета след имунизация 49 дни беше открита чрез комплект за анализ на лимфоцитна пролиферация. (B–D) Th1 и Th2 цитокините в супернатантите на лимфоцитите са открити чрез говежди IFN-, IL-2, IL-4 сандвич ELISA комплект с двойно антитяло. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 и *** p < 0.00

2.6. BVDV-специфичните антитела могат да бъдат силно индуцирани от рекомбинантни E2Ft и E2Fc субединични ваксини in vivo

BVDV-специфични антитела бяха открити чрез ELISA, за да се изследва хуморалният имунен отговор, индуциран от E2, E2Ft и E2Fc субедничните ваксини. BVDV-специфичните антитела не могат да бъдат открити във всички телета преди имунизацията. Нивата на антитела, индуцирани от E2Ft и E2Fc субединични ваксини, са значително по-високи от тези на E2 групата 21 дни след началото (първа доза) на имунизацията (p < 0.00 1). Нивата на антитела за мукозен имунитет на 35 дни (14 дни след втората доза) и 49 дни (14 дни след третата доза) се различават значително между групите E2Ft и E2 (p <0,05). В допълнение, E2Fc е значително по-висок от E2 (p <0.001). Нивото на антителата в групата с мукозна имунизация (групи IN-E2Ft и IN-E2Fc) е по-високо от това на групата с интрамускулна инжекция (групи IM-E2Ft и IM-E2Fc), а нивото на антитела в групата с инактивирана ваксина не е значително различен от този на групата IN-E2Fc (Фигура 6). Взети заедно, рекомбинантните E2Ft и E2Fc субединични ваксини са в състояние да индуцират силни хуморални имунни отговори и лигавичният имунитет е по-добър от този на интрамускулната инжекция, което показва, че рекомбинантните E2Fc и E2Ft субединични ваксини са силно антигенни.

Фигура 6. Откриване на антитела в серумни проби на имунизирани телета чрез ELISA на ден 0, 21, 35 и 49 след имунизацията. n=5, * p < 0.05 и *** p < 0,001

2.7. Неутрализиращи антитела срещу BVDV, индуцирани от рекомбинантни субединични ваксини in vivo

Бяха взети кръвни проби от югуларната вена на телета на 0, 21, 35 и 49 дни след първата имунизация. Серумните проби се разделят асептично и се инактивират във водна баня при 56 ° С в продължение на 30 минути. Бяха проведени неутрализационни анализи за определяне на нивата на антитялото в отделения серум. Неутрализиращите антитела срещу BVDV бяха открити в мукозно-имунизирани групи с рекомбинантни субединични ваксини, с титър на E2Fc неутрализиращото антитяло до 1:64. Това е сравнимо с инактивираната ваксина и по-добро от интрамускулно инжектираните E2Ft и E2Fc рекомбинантни субединични ваксини (Фигура 7).

Фигура 7. Откриване на неутрализиращи антитела в серумни проби на имунизирани телета на ден 0, 21, 35 и 49 след имунизацията. Пробите от инактивиран серум се разреждат в съотношение и се инкубират предварително с 200 TCID50 BVDV XZ02 за 1 час. Серумните проби впоследствие се добавят към клетките в 96-плочки с ямки и се инкубират в продължение на 72 часа. Заешко анти-Е2 антитяло и FITC-конюгирани кози анти-заешки IgG бяха използвани като първични и вторични антитела. n=5, * p < 0,05 и ** p < 0,01

3. Дискусия

Съобщава се, че протеинът E2, експресиран в клетки на бозайници, е по-ефективен при неутрализиране на защитата срещу BVDV, отколкото протеинът E2, получен от системата за експресия на бакуловирусни насекоми (brE2) [27]. Суспензионната култура на клетки от бозайници се характеризира с по-прост процес и по-висок добив [28]. Суспендираните HEK293 клетки са способни да растат при условия без серум и броят на клетките е многократно по-голям от този на прилепналата култура, която може да се използва за широкомащабно производство на антитела [29]. Ефективността на експресията на pcDNA3.1, комбинирана с преходната експресионна система на еукариотни суспензионни клетки, приложена в това изследване, е сравнително висока и рекомбинантният протеин може да бъде събран шест дни след трансфекцията с концентрация до 30 mg·L -1, което беше достатъчна за последващо приложение върху животни.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Вирусът на вирусна диария по говедата нахлува главно в горните дихателни пътища и храносмилателния тракт, което причинява ринорея, кашлица, задух, повишаване на телесната температура и левкопения, и е последвано от виремия, след като вирусът навлезе в кръвта. Следователно инхалаторната интраназална ваксинация може да осигури по-ефективна защита от ваксините, които се доставят директно до местата на вирусна инфекция. Наскоро беше показано, че интраназалната имунизация може да представи антигени на Fc R рецептори и да предизвика мукозен и системен имунен отговор [16]. Освен това, говежди IgG1Fc е способен да се свързва с говежди Fc R, рецептор с висок афинитет за IgG [30]. Нашите резултати предоставиха доказателство, че Fc от говежди IgG1 може да се свърже с Fc RI върху говежди алвеоларни макрофаги (BAM) за постигане на трансмукозен транспорт. Това може да удължи дълготрайността на синтезирания протеин в тялото и да насърчи производството на специфични антитела. Нашите резултати разкриха, че нивото на SIgA, индуцирано от мукозно имунизиран E2Fc, е значително по-високо от това на мукозно имунизирания E2 (p < 0.{{30}}1). Обаче се наблюдава само малка разлика между интрамускулно инжектираната E2Fc група и мукозно имунизираната Е2 група. Това може да се дължи на факта, че лигавицата на тънките черва и мезентериалните лимфни възли ще освободят малко количество SIgA в отговор на интрамускулно инжектиране с E2Fc с адювант с 1313VG. Нивата на IFN-, предизвикани от мукозна имунизация с E2Fc, са значително по-високи от тези на мукозна имунизация с E2 (p <0,01), интрамускулна имунизация с E2Fc и мукозна имунизация с E2Ft. Нивата на IL-2, предизвикани от мукозна имунизация с E2Fc, са значително по-високи от тези на мукозна имунизация с E2 и интрамускулна имунизация с E2Ft (p <0,01). В следващата стъпка общите нива на антитела бяха открити след третата имунизация. Резултатите показват, че лигавичната имунизация с E2Fc индуцира значително по-високи нива на общите антитела в сравнение с мукозната имунизация с E2 (p <0,001), докато нивата на антитела, индуцирани от интрамускулно инжектирания E2Fc и мукозно имунизирания E2, са сравними с интрамускулно инжектирания E2Ft група. Общите имунни ефекти от мукозната имунизация на ваксината с E2Fc субединица са по-добри от тези на интрамускулната имунизация. Мукозната имунизация на E2Fc не само индуцира секрецията на SIgA, но също така предизвиква специфичен Th1-тип клетъчен имунен отговор и хуморален имунен отговор.

Беше съобщено, че CSFV E2 гликопротеинът, показан на повърхността на феритиновите наноклетки, индуцира мощна експресия на вродените имунни цитокини IL-4 и IFN- при зайци [31]. Ваксина от наночастици, разработена чрез ковалентно свързване на самоорганизиран феритин към рецепторния свързващ домен (RBD) на SARS-CoV-2, също беше доказано, че предизвиква силен хуморален и клетъчен имунен отговор [24]. Носната кухина е богата на свързана с лигавицата лимфоидна тъкан и ние показахме, че нивата на SIgA, индуцирани от имунизиран с лигавицата E2Ft, са по-високи от тези на E2 (p < 0.05). CD4+ и CD8+ Т-клетките са значително по-високи в мукозно-имунизираната E2Ft група, отколкото в E2 групата (р <0,01). CD4+ и CD8+ Т клетки играят жизненоважна роля в защитата срещу вирусна инфекция [32]. Резултатите от неутрализационния тест и анализа на антитела също показват, че мукозната имунизация с E2Ft е по-ефективна от имунизацията с интрамускулни E2Ft и E2. Това вероятно се дължи на факта, че системата за разпознаване и представяне на антигена на организма ефективно фагоцитира феритин (E2Ft) с 24 полимерни субединици, което води до чувствителен и ефективен отговор на антитела in vivo. Антителата се секретират от плазмените клетки и нивата на неутрализиращи антитела са важен индикатор за откриване на имунни ефекти. Когато силата на неутрализиращото антитяло на BVDV ваксината е по-голяма от 1:24, това показва, че ваксината е имуногенна [33].

В това проучване бяха извършени неутрализационни анализи за оценка на нивата на неутрализиращи антитела, индуцирани от Е2 рекомбинантни протеини. Следователно, югуларната венозна кръв на имунизираните телета беше събрана, за да се открие нивото на IgG антитела в серума. Резултатите показват, че всички имунизирани телета произвеждат различна степен на неутрализиращи антитела на 14-ия ден след втората имунизация. Нивата на неутрализиращи антитела при телета от групата с мукозно имунизирана E2Fc и групата с инактивирана ваксина се повишават значително и остават 1:64 на 14 дни след третата имунизация (титрите на неутрализиращите антитела са открити до шестата седмица). Заслужава обаче да се отбележи, че нивата на неутрализиращи антитела на мукозно имунизирани E2 и E2Ft и интрамускулно имунизирани E2Fc и E2Ft групи се поддържат между 1:8 и 1:16. Ние заключаваме, че антигените на E2Fc рекомбинантната ваксина се освобождават бавно от Fc рецептора, като по този начин причиняват продължителни хуморални и клетъчни имунни отговори. Обратно, другите четири субединични ваксини се намират за кратко в тялото поради липсата на съответен рецептор. Следователно може да е необходима бустер ваксинация или промяна на адюванта, за да се постигнат очакваните имунни ефекти.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

4. Материали и методи

4.1. Вирус и клетки

Тип 1b BVDV XZ02 щам (GenBank номер за достъп: MF278652) беше изолиран от Тибет и култивиран с помощта на говежди бъбречни клетки Madin-Darby (MDBK). Вирусът на епидемична диария по свинете (PEDV) беше запазен в нашата лаборатория. MDBK клетки бяха закупени от ATCC (ATCC-CCL-22) и поддържани в DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Шанхай, Китай), а говежди алвеоларни макрофагални клетки (BAM) бяха поддържани в RPMI{ {8}} (Кат. № SH30027, Cytiva, Шанхай, Китай); всички среди съдържат 10% топлинно инактивиран конски серум (Кат. № 16050122, Gibco, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и се инкубират при 37 ◦C в овлажнен инкубатор с 5% CO2. Суспендирани HEK293 клетки бяха закупени от ATCC (ATCC CRL-1573) и култивирани в свободна от серум KOP293 среда (кат. № M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, Китай).

4.2. Антитела и комплекти за тестване

Следните антитела и комплекти за тестване бяха използвани в това проучване: анти-BVDV E2 антитяло (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); HRP-козе анти-мише антитяло (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-козе анти-мише антитяло (Кат. № AS008, ABclonal, Бостън, Масачузетс, САЩ); FITC-козе анти-мише антитяло (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (Fc RI) антитяло (Cat NO. abs135850, Absin, Шанхай, Китай); Alexa Fluor® 488 козе анти-мише IgG антитяло (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-козе анти-заешко IgG антитяло (Кат. № ab6939, Abcam, Cambridge, UK); FITC конюгирани микросфери (Кат. № 17155, Polysciences, Warrington, PA, САЩ); FITC-CD4 антитяло (кат. № MCA1653, BIO-RAD, Херкулес, Калифорния, САЩ); PE-CD8 антитяло (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, СА, САЩ); IFN- антитяло (Кат. № MCA1783A, BIORAD, Херкулес, Калифорния, САЩ); FITC-козе анти-заешко IgG антитяло (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Комплектите и реагентите включват BVDV-E2 комплект за откриване на антитела (кат. № SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Шанхай, Китай); Комплект за откриване на IgA (кат. № 177090b, CAMILO, Nanjing, Китай); Комплект за откриване на SIgA (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Китай); Комплект за откриване на IFN (Кат. № 177020b, CAMILO, Nanjing, Китай); Комплект за откриване на IL-2 (кат. № 177028b, CAMILO, Нанкин, Китай); Комплект за откриване на IL-4 (кат. № 1770131b, CAMILO, Нанкин, Китай); TA-293 трансфекционен реагент (Кат. № R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Китай); Среда за разделяне на лимфоцити (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Изграждане на плазмиди

Скъсеният E2 (означен по-нататък като E2) беше генериран чрез премахване на трансмембранната област на E2 (номер за достъп на генна последователност: MF278652) с помощта на уеб инструмента TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/, достъпен на 12 януари 2023 г.) и добавяне на хистидинов маркер към С-края (Фигура 1А). Генната последователност е показана в допълнителен материал S1. Плазмидът E2Fc беше конструиран чрез добавяне на Fc фрагмент, съдържащ шарнирната област на говежди IgG1 (номер за достъп: x62916.1) към С-терминала на Е2 с ординалната позиция на E2-синтетичен гъвкав пептид-шарнирна област -CH2-CH3 домейн-6 × His [20]. Генната последователност е показана в допълнителен материал S2. E2Ft плазмидът е конструиран чрез свързване на E2 с феритин на Helicobacter pylori (остатъци 5–167) чрез линкер (Gly)3Ser [34]. Генната последователност е показана в допълнителен материал S3. IL-2 сигналният пептид се добавя към N-терминала на E2, E2Fc и E2Ft, за да се улесни секреторната експресия [35]. Целевите гени (E2, E2Ft и E2Fc) бяха клонирани в pcDNA3.1 с BamHI и XhoI, съответно.

4.4. Експресия и пречистване на протеини

Приблизително 10{{30}} mL суспендирани HEK293 клетки в експоненциален стадий (приблизително 2~4 × 106 клетки/mL) бяха трансфектирани със съответните плазмиди. Накратко, 5 ml KPM (трансфекционен буфер) и 100 µg стерилна плазмидна ДНК бяха добавени към стерилна центрофужна епруветка и 5 mL KPM и 500 µL TA-293 (кат. № R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Китай ) трансфекционните реагенти се добавят към друга стерилна центрофужна епруветка. След това към разредения плазмид се добавя разреден реагент за трансфекция и се разбърква старателно. След инкубиране в продължение на 10 минути при стайна температура, към клетките се добавя комплекс от реагент за ДНК-трансфекция, придружен от разклащане. Клетките се инкубират в овлажнен инкубатор при 37 ◦C с 5% CO2 при скорост на разклащане от 140 rpm/min. Клетките се събират шест дни след трансфекцията чрез центрофугиране в продължение на 30 минути при 12,000 rpm/min и се филтруват с 0,22 mm филтър за отстраняване на остатъчните клетъчни остатъци. Колоните за афинитетна хроматография с никел (Cat NO. 17531801, GE, Бостън, Масачузетс, САЩ) бяха използвани за маркирано с хистидин (His) афинитетно пречистване на E2, E2Ft и E2Fc протеини [36]. Накратко, 100 mL проби бяха добавени към афинитетни колони със скорост 1 mL/min. След това колоните се промиват с пет колонни обема (CV) буфер А (0.1 М PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) при скорост 1 mL/min. Накрая, концентрационни градиенти на имидазол (от 0 до 500 mM) бяха оставени да текат през колоната със скорост от 1 mL/min за събиране на течността, съответстваща на основния пик. Концентрациите на протеин се определят количествено с BCA комплект за откриване на протеини. Събраните протеини бяха допълнително използвани за Western blot анализ.

растение цистанче, повишаващо имунната система

4.5. Western Blot

Протеините се разделят с помощта на SDS-PAGE. След като бъдат прехвърлени към NC филтърната мембрана, протеините се блокират с 2% обезмаслено мляко на прах за една нощ при 4 °C и впоследствие се инкубират с анти-BVDV E2 антитяло (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) в продължение на 2 часа при стайна температура . След промиване три пъти с TBS-T, мембраните се инкубират с HRP-кози анти-миши (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) антитела за 1 час при стайна температура. След промиване три пъти с TBS-T, хемилуминесцентната система ECL беше използвана за откриване на протеинова имуноекспресия.

4.6. Индиректна имунофлуоресценция

За имунофлуоресцентно откриване на имуно-експресията на рекомбинантни протеини, HEK293 клетки бяха трансфектирани с плазмиди, експресиращи E2, E2Ft и E2Fc; 48 часа след трансфекцията клетките се фиксират с параформалдехид за 15 минути. След промиване три пъти с PBS, клетките се пермеабилизират с 0.5% Trition-X100 за 15 минути. След интензивно промиване с PBS, клетките впоследствие се блокират с 2% BSA и се инкубират с 1: 500 разредено BVDV E2 моноклонално антитяло (приготвено в нашата лаборатория) при 37 ° C в продължение на 2 часа. Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) или FITC-конюгирани кози анти-миши антитела (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) бяха приложени като вторично антитяло. Ядрата се оцветяват с DAPI в продължение на 10 минути при стайна температура. Протеините се визуализират чрез конфокална микроскопия (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Германия) [37].

4.7. APC-насочване на E2Fc рекомбинантния слят протеин

Беше извършен имунофлуоресцентен колокализационен анализ, за ​​да се потвърди свързването на BVDV-E2Fc слетия протеин към Fc RI върху говежди алвеоларни макрофаги (BAM). Накратко, 3 ug пречистен E2, E2Ft или E2Fc бяха добавени към говежди алвеоларни макрофаги. След инкубиране в продължение на 12 часа при 37 ◦C, клетките се промиват с 0.1% BSA във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се фиксират с метанол/ацетон (1:1) при 20 ◦ ° С. След това клетките се пермеабилизират с 0, 5% Trition-X100 за 15 минути и се блокират с 2% BSA при 37 ° C за 2 часа. След това клетките се промиват три пъти с PBS и се инкубират с BVDV E2 моноклонално антитяло (миши източник; приготвено в нашата лаборатория) и говеждо CD64 (Fc RI) поликлонално антитяло (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China) за 2 ч. Клетките се промиват три пъти с PBS и се покриват с Alexa Fluor® 488 кози анти-миши IgG (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) и Cy3-белязано козе анти-заешко IgG антитяло (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) за 1 час при стайна температура. Ядрата се оцветяват с DAPI. Изображенията бяха фотографирани с помощта на имунофлуоресцентна колокализация (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Германия).

4.8. Определяне на фагоцитната скорост на говежди алвеоларни макрофаги

За да се определят ефектите на рекомбинантните протеини E2, E2Ft и E2Fc върху фагоцитозата на говежди алвеоларни макрофаги (BAM), говежди алвеоларни макрофаги в концентрация 1 × 106 клетки/mL бяха предварително инкубирани с рекомбинантни протеини E2, E2Ft или E2Fc (всички концентрации бяха коригирани до 350 ng/mL) за 4 часа. След трикратно промиване с PBS, 10 µL FITC-конюгирани микросфери (Кат. № 17155, Polysciences, Warrington, PA, САЩ) и 990 µL от RPMI-1640 среда бяха добавени към всяка ямка . След 2 часа инкубация, клетките се промиват с PBS за отстраняване на извънклетъчните FITC-конюгирани микросфери. Прилепналите макрофаги се усвояват с трипсин (Gibco), съдържащ 0,05% EDTA, и усвояването се прекратява с 1640 пълна среда след пълно усвояване. След това клетките се добавят към горния слой от 10 mL PBS с 0.45 g глюкоза и 0.3 g BSA, последвано от градиентно центрофугиране при 400 × g за 10 минути. Отделените клетки бяха промити два пъти с PBS и ресуспендирани с 800 uL PBS. Интензитетът на флуоресценция при 488 nm се определя от поточен цитометър на Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Пасадена, Калифорния, САЩ).

4.9. Приготвяне на ваксина и процедура за имунизация

HEK{{0}}експресирани E2, E2Ft и E2Fc бяха емулгирани с IMS 1313VG адювант (Seppic, Франция) в равни пропорции до крайна протеинова концентрация от 200 µg/mL и съхранени при 4 ◦C след проверка на качеството. BVDV-E0 и BVDV-E2 антитела отрицателни (Кат. № SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) 3-месечни телета (n=35) са били разделени на седем равни групи. Телетата в четири групи бяха назално-мукозни имунизирани (в) съответно с PBS, E2, E2Ft и E2Fc. Телетата в останалите три групи бяха интрамускулно инжектирани (im) с E2Ft, E2Fc и BVDV инактивирани ваксини като положителна контрола (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Китай). Телетата се ваксинират на ден 1, 21 и 35 от експеримента и всяко теле се инокулира с 1 mL ваксина с протеинова концентрация 200 µg/mL. Кръвта беше събрана от телета на дни 1, 21, 35 и 49 от експеримента за други индекси (Фигура 3А). Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по етика на научните изследвания на Колежа по ветеринарна медицина, Хуажонг селскостопански университет, Хубей, Китай (№ HZAUCA-2022-0011).

4.10. Производство на IgA в изпражненията и серума

Назални тампони, изпражнения и серумни проби от телета бяха събрани на 14-ия ден след вторичната имунизация. Пресните кравешки изпражнения се разреждат в 15% фекална суспензия с PBS, суспензията се центрофугира при 18,000× g при 4 ◦C за 30 минути и супернатантата се събира за по-късна употреба. Назалните тампони бяха събрани чрез завъртане на стерилния памучен тампон дълбоко в носната кухина на кравата за 6-8 завъртания. Тампоните се поставят в епруветка с PBS, съдържаща 1% пеницилин-стрептомицин, и се смесват обилно. Пробите се центрофугират при 18,000× g при 4 ◦C за 10 минути и супернатантата се събира за по-късна употреба. Пробите от говежда кръв бяха събрани с епруветка, съдържаща етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA)--антикоагулант, и серумните проби бяха получени чрез центрофугиране на кръвните проби при 4 ◦C и 400 g за 5 минути. IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Китай) и SIgA бяха открити с комплекта ELISA (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, Китай) съгласно инструкциите на производителя.

4.11. Анализ с поточна цитометрия

Честотите на IFN- -продуциращи CD3+ CD4+ и CD3+ CD8+ Т клетки сред CD3+ лимфоцитите в кръвта бяха анализирани с помощта на поточна цитометрия. Пробите са събрани 14 дни след бустер имунизацията [36]. Мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) бяха ресуспендирани и разредени до 1 × 106 клетки/mL с пълна среда RPMI-1640, стимулирани с UV-инактивиран BVDV XZ02 (MOI=0.1) и инкубирани при 37 ◦C с 5% CO2 за 72 часа. Конканавалин А (Con A) (5 µg/mL; Sigma) се използва като положителна контрола. Инхибиторът на протеиновия транспорт брефелдин А (BFA, 3 µg/mL, eBioscience) се добавя към всички проби 12 часа преди събирането на клетките, за да се блокира секрецията на IFN. Количество от 200 µL от клетката се прехвърля в FCM епруветки и се оцветява с FITC-маркирано CD4 антитяло (Кат. № MCA1653, BIO-RAD, Херкулес, Калифорния, САЩ) за 30 минути при 4 ◦C на тъмно. След като бяха промити три пъти с PBS, клетките бяха инкубирани с R-PE-белязано CD8 антитяло (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, СА, САЩ). След промиване три пъти, клетките се инкубират с мишо анти-говеждо IFN-антитяло (кат. № MCA1783A, BIO-RAD, Херкулес, Калифорния, САЩ) в продължение на 20 минути на тъмно за оцветяване с вътреклетъчни цитокини. След промиване клетките се ресуспендират в PBS, съдържащ 1% FBS. Поточната цитометрия беше проведена с поточен цитометър FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, САЩ) и данните бяха събрани и анализирани, както е описано по-горе [38].

4.12. Лимфоцитна пролиферация и откриване на цитокини

Антикоагулираните периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC) на всяко теле бяха изолирани с помощта на среда за разделяне на лимфоцити (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) на ден 49 след имунизацията. Лимфоцити от периферна кръв от говеда се разреждат с 10% FBS 1640 среда до 1 × 106 клетки/mL. След това, 100 µL разредени клетки бяха добавени към всяка ямка на 96-плака с ямки и стимулирани съответно с UV-инактивиран BVDV, конканавалин (положителна контрола) или културална среда (отрицателна контрола). След 72 часа инкубиране при 37 °C с 5% CO2, 30 µL MTS се добавят към всяка ямка и клетките продължават да се култивират при 37 °C в продължение на 1 час съгласно инструкциите на производителя. Абсорбцията при 492 nm се измерва с автоматизиран анализатор за микроплака. Титърът на лимфоцитна пролиферация на всяка проба се определя чрез индекс на стимулация (SI). Изчислен SI=(OD на пробата-OD на празната контрола)/(OD на отрицателната проба-OD на празната контрола) [39]. Интерферон (IFN)-, интерлевкин (IL)-2 и интерлевкин (IL)-4 бяха открити с помощта на комплекти ELISA. Накратко, PBMCs бяха изолирани и разредени до 4 × 106 клетки/mL със среда RPMI 1640, съдържаща 10% FBS и поставени в 24-плаки за тъканни култури. Клетките се стимулират с инактивиран BVDV XZ02 (MOI=1) в продължение на 48 часа при 37 ◦C и супернатантата впоследствие се събира. IFN- (Кат. № 177020b, CAMILO, Нанкин, Китай), IL-2 (Кат. № 177028b, CAMILO, Нанкин, Китай) и IL-4 (Кат. № 1770131b, CAMILO, Нанкин, Китай) нивата са открити с помощта на съответните комплекти ELISA съгласно инструкциите на производителя. Съдържанието на IFN-, IL-2 и IL-4 в пробата се изчислява с помощта на стандартната крива.

4.13. Серологични тестове

За откриване на E2/E0 антитела бяха взети кръвни проби от всяко теле на дни 0, 21, 35 и 49 след имунизацията. Серумните проби се събират чрез центрофугиране на кръвни проби при 1000 × g за 20 минути. Серумните проби бяха обработени в съответствие с изискванията на BVDV E2 комплекта за откриване на антитела (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Микроплаки, покрити с BVBV E2 антиген, се уравновесяват за 20 минути при стайна температура. След това към микроплаката бяха добавени съответно 50 µL отрицателна контрола, положителна контрола и серумни проби. Количество от 50 µL антитяло за откриване, белязано с пероксидаза от хрян (HRP), впоследствие се добавя към микроплаката и се инкубира при 37 °C за 60 минути. След промиване пет пъти с промиващ буфер се добавя хромогенен разтвор за измерване на абсорбцията на четеца на микроплаки при 450 nm, за да се определи нивото на Е2 антитяло във всяка имунизационна група. Методът на серум с фиксирано разреждане на вируса беше използван за откриване на нивото на неутрализиращи антитела в серумните проби. Накратко, напълно инактивираните имунни серумни проби бяха разредени с 2-1 до 2-12 и 50 µL серум при всеки титър на разреждане бяха добавени към 96-плаки с ямки. Впоследствие към всяка ямка се добавят 50 µL разреден вирусен разтвор, съдържащ 200 TCID50- BVDV XZ02 вирус. Плочите се разклащат внимателно и се смесват. След 1 час инкубиране при 37 ◦C, MDBK клетки с концентрация от 5 × 105 клетки/mL се добавят към 96-плаки с ямки и се инкубират при 37 ◦C в овлажнен инкубатор с 5% CO2 за 72 h. За да се открие неутрализиращият ефект на серумните проби, клетките бяха третирани с E2-специфично антитяло като първично антитяло (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) и FITC-конюгирани кози анти-заешки IgG като вторично антитяло (Кат. № AS011, ABclonal, Бостън, Масачузетс, САЩ). Типичен зелен флуоресцентен сигнал показва липсата на неутрализация. Снимките са направени под флуоресцентен микроскоп (TE2000, Nikon, Токио, Япония). Серумният неутрализационен титър се изчислява съгласно метода на Reed-Muench и максималното разреждане на серума, което може напълно да инхибира флуоресценцията, се определя като неутрализационен титър на серума.

4.14. Откриване на специфичност на BVDV E2 моноклонално антитяло

Първо бяха проведени анализи за предварителна абсорбция на BVDV E2 моноклонално антитяло, последвани от анализи на вирусна репликация и Western blot за доказване на специфичността на BVDV E2 mAb. За анализ на вирусна репликация, 400 TCID50 от BVDV се инкубират предварително с PBS и 100 µg или 200 µg E2 mAb при 37 ◦C за 1 час, съответно. След инкубиране, предварително обработеният BVDV се инокулира в MDBK клетки и клетките се култивират при 37 °C в овлажнен инкубатор. Клетките се събират при 18 или 24 hpi (час след заразяването) и РНК се екстрахира с TRIZOL реагент. RT-qPCR се провежда за определяне на относителната експресия на BVDV E2 гена. За Western blot анализ, E2 mAb се инкубира предварително с Tween20, PEDV S протеин или BVDV E2 протеин в TBS-T за 2 часа при 4 °C, съответно. Предварително обработеното E2 mAb беше подложено на Western blot анализ като първично антитяло за откриване на реакцията към BVDV E2 или PEDV S протеина.

4.15. Статистически анализ

За всички анализи е използвана статистическата програма GraphPad Prism. Двустранният несдвоен t-тест беше използван за анализиране на данните и получаване на p стойностите (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Освен когато е отбелязано друго, данните са показани като средно ± SD.

5. Изводи

В нашето изследване бяха експресирани три рекомбинантни протеина, BVDV-E2, BVDV-E2Ft и BVDV-E2Fc, и бяха генерирани съответните субединични ваксини. Тестовете in vivo показват, че E2Fc субединичната ваксина е по-ефективна от E2Ft и E2, както при мукозна, така и при интрамускулна имунизация. Ние потвърдихме, че титрите на неутрализиращи антитела, индуцирани от мукозно-имунизираните E2Fc и E2Ft, са съответно 1:64 и 1:16, което допълнително показва, че E2Fc се свързва с Fc RI върху говежди алвеоларни макрофаги, за да се постигне трансмукозен транспорт. Мукозната ваксинация на многовалентната E2Fc субединица ваксина на основния епидемичен щам на BVDV значително подобрява имунните ефекти и е подходяща за практическа употреба. Нашето проучване предлага решение на отнемащата време и трудоемка конвенционална ваксинация чрез използване на мукозна ваксина. BVDV E2 протеинът е идеална мишена за неутрализиращи антитела и E2Fc и E2Ft слетите протеини, конструирани в това проучване, се очаква да бъдат допълнително приложени като безопасни и ефективни субединични ваксини срещу BVDV инфекция.

Препратки

1. Truyers, IG; Мелор, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Програма за ликвидиране на вируса на вирусна диария по говедата в Оркни 2001 до 2008 г. Ветеринар. Rec. 2010, 167, 566–570. [CrossRef]

2. Петерханс, Е.; Schweizer, M. BVDV: Пестивирус, предизвикващ толерантност към вродения имунен отговор. Biologicals 2013, 41, 39–51. [CrossRef]

3. Zhong, F.; Li, N.; Хуанг, X.; Guo, Y.; Чен, Х.; Уанг, X.; Shi, C.; Zhang, X. Генетично типизиране и епидемиологично наблюдение на вируса на вирусна диария по говеда в Западен Китай. Вирусни гени 2011, 42, 204–207. [CrossRef]

4. Денг, Й.; Шан, TL; Тонг, В.; Джън, XC; Гуо, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Уен, XT; Tong, GZ Геномна характеристика на говежди изолат на вируса на вирусна диария 1 от свине. арх. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Денг, Й.; Слънце, CQ; Cao, SJ; Лин, Т.; Юан, SS; Джан, HB; Zhai, SL; Хуанг, Л.; Шан, TL; Zheng, H.; et al. Високо разпространение на вируса на вирусна диария по говедата 1 в китайските стада свине. ветеринарен лекар Microbiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Уанг, Л.; Wu, X.; Wang, C.; Песен, C.; Бао, Дж.; Du, J. Произход и предаване на говежди вирус на диария тип 1 в Китай, разкрит чрез филодинамичен анализ. Рез. ветеринарен лекар Sci. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Тауц, Н.; Tews, BA; Майерс, Г. Молекулярната биология на пестивирусите. адв. Virus Res. 2015, 93, 47–160.

8. Бехер, П.; Tautz, N. РНК рекомбинация в пестивируси: Клетъчните РНК последователности във вирусните геноми подчертават ролята на факторите на гостоприемника за устойчивост на вируса и смъртоносни заболявания. RNA Biol. 2011, 8, 216–224. [CrossRef]

9. Ли, Й.; Wang, J.; Канай, Р.; Modis, Y. Кристална структура на гликопротеин Е2 от говежди вирус на диария. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 2013, 110, 6805–6810. [CrossRef]

10. Уилямс, LBA; Фрай, LM; Herndon, DR; Франчески, В.; Schneider, DA; Донофрио, Г.; Knowles, DP. Векторна ваксина с рекомбинантен говежди херпесвирус-4, доставена чрез интраназална небулизация, предизвиква титри на неутрализиращи вируса антитела при говеда. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [CrossRef]

11. Анай, А.; van Riet, E.; Ито, Р.; Икеда, К.; Сенчи, К.; Сузуки, Т.; Тамура, SI; Asanuma, H.; Одагири, Т.; Таширо, М.; et al. Човешки имунен отговор, предизвикан от интраназална инактивирана H5 ваксина срещу грип. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Канг, Х.; Ян, М.; Ю, К.; Yang, Q. Характеристики на свързаната с носа лимфоидна тъкан (NALT) и назална абсорбционна способност при пиле. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Йе, Л.; Zeng, R.; Бай, Й.; Roopenian, DC; Zhu, X. Ефективна мукозна ваксинация, медиирана от неонаталния Fc рецептор. Нац. Биотехнология. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Мукозна ваксинация по интраназален път. Свързана с носа лимфоидна тъкан (NALT) - структура, функция и разлики във видовете. Vaccine 2015, 33, 4406–4413. [CrossRef]

15. Джан, Й.; Джоу, З.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Нова RSV F-Fc слята протеинова ваксина намалява увреждането на белите дробове, предизвикано от инфекция с респираторен синцитиален вирус. Антивирусна. Рез. 2019, 165, 11–22. [CrossRef]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Изотип-специфични резултати при насочване на Fc гама рецептор на PspA, използвайки слети протеини като стратегия за ваксиниране срещу инфекция със Streptococcus pneumoniae. Vaccine 2020, 38, 5634–5646. [CrossRef]

17. Чайковски, DM; Hu, J.; Шао, З.; Pleass, RJ Fc-слети протеини: Нови разработки и бъдещи перспективи. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [CrossRef]

18. Чен, X.; Zeng, F.; Хуанг, Т.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Оптимизация на Fc за подобряване на стабилността и устойчивостта на агрегиране. Curr. Pharm. Биотехнология. 2016, 17, 1353–1359. [CrossRef]

19. Лурейро, С.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Колако, Калифорния; Бейли, CR; Шелтън, Х.; Молести, Е.; Темпертън, Ню Джърси; Баркли, WS; Jones, IM Имунизация без адювант с хемаглутинин-Fc слети протеини като подход към противогрипни ваксини. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [CrossRef]

20. Ли, Дж.; Ли, X.; Ма, Х.; Рен, X.; Хао, Г.; Джан, Х.; Джао, З.; Фанг, К.; Ли, X.; Rong, Z.; et al. Ефективна мукозна ваксинация на нов вирус на класическа чума по свинете E2-Fc слят протеин, медииран от неонатален Fc рецептор. Vaccine 2020, 38, 4574–4583. [CrossRef]

21. Жен, З.; Танг, В.; Тод, Т.; Xie, J. Ferritins като наноплатформи за изображения и доставка на лекарства. Експертно мнение. Лекарство Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Лопес-Сагасета, Дж.; Малито, Е.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Самосглобяващи се протеинови наночастици в дизайна на ваксини. Изчисл. Структура. Биотехнология. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Джейкъб, SI; Khogeer, B.; Бампос, Н.; Sheppard, T.; Шварц, Р.; Lowe, CR Разработване и приложение на синтетични афинитетни лиганди за пречистване на базирани на феритин грипни антигени. Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ма, X.; Zou, F.; Ю, Ф.; Ли, Р.; Юан, Й.; Джан, Й.; Джан, X.; Deng, J.; Чен, Т.; Песен, З.; et al. Ваксини с наночастици, базирани на рецепторно свързващ домейн (RBD) и хептадно повторение (HR) на SARS-CoV-2, предизвикват стабилни защитни имунни отговори. Имунитет 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Бенедиктус, Л.; Bell, CR Рисковете от използването на алогенни клетъчни линии за производство на ваксина: Примерът за неонатална панцитопения при говедата. Expert Rev. Ваксини 2017, 16, 65–71. [CrossRef]

26. Пекора, А.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Одеон, А.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Филипи, JL; Дус Сантос, MJ; et al. Безопасност и ефикасност на E2 гликопротеинова субединица ваксина, произведена в клетки на бозайник, за предотвратяване на експериментална инфекция с вирус на говежда вирусна диария при говеда. ветеринарен лекар Рез. Общ. 2012, 36, 157–164. [CrossRef]

27. Thomas, C.; Йънг, Ню Джърси; Heaney, J.; Колинс, ME; Brownlie, J. Оценка на ефикасността на кандидати за E2 субединица ваксина при бозайници и бакуловирус, експресирани към вируса на вирусна диария по говеда. Vaccine 2009, 27, 2387–2393. [CrossRef]

28. Арена, ТА; Harms, PD; Wong, AW Високопроизводителна трансфекция на HEK293 клетки за преходно производство на протеин. Методи Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Венерео-Санчес, А.; Гилбърт, Р.; Simoneau, М.; Caron, A.; Чахал, П.; Чен, В.; Ansorge, S.; Ли, X.; Хенри, О.; Камен, А. Хемаглутинин и невраминидаза, съдържащи вирусоподобни частици, произведени в HEK-293 суспензионна култура: Ефективен кандидат за ваксина срещу грип. Vaccine 2016, 34, 3371–3380. [CrossRef]

30. Ян, Й.; Ли, X.; Уанг, А.; Zhang, G. Молекулярно клониране и идентифициране на сДНК с пълна дължина, кодираща Fc рецептор с висок афинитет за говежди IgG (Fc гама RI). ветеринарен лекар Immunol. Имунопатология. 2000, 75, 151–159. [CrossRef]

31. Джао, З.; Чен, X.; Чен, Й.; Li, H.; Фанг, К.; Чен, Х.; Ли, X.; Qian, P. Самосглобяваща се феритинова наноплатформа за проектиране на класическа ваксина срещу чума по свинете: Извличане на мощно неутрализиращо антитяло. Ваксини 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Чай, KM; Ю, LL; Wu, CC; Чен, MY; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; et al. Интраназалната ваксинация само с рекомбинантен антиген-FLIPr слят протеин предизвиква дълготрайни системни отговори на антитела и широки Т-клетъчни отговори. Преден. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Белидо, Д.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Акоста, М.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Нова MHC-II насочена BVDV субединица ваксина предизвиква неутрализиращ имунологичен отговор при морски свинчета и говеда. Трансграничен. Emerg. дис. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ма, Х.; Ли, X.; Li, J.; Джао, З.; Джан, Х.; Хао, Г.; Чен, Х.; Qian, P. Имунизация с рекомбинантно сливане на вирус на репродуктивен и респираторен синдром на свинете, модифициран GP5 и феритин, предизвиква повишен защитен имунитет при прасета. Вирусология 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Сейд, Калифорния; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Тай, В.; et al. Създаване на стабилна CHO клетъчна линия за експресия на MERS-коронавирус ваксинен антиген. Vaccine 2018, 36, 1853–1862. [CrossRef]

36. Белини, М.; Рива, Б.; Тинели, В.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Коломбо, М.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; et al. Проектирани феритинови наночастици за биолуминесцентно проследяване на доставката на нанолекарства при рак. Малък 2020, 16, e2001450. [CrossRef]

37. Джан, Х.; Ли, X.; Peng, G.; Tang, C.; Жу, С.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Гликопротеин Е2 на вируса на класическата чума по свинете, експресиран от бакуловирус, индуцира защитните имунни отговори при зайци. Vaccine 2014, 32, 6607–6613. [CrossRef]

38. Юан, Л.; Уен, К.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Джан, В.; Saif, LJ Вирус-специфични чревни IFN-гама продуциращи Т клетъчни отговори, индуцирани от човешка ротавирусна инфекция и ваксини, са свързани със защита срещу ротавирусна диария при гнотобиотични прасета. Vaccine 2008, 26, 3322–3331. [CrossRef]

39. Wang, YP; Лиу, Д.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Хуанг, LP; Liu, CM Подобрен защитен имунен отговор към PCV2 субединица ваксина чрез съвместно приложение на рекомбинантен свински IFN-gamma при мишки. Vaccine 2013, 31, 833–838. [CrossRef]