Изследване на дневните вариации и половите разлики в неврофизиологията на хипокампа и пространствената памет, част 2

Пач-кламп записи на цели клетки

Всички данни бяха събрани от коронални хипокампални срезове по време на ZT 2–6 (ден) или ZT 13–17 (нощ) при 32 градуса в стандартен ACSF, съдържащ следното (в mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 Na2PO4, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 и 25 глюкоза, барботирани с 95% O2/5% CO2.

Короналният хипокампус е важен регион на мозъка, който играе ключова роля в процеса на човешката памет.

Изследванията показват, че коронарният хипокампус е критичен за съхраняване и извличане на дългосрочни спомени. Това е, което хората наричат ​​„пътешественик във времето“, което може да върне хората към минали преживявания и преживявания. Короналният хипокампус играе важна роля в нашата идентичност, емоционален контрол, себеразбиране и междуличностни отношения.

Паметта ни се влошава с времето, но има няколко неща, които можем да направим, за да подобрим паметта си. На първо място, важно е да поддържате положителна нагласа, тъй като това може да намали стреса и да подобри паметта. Второ, повече упражнения и диета могат да помогнат за насърчаване на функцията на коронарния хипокампус и да бъдат полезни за физическото здраве. И накрая, тренирането на паметта и използването на инструменти като бележници също могат да помогнат за подобряване на паметта.

Като цяло, короналният хипокампус играе незаменима роля в човешката памет и когнитивните функции. Затова трябва да обърнем внимание на неговата роля и да го поддържаме в здравословно състояние колкото е възможно повече. Като предприемаме проактивни стъпки, можем да подобрим паметта си и да забавим влошаването й, така че да можем да продължим да мислим ясно и да живеем смислен живот. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, месото може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Записи на цял клетъчен пластир-кламп на CA1 пирамидални неврони бяха получени с помощта на техниката на сляпо пластиране. Накратко, пачпипети бяха поставени или в медиалния, или в латералния край на зона CA1 (в зависимост от това дали срезът е от лявото или дясното полукълбо) на дълбочина от; 50–150 mM, приложено беше положително налягане, докато пипетата бавно се придвижваше медиално или латерално през пирамидалният клетъчен слой, докато бързото увеличаване на съпротивлението на пипетата посочи контакт с неврон, в който момент се освобождава положително налягане, получава се плътно уплътнение (.1 GX) и се прилага леко отрицателно налягане, за да се постигне конфигурация на пластир от цяла клетка.

Данните бяха получени с помощта на усилвател Multiclamp700B, дигитайзер Axon Digidata 1440A и 1550B и софтуер pClamp10/11 (Molecular Devices). Пипети за пластир (BF150-086; Sutter Instruments) бяха изтеглени на Sutter P-97 хоризонтален издърпвач (Sutter Instruments ) до съпротивление между 2,5 и 5 MV. Клетките бяха диализирани за 5 минути преди експерименталните записи. Клетките, използвани за анализа, имаха устойчивост на достъп 30 MV, която не се увеличи с .20% за продължителността на всеки 5-минутен експеримент.

За експерименти с напрежение, всички клетки бяха държани при 70 mV, а сигналите бяха филтрирани при 5 kHz и дигитализирани при 10 kHz. Експериментите на IPSCs използваха разтвор с пипета с пластир, съдържащ (в mM): 140 CsCl, 10 EGTA, 5 MgCl2, 2 NaATP, 0,3 Na-GTP, 10 HEPES, 0,2% биоцитин (pH 7,3, 290 mm) и 5 ​​QX-314 (антагонист на натриевия канал), добавен по време на употреба. IPSC бяха фармакологично изолирани с перфузия на баня от 10 mM NBQX (антагонист на AMPAR, HelloBio) и 5 ​​mM CPP (антагонист на NDMAR, Hello Bio).

Експериментите на EPSC използваха разтвор с пипета, съдържащ (inmM): 100 CsOH, 100 глюконова киселина (50%), 0,6 EGTA, 5MgCl2, 2 Na- ATP*3H2O, 0,3 Na-GTP, 40 HEPES, 7 фосфокреатин, биоцитин (0,2%) и 5 ​​QX-314, добавени по време на употреба. EPSC бяха фармакологично изолирани с перфузия на баня с 10 mM габазин (GABAAR антагонист, Hello Bio). Отделни експерименти за измерване на миниатюрни IPSC и миниатюрни EPSC (mIPSCs/mEPSCs) бяха записани, както по-горе, с добавяне на 0,5 mM тетродотоксин (TTX; напрежение-зависим натриев канал инхибитор, Tocris).

За експерименти с токови клеми сигналите бяха филтрирани при 10 kHz и дигитализирани при 20 kHz. Разтворът на пластирната пипета съдържа (в mM): 135 K-глюконат, 2 MgCl2, 0.1 EGTA,10 HEPES, 4 KCl, 2 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 10 фосфокреатин и биоцитин (0,2%; pH 7,3, 310 mOsm и 2–4 MV). Невронната възбудимост се оценява чрез инжектиране на прогресивни стъпки на деполяризиращ ток от покой (0–500 pA, D 20 pA) и преброяване на броя на потенциалите за действие, активирани по време на всеки 1000 ms текуща стъпка.

Наклонът на отговора беше получен чрез изчисляване на линейната връзка между честотата на запалване и инжектирания ток през {{0}} до 400-pAsteps. Честотата на задействане на максималния потенциал на действие (AP) (max) и токът, при който възниква max (Imax), също бяха измерени. Провисването се измерва като амплитудата (mV) на пиковото напрежение от инжектиране на хиперполяризиращ ток, което постига стационарен мембранен потенциал от 90–93 mV. Входното съпротивление (MX) се измерва като наклона на токовия отговор към поредица от хиперполяризиращ ток инжекции (150 до 0 pA, D 50 pA).

Rheobase се определя като минималния ток, необходим за предизвикване на единичен AP. Единични AP, предизвикани от реобаза, бяха използвани за анализиране на свойствата на потенциала за действие (Таблици 1, 2). Амплитудата на AP се определя като разликата в напрежението между прага на AP и неговия пик. Прагът се определя като напрежението (mV), при което първата производна на AP (dV/dt) надвишава 20 mV/s. Времето за нарастване на AP беше времето (ms) за AP да достигне 90% от своята пикова амплитуда от 10% от своя пик. Времето на затихване беше времето между 90% и 10% от пиковата амплитуда на AP. Полуширината беше времето (ms) между половината амплитуди на нарастване и затихване на формата на вълната на АР. Следхиперполяризация (AHP) е разликата между изходната линия и най-хиперполяризираната точка, появяваща се в рамките на 3 ms след прага на AP за бързо AHP(fAHP) и 10–50 ms след прага на AP за средно AHP(mAHP).

Пиковото покачване и понижаване на AP се дефинира като максимален наклон (DmV/Dms) за покачване и спад на AP, съответно. Базовият мембранен потенциал се изчислява като средното напрежение за 1400-ms размах по време на 0-pA стъпка. Първоначалните експерименти бяха направени в отсъствието на синаптични блокери, за да се определи как полът и времето от деня допринасят за възбудимостта на CA1 пирамидалния неврон в интактната верига. За да започне да се оценява влиянието на синаптичното предаване върху повишената нощна възбудимост, беше проведен отделен последващ експеримент в присъствието на GABAA антагониста, габазин (10 mM) и глутаматергичните антагонисти, NBQX (10 mM) и CPP (5 mM) .

Имунохистохимия

За да се потвърди, че клетките, записани за измерване на постсинаптични токове, са CA1 пирамидални клетки, всички клетки бяха пълни с биоцитин за най-малко 2 0 минути. Срезове, съдържащи запълнени клетки, се фиксират в 4% параформалдехид за най-малко 24 часа, след това се промиват за 3 10 минути в PBS и се инкубират за 2-3 часа при стайна температура в разтвор на TBS, съдържащ 10% NDS, 3% BSA, 1% глицин, 0,4 % Тритон X-100 и стрептавидин-488(1:1000).

След това срезовете се промиват за 3 10 минути в PBS и се монтират върху предметни стъкла и покривни стъкла с монтажна среда ProLongGold Antifade, съдържаща DAPI. Слайдовете се визуализират на флуоресцентен микроскоп BZ-X700 (Keyence). Всички клетки, които не могат да бъдат класифицирани като CA1 пирамидални клетки въз основа на местоположение и морфология, бяха изключени от анализа.

Анализ и статистика
Данните бяха анализирани и визуализирани с помощта на SPSS (версия 27/28) и софтуера Prism-GraphPad. Бяха оценени допусканията на параметричните тестове, включително нормалността и хомогенността на дисперсията, и ако бяха нарушени, данните бяха трансформирани или бяха използвани непараметрични тестове. Освен ако не е посочено друго, значимостта е приписана на p, 0.05. Резюме на всички статистически тестове е предоставено в ExtendedData Table 1-1.

Памет за местоположението на обекта

OLM данните бяха анализирани с помощта на независима двупосочна ANOVA с време на деня и пол като независими променливи и индекс на дискриминация като зависима променлива (фиг. 1D). Корелацията на Pearson беше използвана за оценка на връзката между общото време на изследване и резултатите от индекса на дискриминация и беше използван анализ на непредвидените обстоятелства, за да се определи разпределението на високо спрямо ниско време на изследване по пол и време на деня (Разширени данни Фиг. 1-1B) .

Теренни записи

Входно-изходните данни бяха анализирани с помощта на линеен смесен модел с fEPSP наклон като функция от времето на деня, пола и интензитета на стимулацията. За експериментите с LTP наклоните на fEPSP бяха нормализирани към отговорите на базовата линия и отговорите, получени през последните 10 минути от 40-минута след периода на запис на HFS, бяха анализирани с помощта на трипосочна ANOVA с повтарящи се измервания (RM-ANOVA).

Електрофизиология на цяла клетка с пач-кламп

Постсинаптичните токове (инхибиторни и възбудителни) бяха автоматично открити от 5-минутен запис с помощта на търсенето на шаблон за събития на pClamp и след това ръчно проверени за откриване на фалшиви събития. Амплитудите и интервалът между събития (IEI) бяха анализирани с помощта на обобщено уравнение за оценка (GEE), което позволи оценки на параметрите с осреднени за популацията модели, като същевременно се вземат предвид корелациите между повтарящи се измервания в субектите (Reed and Kaas, 2010; Cook et al., 2016).

GEE моделът определя неструктурирана работеща корелационна матрична структура, субектен ефект на клетката и ефект в рамките на субекта на постсинаптичните събития. Необработените данни имаха значително положително изкривяване с екстремни стойности и по този начин бяха отрязани от горни и долни отклонения (10%), последвани или от логаритмична трансформация в случай на амплитудни данни, или от логаритмична трансформация 1 1 в случай на IEI данни , за да отговарят на допусканията за нормални разпределения преди анализ.

Всички данни за токови клеми бяха анализирани с EasyElectrophysiology (Easy Electrophysiology, RRID: SCR_021190), софтуерен пакет, който използва Neo (Garcia et al., 2014). Потенциалите за действие бяха преброени с помощта на модула за преброяване на потенциала за действие с алгоритъма по подразбиране AutoThreshold Spike. RM-ANOVA беше използван за анализиране на потенциалите за действие през текущите стъпки, в които данните не нарушават предположенията за линейност и нормалност: 160–400 pA. Всички други свойства на мембраната (Таблици 1, 2) бяха анализирани с помощта на двупосочен ANOVA с независими променливи на времето на деня и пола. Всички данни от токови клеми бяха стратифицирани по позиция по предно-задната ос преди окончателния статистически анализ.

Резултати

Разликите ден-нощ в производителността на OLM зависят от пола

За да изследваме ефекта на секса върху циркадните ритми на ученето и паметта, ние използвахме теста за памет за местоположението на обекта (OLM), който разчита на склонността на мишката да изследва обекти на нови места, за да оцени хипокампалната пространствена памет (Barker and Warburton, 2011; Takahashiet al ., 2013; Chao et al., 2016). Въпреки че са докладвани циркадни и дневни разлики в производителността на OLM (Takahashi et al., 2013; Snider et al., 2016), ефектът на пола върху дневните вариации в производителността на OLM остава слабо разбран.

Установихме, че производителността на OLM варира в зависимост от времето на деня; моделът на дневната разлика в представянето обаче се различава между половете (p=0.023, двупосочно ANOVA взаимодействие).

Докато мъжките се представят по-добре през нощта в сравнение с деня, както се очаква (p {{0}}.028, прости основни ефекти, сравняващи деня и нощта при мъжките; Фиг. 1D), женските мишки се представят по-добре през деня в сравнение с нощта (p=0.004, прости основни ефекти, сравняващи деня срещу нощта при жени; фиг. 1D). Нямаше ефект от времето на деня или пола върху общото време на изследване (p=0.926 и 0.936, основни ефекти на двупосочна ANOVA; Фиг. с разширени данни 1-1A). Няма връзка между общото изследване и DIscores (r(52)=0.053, ns p=0.704, корелация на Pearson; Разширени данни Фиг. 1-1B).

Големината на LTP през нощта е по-голяма от тази през деня, независимо от пола
Дългосрочното потенциране (LTP) се счита за клетъчен корелат на ученето и паметта. LTP в CA3-CA1 синапсите е по-висок през нощта в сравнение с деня при мъжки мишки (Chaudhury et al., 2005; Besing et al., 2017; Davis et al., 2020), но доколкото ни е известно, няма публикувани доклади за ефектите от времето на деня върху величината на LTP при възрастни женски мишки. Като се има предвид нашата констатация, че дневните разлики в производителността при анализ на паметта, зависим от хипокампа, зависят от пола, ние след това се опитахме да определим дали полът влияе върху дневните разлики в LTP.

Първо, за да оценим силата на базалното синаптично предаване при CA{{0}}CA1 синапси, ние генерирахме входно/изходни криви чрез измерване на наклона на fEPSP от CA1 stratum radiatum в отговор на съпътстваща стимулация на Schaffer през серия от нарастващи интензитети на стимулация ( 0.2–200 mA, D 10 mA) през деня и нощта при мъжки и женски мишки (фиг. 2A, B). Въпреки че нито полът, нито времето от деня са имали значителен ефект върху базалното синаптично предаване в тествания обхват на стимулите (p=0.552 и 0,981, съответно, основен ефект на LMM), има значително взаимодействие на интензитета на стимулация от пола ( p, 0.001, LMM; Фигура 2A, B).

Мъжките имат по-големи fEPSP наклони в сравнение с женските само при 180,190 и 200mA, независимо от времето на деня (p =0.041, 0.043 и 0.035, съответно; прости основни ефекти, сравняващи мъже и жени при всички интензитети на стимул; Фиг. 2A). Като цяло, тези резултати показват, че времето на деня не влияе на базалното синаптично предаване и че сексът влияе на отговорите само при най-високите интензитети на стимулация.

След това оценихме синаптичната пластичност в CA3-CA1 синапса чрез измерване на LTP в отговор на кратко, високочестотно стимулиране (HFS; Фиг. 2C, D). Както беше съобщено по-рано, величината на LTP е по-голяма през нощта в сравнение с деня както при мъжки, така и при женски мишки (p =0.003, трипосочна RM-ANOVA; Фиг. 2C, D); въпреки това няма значителен ефект или взаимодействие със секса. Заедно тези открития предполагат, че времето на деня влияе върху синаптичната пластичност при мъжки и женски мишки, без да влияе върху базалната синаптична сила.

Синаптичното инхибиране на CA1 пирамидални клетки през деня е по-голямо, отколкото през нощта, независимо от пола

Промените в LTP могат да бъдат приписани на синаптични механизми и/или присъщи промени в възбудимостта. Следователно, първо се опитахме да определим дали времето на деня и пола влияят върху инхибиторното и възбуждащо синаптично предаване върху CA1 пирамидални неврони. За да изследваме синаптичното инхибиране върху CA1 пирамидални клетки, ние измерихме амплитудата и честотата на спонтанните IPSCs (sIPSCs), използвайки щипка за напрежение на цялата клетка при мъжки и женски мишки през деня и нощта (фиг. 3A). Ние открихме, че sIPSC интервалът между събития (IEI) през деня е по-кратък, отколкото през нощта, независимо от пола (час от деня: p=0.033, GEE; Фиг. 3A, C), което показва по-голяма честота инхибиращи събития през деня.

Амплитудата на sIPSCs през деня беше по-голяма, отколкото през нощта както при мъже, така и при жени (час от деня: p=0.008, GEE; Фиг. 3A, E). Тази повишена дневна честота и амплитуда на sIPSCs предполагат по-силно инхибиране на CA1 пирамидални неврони през деня в сравнение с нощта.

По-силно синаптично инхибиране през деня може да възникне от увеличаване на пресинаптичното освобождаване на GABA или от повишена постсинаптична функция на GABAAR. За да разграничим тези възможности, ние измерихме миниатюрни IPSCS (mIPSCs) в присъствието на блокера на волтаж-зависимите натриеви канали тетродотоксин (TTX) както в мъжки, така и в женски мишки през деня и нощта (фиг. 4A). Въпреки че открихме, че нито полът (p=0.392, GEE), нито времето на деня (p=0.760, GEE) са имали статистически значим ефект върху mIPSC IEI, събитията от мъже са имали тенденция към проявяване на разлика ден-нощ (p= 0.068, взаимодействие между пол и време на деня, GEE; Фиг. 3C).

Липсата на разлики ден-нощ при жените показва, че ефектите от времето на деня върху sIPSCs вероятно се задвижват от локално задействане на интерневронен потенциал за действие. При мъжете средните стойности между деня и нощта се различават с;12 ms (средно и SEM: мъжки ден, 98.24 61.05 ms; мъжка нощ, 85.78 6 1.04 ms), което предполага това действие независимо от потенциала инхибиторно освобождаване на везикули може да бъде по-често през нощта (фиг. 3C). Когато изследвахме амплитудата на mIPSC, неочаквано открихме значително взаимодействие между времето на деня и пола (p=0.038,GEE), като амплитудите при жените са по-големи, отколкото при мъжете само през деня (p {{16} }.006, Wald x2 сравнения по двойки; Фигура 4E); обаче тази;2-pA разлика вероятно не е биологично релевантна (женски ден: 34.68 6 1.01 pA; мъжки ден: 32.67 6 1.02 pA, средно 6 SEM) .

Взети заедно, тези спонтанни и миниатюрни IPSC данни предполагат, че инхибирането, зависимо от потенциала на действие, но не и спонтанното сливане на везикули, върху CA1 пирамидални клетки е по-голямо през деня в сравнение с нощта както при мъжете, така и при жените.

Синаптичното възбуждане върху CA1 пирамидални клетки зависи от пола

След това искахме да определим дали спонтанният възбудителен синаптичен вход върху CA1 пирамидални неврони е повлиян от пола и времето на деня. Първо, ние измервахме спонтанни EPSCs (sEPSCs), използвайки записи на напрежението на цялата клетка (фиг. 5A). Въпреки че няма значим основен ефект от времето на деня върху амплитудата на sEPSC (фиг. 5E), независимо от пола (p=0.371, GEE), статистическа тенденция за значителен основен ефект от времето на- ден показва, че sEPSC IEI, записани през деня, може да са по-големи от записаните през нощта (p=0.052,GEE), което предполага по-голяма честота на възбудителни събития през нощта (фиг. 5C). Като цяло открихме, че жените имат повече възбуждащ синаптичен вход, с по-големи sEPSC амплитуди и по-къси IEI в сравнение с мъжете (p=0.022 и 0.020, съответно, основен ефект от пола, GEE; Фиг. 5C, E).

След това повторихме тези експерименти в присъствието на блокера на волтаж-зависимите натриеви канали тетродотоксин (TTX) и измерихме миниатюрни спонтанни възбудителни синаптични токове (mEPSCs) върху CA1 пирамидални неврони (фиг. 6A). Амплитудата на mEPSCs не варира в зависимост от пола или времето- на деня (p= 0.227 и p= 0.150, основен ефект от пола и съответно времето на деня, GEE; Фиг. 6E); въпреки това вариациите ден-нощ в mEPSC IEIs зависят от пола (p= 0.021, взаимодействие между времето на деня и пола, GEE; Фиг. 6C). При мъжките mEPSC IEI са по-къси през нощта, отколкото през деня (p= 0.002, сравнения по двойки на Wald x2), което показва по-голяма честота на възбудителни събития през нощта при мъжки мишки и следователно вероятно увеличение на вероятността за пресинаптично освобождаване; въпреки това, няма значителна разлика ден-нощ при женските (p= 0.765, Wald x2 сравнения по двойки; Фиг. 6C).

Взети заедно, тези резултати предполагат, че тенденцията към повишена нощна честота на sEPSC (особено при жени) зависи от потенциала за действие. Въпреки това, при мъжете, блокирането на потенциалите за действие разкрива нощно увеличение на честотата, което не се наблюдава при тези EPSC.

CA1 пирамидалните неврони са по-възбудими през нощта

В общи линии нашите наблюдения предполагат, че синаптичното инхибиране е по-голямо през нощта и синаптичното възбуждане е по-голямо през деня; по този начин, след това искахме да определим дали тази противоположна дневна вариация в синаптичния възбудителен и инхибиторен вход води до дневна вариация в CA1 пирамидалната невронна възбудимост. За тази цел ние закърпихме CA1 пирамидални клетки в режим на текущо притискане с непокътната верига (т.е. в отсъствието на синаптични антагонисти) и без потенциал на притискаща клетъчна мембрана. Ние инжектирахме нарастващи количества деполяризиращ ток (0–500 pA, D 20 pA, 1000-ms продължителност) в пирамидални неврони и измерихме броя на предизвиканите потенциали за действие.

Данните бяха събрани от неврони по цялата предно-задна ос на хипокампуса. По-рано публикувани проучвания откриват електрофизиологично разнообразие в CA1 пирамидални неврони, които зависят от позицията по осите (Spruston, 2008; Marcelin et al., 2012; Dougherty et al., 2012, 2013; Hönigsperger et al., 2015; Kim and Johnston, 2015; Malik et al., 2016; Milior et al., 2016); по този начин, ние избрахме да отчетем този фактор, като класифицираме всички неврони като "предни" или "задни" въз основа на анатомията на коронарния участък (референтен атлас на Алън от https://atlas.brain-map.org/; фиг. 7A).

Когато включихме предно-задната ос като фактор в нашия първоначален ANOVA модел, оценяващ няколко потенциала за действие на текуща стъпка, открихме, че най-големият допринасящ фактор е регионът (p= 0.005, основен ефект, четирипосочна RM-ANOVA). Освен това бяха открити значителни регионални разлики за входно съпротивление (A: 64.27 6 1.95 MX, P:75.90 6 2.47 MX, p, 0.001, трипосочна ANOVA), реобаза (A : 146.69 6 7.50 pA, P: 112.32 6 6.10 pA, p, 0,001, трипосочна ANOVA) и Imax или ток, при който невроните се задействат при максимална честота (A: 417.{ {23}}.29 pA. P: 386.90 610.82 pA, p= 0.047, трипосочна ANOVA).

Тези разлики между предните и задните неврони съответстват на предишни публикувани проучвания, които откриват разнообразие между дорзалните и вентралните СА1 пирамидални неврони. Докато нашият препарат за коронален срез не ни позволи наистина да изолираме вентрален СА1, задните секции е по-вероятно да включват някои вентрални СА1 пирамидални неврони. Наистина, ние установиха, че задните неврони имат свойства, съответстващи на публикувани по-рано данни във вентралните CA1 пирамидални неврони, докато предните неврони са подобни на дорзалните пирамидални неврони (Dougherty et al., 2012; Malik et al., 2016).

For more information:1950477648nn@gmail.com