Graham-2023-Learning предизвиква уникален препис

Резюме:
Ученето може да предизвика неврофизиологична пластичност в слуховата кора в множество времеви мащаби. Трайните промени в слуховата кортикална функция, които продължават в продължение на дни, седмици или дори цял живот, изискват индуцирана от обучението генна експресия. Наистина, de novo транскрипцията е молекулярната детерминанта за това дали преходните преживявания се трансформират в дългосрочни спомени с трайно въздействие върху поведението.

С непрекъснатото развитие на науката и технологиите в хода на човешкия живот са се появили много магически житейски феномени, сред които най-ценната за изследване е паметта. Паметта е важна част от човешката напреднала невронна дейност и също така е запис и натрупване на различни събития, които са се случили след човешката еволюция. И така, има ли връзка между генната експресия и паметта? Отговорът е да.

Първо, влиянието на гените върху паметта е очевидно. Той може да регулира експресията на различни свързани с паметта молекули и протеини чрез единични нуклеотидни полиморфизми (SNP) и други методи. Това може да повлияе на ефективността на комуникацията между невроните, като по този начин повлияе на когнитивните, концептуалните, емоционалните и други характеристики на човека, което показва качеството на паметта.

Второ, паметта също може да има известно влияние върху генната експресия. В процеса на нашето учене, памет и мислене, това са не само промените в невронната активност на мозъка, но и регулирането и намесата на много гени и молекули. Регулирането на тези гени и молекули ще записва следи, съответстващи на чувствата и преживяванията, които съществуват в нашата дългосрочна памет, и в крайна сметка ще бъдат съхранени в гените.

И накрая, има взаимозависимост между положителното отношение и способността за дългосрочна памет. Щастливото настроение може да ни помогне да се съсредоточим повече и да се концентрираме по време на процеса на учене и мислене, като по този начин спомага за подобряване на паметта. Дългосрочната преднамерена памет може също да насърчи образуването на нови невронни връзки и структури в мозъка, което също е много полезно за бъдещо учене и памет.

Следователно можем да заключим, че има връзка между генната експресия и паметта. Можем да насърчим и подобрим способността си за памет чрез умишлена памет, оптимизъм и позитивно мислене, което също може да ни помогне да постигнем по-добро физическо и психическо здраве. Само по този начин можем да служим по-добре на обществото и човешкото развитие. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал, който има много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различните активни съставки, които съдържа, включително киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

Въпреки това, слуховите кортикални гени, които поддържат слуховото обучение, паметта и придобитото специфично за звука поведение, са до голяма степен неизвестни. Този доклад е първият, който идентифицира промени в целия геном в индуцираната от обучението генна експресия в рамките на слуховата кора, за която се смята, че е в основата на формирането на слуховата памет. Биоинформационни анализи на профили на обогатяване на гени от секвениране на РНК идентифицират биологични пътища, които включват холинергични синапси и невроактивни рецепторни взаимодействия.

Констатациите характеризират ключовите кандидат-ефектори, лежащи в основата на промените в кортикалната функция, които поддържат формирането на дългосрочна слухова памет в мозъка на възрастните. Идентифицираните молекули и механизми са потенциални терапевтични цели за улесняване на дългосрочни и специфични за звука промени в слуховата функция в зряла възраст и сега са основни за бъдещи генно-насочени изследвания.

Ръкопис:

Добре приета концепция в областта на ученето и паметта е, че спомените се съхраняват там, където се обработват (Nadel & Hardt, 2011). Биологичните събития, известни като консолидация на паметта, могат да стабилизират преходни невронни представи, предизвикани от сетивно преживяване (Lechner, Squire, & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Фундаментални и еволюционно запазени механизми, които инициират консолидиране на паметта, са транскрипцията и транслацията, дефинирани съответно като активна експресия на гени и техните последващи протеинови продукти (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Ние предположихме, че ученето на звукова дискриминация предизвиква de novo генна експресия в слуховата кора. Силно специфичните представяния на звукови знаци могат да надживеят преходността на преживяването (секунди и минути) чрез консолидиране в дългосрочна памет (часове до дни), която по-късно ръководи поведението на звукови сигнали. Въпреки че се смята, че отличителните регионални транскриптомични профили са отговорни за консолидирането на паметта (Katzman, et al., 2021), индуцираните от обучението транскрипционни събития, които поддържат формирането на памет в централната слухова система, са силно недостатъчно описани.

За разлика от това, слуховият кортекс е изключително добре описан в проучвания на слуховото учене и паметта на ниво неврофизиологични промени, особено в рецептивните полета и тонотопичните карти (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), кортико- кортикална и кортико-фугална свързаност (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), включително в множество времеви скали (Froemke & Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David и Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Нещо повече, неврофизиологичните промени са свързани с поведението, например за насочено действие (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), внимание (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) и памет за звукови сигнали (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Десетилетия доказателства за индуцирана от ученето неврофизиологична пластичност в слуховата кора показаха споделени поведенчески характеристики на слуховата памет (Weinberger 2007a; 2007b), което я прави топ кандидат област за консолидиране на слуховата памет. Чрез изследване на слуховата кора биоинформатично, ние също използваме безпристрастна възможност за разкриване на общи или различни биологични вратари на невропластичността в целия мозък, които са в основата на адаптивната слухова функция. От по-широка гледна точка регионалното транскриптомно профилиране може да доведе до по-пълно разбиране за това как сетивната система се модифицира от опита в услуга на паметта.

Транскриптомните профили, предизвикани от обучението, идентифицирани в слуховата кора, могат да валидират, разширят или доведат до нови биологични модели на процеси, които поддържат или увреждат адаптивната слухова обработка. Консолидирането на слуховата памет вероятно е продукт на зависещи от опита промени в генната експресия, които засягат клетъчните функции в слуховата кора, което от своя страна насърчава трайни промени в предизвиканата от звук неврофизиологична реакция, която променя поведението, предизвикано от звука.

За да се идентифицират транскрипти, предизвикани от обучението, беше извършен анализ на профилиране на експресията с помощта на RNAsequencing (RNAseq) върху проби от анатомично дефиниран слухов кортекс (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) от възрастни плъхове с ограничен достъп до вода, обучени да натискат щанги, до чисти тонове за водни награди. Отговорите на целевата чиста тонална честота (5,0 kHz; 65 dB SPL) доведоха до награда, докато отговорите на нецелевата (11,5 kHz; 65 dB SPL) не бяха възнаградени и инициираха период на изчакване, който удължи времето до следващия опит.

Тази задача за разграничаване на два тона (2TD) не е трудна за възприемане; акустичните честоти са на разстояние над една октава и лесно се различават от гризачи (Talwar & Gerstein, 1998). По-скоро поведенческото предизвикателство беше асоциативно: представянето на 2TD изисква памет за това кой тон е свързан с награда (срещу без награда). Обучени плъхове (N=8) бяха умъртвени след три последователни ежедневни 45-минутни 2TD тренировъчни сесии и сравнени с група плъхове, които не са чували звук (N=4). Това е времева точка в началото на обучението, когато животните все още усвояват задачата 2TD. Ранното придобиване на задачи беше насочено към улавяне на първоначални транскрипционни събития, предизвикани от обучението, които поставиха основата за по-късни увеличения в производителността на 2TD, наблюдавани в поведението през седмиците на обучение.

Например, средното представяне е над шанса, но само 66±7,81% след 3 дни, в сравнение с По-голямо или равно на 90% след продължително обучение (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). За да се възползваме от възможността да идентифицираме експресията на гени, подходящи за успешна звуково-специфична асоциативна памет, ние използвахме HDAC инхибитор, който е насочен към сепигенетична регулация на зависимата от активността генна експресия при учене и формиране на памет (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017; Malvaez, et al., 2012). Важно е, че едно десетилетие на работа показа, че инхибирането на HDAC може да улесни индуцираната от обучението неврофизиологична пластичност в предизвикани от звук слухови кортикални реакции (по отношение на превозното средство) и да засили слуховото дискриминативно поведение (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b), включително нечовеци (Gervain, et al., 2013).

Половината от обучените животни са третирани с HDAC-инхибитор, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; суб. куб. инжекция) , докато другата половина са били идентично обучени, но им е приложен разтвор на носител (N=4; съответстващ обем, суб. куб. инжекция; Фиг. 1а). Няма разлики в представянето на 2TD между групите по време на събирането на мозъка (RGFP966: 61±5,0% спрямо носител: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 ; t-тест на Welch). Мозъците бяха незабавно събрани и бързо замразени в момент, съответстващ на пиковата концентрация на инхибитора в слуховата кора, един час след инжектирането след сесията или на HDAC инхибитора, или на носителя (Bieszczad et al., 2015 г.).

Констатациите тук са първите, които идентифицират транскриптомичен профил на асоциативно обучение в слуховата кора. Обучението в предизвиканите от задачата двутонална дискриминация промени в нивата на транскрипция на стотици гени (в сравнение със звуковите наивни) (фиг. 1b). Алгоритъм за йерархично групиране показа, че гените са уникално регулирани нагоре или надолу, разкривайки сложна мрежа от кортикални генни експресионни събития, предизвикани от слухово обучение (фиг. 2а).

Анализите на обогатяване (iPathwayGuideTM; Impact Analysis method) идентифицираха холинергичния синапс (диференциално експресирани гени (DEG) / всички гени (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) като най-добрия биологичен път (Таблица 1) . Този резултат е в съответствие с изследванията от 1990 г., подчертаващи достатъчността на холинергичното сигнализиране в слуховата кора за неврофизиологична пластичност и свързаното слухово поведение (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Нивата на транскрипция, индуцирани от учене при HDAC-инхибиране, бяха или усилени в същата посока (чрез по-нататъшно повишаване или по-нататъшно намаляване на уникалните нива на генен транскрипт) (Фиг. 2b) или притъпени в сравнение със самото учене (Фиг. 2c). Един от водещите биологични пътища при тези условия е взаимодействието невроактивен лиганд-рецептор (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Таблица 1), което включва ефектори, които са от решаващо значение за невралната активация.

Друг основен път е взаимодействието на рецептора на екстрацелуларния матрикс (ECM-рецептор) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Таблица 1). Компонентите на ЕСМ са от решаващо значение за кортикалната пластичност и консолидацията на паметта (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Тези пътища предлагат потенциални алтернативи, може би допълващи, на холинергичното сигнализиране, което може да улесни трайни промени в слуховата функция, зависещи от опита (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Други гени, чиято експресия се променя със слуховото обучение, но не и с HDAC-инхибирането, вероятно са свързани с процедурните условия на задачата, а не със специфичната за звука асоциативна памет. Например, беше идентифициран сигналният път на апелин (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), който е важен в мозъка за хомеостатичната регулация на приема на вода (Hu, et al., 2021). Директно сравнение на нивата на транскрипт между двете групи обучени плъхове (учещи със или без инхибиране на HDAC) показа много малко уникално диференциално експресирани гени (DEG).

Прагът, значително използван за идентифициране на най-вероятните DEG (p =0.05), установи, че само Adamts13, U6, Rexo4 и Cabin1 са диференциално изразени (Фиг. 2d). По този начин основният ефект от HDAC-инхибирането изглежда модулират експресията на гени, предизвикани от слухово учене при нормални условия, вместо да набират нови уникални гени, за да поддържат специфична за звука памет. Заедно тези констатации показват, че в слуховия кортекс в началото на обучението се случват широкомащабни транскриптомни промени, докато възрастните животни се учат да разграничават асоциативните връзки между звуковите знаци. Заедно с установените неврофизиологични и поведенчески доклади за HDAC инхибиране за насърчаване на слуховата функция, тези открития подкрепят тактиката за използване на HDAC инхибитор за разграничаване на гени, чиято експресия определя успеха на формирането на слухова памет.

Няколко интересни гена (GOI) бяха избрани от обогатяващите анализи в биологичните пътища, за да се валидира секвенирането в целия геном с генно-насочен подход. Пробите бяха събрани от отделни кохорти, които репликираха двете групи от обучени и третирани животни в същия ранен етап времева точка на обучение (т.е. един час след третата 2TD сесия на обучение) за използване в анализ на генна експресия с помощта на количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR). Няма разлики в производителността на 2TD в репликираните кохорти (RGFP9661: 61±5.0% спрямо RGFP9662: 67±6.0%; t(8,441)=-0.834, p {{20}}.4274; и Превозно средство1:71±6.0% спрямо Превозно средство2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; t-тест на Уелч).

Първият GOI беше Egr1, добре проучен, зависим от дейността „незабавен ранен ген“, за който е известно, че достига своя връх в рамките на първите часове на учене и е критичен за формирането на памет (Duclot & Kabbaj, 2017). Това беше индуциран от топ обучение ген с потвърдена повишена експресия, който също беше амплифициран с HDAC-инхибиране в отделна кохорта от животни в генно-насоченото изследване (фиг. 3). Същото важи и за Per2, ген, участващ в регулирането на циркадните ритми и серотонинергичните пътища в мозъка (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 е част от семейството на "часовниковия ген", което е свързано с HDAC модулация в други мозъчни региони (Kwapis, et al., 2018) и може да има роля и в слуховата функция (Reh et al., 2020). За разлика от това, някои GOI, идентифицирани в целия геном, бяха само частично потвърдени.

Chrna7 кодира субединица на динамичния никотинов ацетилхолинов рецептор (nAChR), за който е установено, че се регулира надолу със слухово обучение, в съответствие с неврофизиологичните доказателства (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). По този начин очаквахме генно-насоченото изследване да потвърди низходящата регулация на Chrna7 при всички обучени с 2TD животни, но низходящата регулация беше очевидна само при животни, третирани с превозно средство, които научиха 2TD без HDAC инхибиране. Допълнителни избрани GOI бяха от семейството на ядрени рецептори Nr4a сирак, Nr4a1 и Nr4a2, които са непосредствено ранни гени, за които се съобщава, че са необходими за разпространение на ефектите надолу по веригата на селективната HDAC мишена на RGFP966 в други области на мозъка (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

В съответствие с предишни доклади за зависими от задачите регионални различия в генната експресия на семейството на Nr4a (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, но не и Nr4a2, се регулира нагоре в слуховия кортекс след слухово обучение. Други DEG, Htr1a или Adamts13, не бяха потвърдени от генно-насочено изследване, вероятно поради разлики в известни варианти на транскрипт, които не са открити от нашите специално проектирани генно-насочени сонди, или поради грешка от тип I, или на фини поведенчески разлики между обучени кохорти от животни, които остана незабелязан в измерванията на производителността на 2TD. Ние също така изследвахме Lynx1, ген с дълга история на функция за повторно отваряне на пластичност, подобна на "критичен период", в сензорния кортекс (Morishita et al., 2010), вероятно чрез действието му върху холинергичната и серотонинергичната модулация (Takesian, et al. , 2018). Колкото и да е в съответствие с предишни доклади за целия геном, които не успяха да го открият (Kalish, et al., 2020), той не беше открит нито в нашия набор от данни за RNAseq, нито в генно-насочено изследване.

Въпреки че остава предизвикателство да се определи дали несъответствията могат да бъдат обяснени с реална биологична или индивидуална променливост между животните или поради техническа променливост с ниско изобилие или специфични за клетъчния тип експресиращи транскрипти, ние докладваме изключително последователни резултати за някои GOI. Тъй като индуцираната от обучението експресия на Chrna7, Egr1 и Per2 е последователна между генно-насочените и геномно-широките подходи и между различни кохорти от обучени животни, логично е, че тези гени може да са от най-фундаменталните играчи за трайни промени в слухова функция и памет и сега са основни за бъдещи изследвания.

Разгледани заедно, констатациите разкриват динамичен транскрипционен пейзаж в слуховата кора на възрастните, който би могъл да поддържа възникваща слухова функция в неврофизиологията и поведението. Предвид нарастващите доказателства за епигенетичен контрол върху функцията на сензорната система (вж. Shang & Bieszczad, 2022), е вълнуващо да се разгледа как епигенетичните механизми играят роля в балансирането на стабилността със зависимата от опита пластичност на слуховите кортикални вериги. Например, настоящият набор от данни за целия геном също идентифицира индуцирано от обучението намаляване на експресията на арепресивна хистон деацетилаза, Hdac9, която отсъства при инхибиране на HDAC.

Изкушаващо е да се сравни ефектът от намалената експресия на HDAC9 с ефекта на фармакологичното инхибиране на HDACs за насърчаване на индуцирана от обучението транскрипция. Друг важен клас епигенетични регулатори променя ДНК, а не хистони. Примери са Tet1 и Gadd45b, които и двете влияят върху метилирането на ДНК (Bayraktar & Kreutz, 2018) и за които е установено, че се регулират надолу и нагоре с обучението, съответно, при инхибиране на HDAC. Освен това, клас микроРНК се появи като най-добрият биологичен път, индуциран от учене с HDAC-инхибиране (виж Таблица 1), които са придобили сцепление в полето като ключови епигенетични регулатори на невронния транскрипционен контрол (Saab & Mansuy, 2014). Молекулни взаимодействия от по-висок ред между епигенетичните играчи и протеиновите продукти на експресираните гени също са вероятни. Например, идентифицираният повишено регулиран Egr1 може да набира Tet1 за премахване на репресивни белези на метилиране, за да активира гени надолу по веригата (Sun, et al., 2019). Ще са необходими допълнителни молекулярни изследвания, за да се анализира значението на взаимодействията между епигенетичните регулатори в слуховата система по време на обучението. Освен това, този доклад представя незабавна възможност за установяване на връзки между избрани слухови кортикални гени и техните ефектори надолу по веригата.

Преодоляването на пропастта между тези гени и молекули към тяхното влияние върху неврофизиологичните събития, предизвикани от звук, е от съществено значение за разбирането как слуховата система на възрастни се адаптира с опита, за да промени поведението. Наистина, преводът на de novo транскрипция е необходим за дългосрочни промени в поведенческата функция, тъй като те произвеждат трайни промени в клетъчната функция. Например, ключовите целеви ефектори на индуцираните от обучението транскрипционни процеси могат да променят наличността на канали или рецептори (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) в рамките на вериги, които определят звуковите предизвикан праг, отзивчивост и архитектура на рецептивното поле в слуховата система. Разумно е да се предположи, че различните слухови задачи биха набрали уникални генни мрежи за биологични пътища, свързани с конкретните клетъчни функции, които биха подпомогнали обучението за релевантната за задачата звукова характеристика или структура на задачата.

Като цяло, този отчет служи като отправна точка за предоставяне на набори от данни за RNAseq от кортекса за обучение, възрастни и слухов кортекс (вижте хранилището на данни). Усилие за стесняване на празнината в знанията, изострена от сериозната липса на проучвания, които се фокусират върху молекулярно-генетичните процеси в слуховата кора на възрастните, вече е добре дошла. Ние насърчаваме изучаването отвъд пространствено-времевите ограничения на масовото РНК секвениране, чиято чувствителност е ограничена технически и от дълбочината на четене (Li & Wang, 2021), особено след като съвременните технологии Omics бързо се развиват и подобряват.

Докато изследванията в слуховата кора направиха някои първоначални крачки в молекулярната генетика, които идентифицираха основни молекулярни каскади (Schicknick, et al., 2008), разрешителните IEG профили (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018 ; Peter, et al., 2011) и дори хроматинодинамиката (Peter, et al., 2021), има прецедент в слуховата периферия, където динамиката на транскрипцията е прекрасно проучена (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al. др., 2020 г.; Ebeid и др., 2017 г.). Съществуващите молекулярни инструменти като секвениране на едноклетъчна РНК (RNA-Seq) и флуоресцентна in situ хибридизация на малки молекули (smFISH) ще бъдат полезни за предоставяне на представа за зависими от опита вариации от клетка към клетка и молекулярни взаимодействия в рамките на слуховите кортикални клетки и вериги. За разлика от груповата RNAseq, тези методи зачитат дълбокото клетъчно разнообразие и организацията от по-висок порядък в слуховата кора, като нейните специфични за слоя микросхеми и топография на лемниска.
Интелигентните подходи за маркиране и транскрипти на последователности от само наскоро активни слухови кортикални клетки (Cho, Huang, & Gray, 2016) могат да повишат чувствителността достатъчно, за да получат надеждно най-функционално значимите набори от гени от най-функционално значимите типове клетки и популации. Подобни подходи могат да се използват и субкортикално за улавяне и контрастиране на зависими от активността регионални транскриптомични профили в кората, които зачитат невероятната интеграция на кортикалната с субкортикалната функция на слуховата система при различни условия на слушане или поведенчески изисквания. Пълното характеризиране на клетъчни и регионални различия в генетичните и молекулярни механизми, лежащи в основата на слуховото обучение в мозъка на възрастните, е от първостепенно значение за разработването на селективни на място и насочени към молекули прецизни терапии, които позволяват стабилни и постоянни функционални промени за поддържане на специфичен слух и способности за слушане през целия живот.

Методи

Субекти: Общо 24 възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley (250 – 300 g при пристигането; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) бяха използвани в поведенчески и молекулярни експерименти. Всички животни бяха индивидуално настанени в стая с колония с контролирана температура (24 ˚C) на 12--часов цикъл светлина/тъмнина. Субектите са имали ad libitum достъп до храна и вода преди поведенческото обучение. Всички процедури бяха одобрени и проведени в съответствие с указанията на Комитета за грижа и използване на животните (IACUC) в Rutgers, Държавния университет на Ню Джърси (протокол №:999900026 (KMB)).

Поведенчески апарат и звукови стимули: Всички поведенчески сесии бяха проведени в две идентични инструментални камери за кондициониране (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) в кутия с атенюиран звук. Ежедневните тренировъчни сесии бяха балансирани, за да се осигури еднакво излагане на двете камери. Всяка камера (12" Ш x 10" Д x 12" В; подът от телена мрежа беше снабден с лост за реагиране (H21-03R), домашно осветление (H11-01R), високоговорител (H{ {8}}R) и система за подаване на вода (H14-05R). По време на фазите на обучение, животните можеха да натиснат лоста за реакция ("barpress"), което задейства представянето на чаша с вода (~0,02cc) в порта за награда (1,25"Ш x 1,625"В). Ръчен превключвател (H21-01) беше използван по време на ранната сесия, за да се оформи реакцията на натискане на лентата на животното, за да се задействат презентации на чашата с вода, която позволява достъп до Поведенческите отговори бяха записани с помощта на софтуер Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) за офлайн анализ.

Всички слухови стимули бяха генерирани с помощта на софтуера Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) и RPvdsEx и представени чрез монтирания на стената високоговорител на оперантната камера. Бял шум (по време на процедурно обучение; Фиг. 1a) се представя за 7 или 9 s по продължителност (75 dB SPL). Чистите тонове (по време на обучение за двутонална дискриминация; Фиг. 1a) винаги се представят за 8 s (70 dB SPL). Нивата на звука се калибрират ежедневно с помощта на цифров звукомер (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Поведенческо обучение и фармакологично инхибиране на HDAC3: След един ден на аклиматизиране към вивариума, плъховете се третират ежедневно в продължение на минимум 3 дни. Преди началото на поведенческото обучение, плъховете бяха поставени на график с ограничена вода, докато достигнат 85% от неограниченото тегло на контролните животни, съответстващи на възрастта. След това плъховете с ограничен достъп до вода бяха оформени вътре в камери със затихване на звука, за да се натискат за водни награди (фиг. 1а). Оформянето на лентов натиск и последващото звуково обучение бяха както е описано по-горе (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Накратко, всички животни бяха оформени така, че да щриховат натиск в продължение на 5 дни и след това бяха обучени в процедурна задача, за да се научат да натискат ленти за звук, което в тази фаза беше широколентов Гаусов шумов стимул (1-12.5 kHz лентово филтриран бял шум; 75 dB SPL), за да се получи водна награда. Всички животни успешно се научиха да свързват този звук с награда, преди да продължат към следващата фаза на обучение. Процедурното обучение показва индивидуална променливост на това колко бързо животните могат да научат задачата до високи нива на производителност. Независимо от това, всички животни успяха да постигнат ниво на производителност, по-голямо или равно на 90% за два последователни дни (средно=92.85%, sem =0.01%) след средно 12,67 дни ( sd=2.85 дни). Ефективността е изчислена като се използват 100%.

Следващата фаза на обучение беше задачата за двутонална дискриминация (2TD) (фиг. 1а), в която плъховете бяха обучени да различават две спектрално различни звукови честоти. Натискането на лента към тона S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) би довело до представяне на водна награда, докато натискането на лента към камъка (11,5 kHz; 70 dB SPL) доведе до сигнал за грешка (мигаща къща светлина) и "тайм-аут" (допълнителни 6 секунди изчакване за началото на следващия опит). S+ и S-S-изпитванията бяха рандомизирани и продължиха 8 s. Интервалите между опитите (ITIs) бяха средно 15 s (диапазон: 5-25 s, рандомизирани). Барпресите по време на безшумен ITI бяха несъществени (без прекъсване, без сигнал за грешка, нито водна награда). Ежедневните сесии бяха с продължителност 45 минути. Всички животни изпълниха задачата 2TD за общо три последователни дни. Плъховете бяха сдвоени от обучен наблюдател, така че на животни с подобни нива на усвояване на процедурната задача бяха определени различни условия на лечение във фазата 2TD. Двойките, съответстващи на ефективността, получават системни инжекции или от фармакологичния клас I HDAC3 инхибитор RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg; sc; N=12) или разтвор на носител (N=9) веднага след всяко 2TD сесия. Изпълнението на задачата 2TD беше изчислено, както е описано по-горе: 100% (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 20).

). Събиране на тъкани и изолиране на РНК: Един час след като животните са получили своята трета и последна инжекция от RGFP966 след третата сесия на 2TD, мозъците са бързо дисектирани и бързо замразени в чаша с 2-метилбутан, поставена върху сух лед. След това бързо замразени мозъци се съхраняват при -80˚ C до бъдеща обработка. За да се подготвят мозъците за криоразрязване, мозъците бяха обвити в смес за оптимална температура на рязане (OCT) и съхранявани при -20˚ C за 12-24 часа, за да се гарантира, че мозъчната тъкан ще достигне -20˚ C за рязане. След това мозъците, обвити в OCT, ще бъдат нарязани хоризонтално в криостат (Leica CM 3050S) с дебелина 250 µm. С помощта на 1 mm микроперфоратор с кръгла тъкан бяха взети проби от 2 mm3 слухова кортикална тъкан от всяко полукълбо (комбинирани в една проба за общо 4 mm3 на мозъчна област) за екстракция на РНК. Локацията на слуховата кора беше идентифицирана с помощта на Paxinos и Watson The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6-то издание) като референция (приблизително A/P=-3.6 до -5.8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4.2 до -5.8 mm; и използване на хипокампуса като ориентир

Общата РНК от всяка проба се изолира с помощта на PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher), като се използва протоколът на производителя. След това пробите от РНК бяха пречистени с комплекта RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), библиотеките за секвениране бяха генерирани с помощта на Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit съгласно препоръчаните от производителя протоколи. Библиотеките бяха обединени и секвенирането беше извършено на Illumina NovaSeq 6000, работещ със 100 bp двойка SBSchemistry. Четенията бяха обработени с тръбопровода за информатика с отворен код „bcbio-nextgen.py“, разработен основно в Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4), работещ на Argon HPCresource в Университета на Айова. Тази линия включва подходи за „най-добри практики“ за контрол на качеството на четене, подравняване на четене и количествено определяне. Тръбопроводът „bcbio-nextgen.py“ беше изпълнен в режим „RNA-seq“ с ключа „rn6“ като избрана компилация на генома (вътрешно рефериране на сглобката на Ensembl и компилацията на ген „Rnor_6.0“). Подравненият тръбопровод чете към Rnor_6.0генома с помощта на ултра-бързия hisat2 подравняващ инструмент (2.2.1) с разпознаване на снаждането и едновременно с това количествено четене към транскриптома с помощта на подравняващия инструмент „сьомга“ (1.4.0). Qualimap (2.2.2), изчислителен инструмент, който изследва файловете за подравняване hisat2 BAM, беше използван за изследване на прочетените данни за контрол на качеството. Резултатите за качество на последователностите преминаха основните проверки и нивата на дублиране на последователностите бяха в приемливи параметри. Всички проби преминаха QC за подравняване на четене към екзонични региони. Количествените показатели на транскриптите, получени от сьомга (TPM или „транскрипти на милион“) бяха импортирани и обобщени до изчислен брой на генно ниво с помощта на tximport (1.12.3) в Rstudio, както е описано в най-добрия практикува DESeq2 винетка(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Гени с по-малко от 5 изчислени бройки във всички проби бяха предварително филтрирани от анализ надолу по веригата, съгласно препоръчителната процедура. Анализът на диференциалната генна експресия беше проведен с DESeq2 (v.1.24.0) при приблизително преброяване на генно ниво. FDR от 5% и X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Валидиране на данни за RNA-seq с qRT-PCR: Данните за RNA-seq бяха валидирани чрез qRT-PCR върху mRNA, извлечена от отделни кохорти плъхове. Пет транскрипта бяха избрани от списък с нови DEGs, открити обогатени във всеки регион в началото. Три от гените бяха основани на хипотези, базирани на слухова кортикална физиологична и поведенческа литература, докато други три гена бяха нови гени, идентифицирани от генно ниво и DEG анализи в сравнение между групи лекарства и носители. Всички праймерни последователности бяха избрани или от предишна литература за мозъчна тъкан при плъхове (последователностите са предоставени в таблицата по-долу) или проектирани с помощта на NCBI Primer Blast и валидирана специфичност за целта чрез оценка на кривите на топене и секвенирането на продукта на PCR ампликон. qRT-PCR анализите бяха извършени в QuantStudio 3 (Applied Biosystems) със SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). За всяка проба, 500 ng cDNA бяха амплифицирани с помощта на iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).

Благодарности

Авторите биха искали да благодарят на д-р Andrea Shang, Sean Tsaur и Sooraz Bylipudi за тяхната помощ в поведенческите процедури и анализи; Д-р Мими Л. Фан за нейната помощ при екстракцията на РНК и протоколите за събиране на проби; д-р Troy A. Roepke, Ali Yasrebi и ChristopherO'Brien за тяхната помощ при анализ на пречистване на РНК проби; и Алиса Рей за техническа помощ. Бихме искали да благодарим на всички настоящи и бивши служители на CLEF Lab за тяхната помощ и подкрепа.

Тази работа беше подкрепена от Националния институт по здравеопазване, Националния институт по глухота и комуникационни нарушения [R01-DC014753 към KMB]; Училището по изкуства и науки към университета Рутгерс; фондация Aresty в университета Rutgers с малки безвъзмездни средства за бакалавърски изследвания; и програмата Project SUPER в университета Rutgers с малки субсидии за бакалавърски изследвания.

Препратки:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). Регулирането на транскрипцията при консолидиране на паметта. ColdSpring Harbor Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 и mper2 са от съществено значение за нормалното нулиране на циркадния часовник. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Ашауер, Д. и Румпел, С. (2016). Сензорният неокортекс и асоциативната памет. Behavioral Neuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Диференциални функции на mPer1, mPer2 и mPer3 в циркадния часовник на SCN. Неврон, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Индуциране на физиологична памет в мозъчната кора чрез стимулиране на nucleus basalis. Сборник на Националната академия на науките на Съединените американски щати, 93 (20), 11219-11224. направи:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Периневроналните мрежи в сензорния кортекс на възрастни са необходими за учене на страх. Неврон, 95 (1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Барта, CL, Лиу, Х., Чен, Л., Гифен, К. П., Ли, Й., Крамер, К. Л., . . . Той, ДЗ (2018). RNA-seq транскриптомичен анализ на космени клетки от вътрешното ухо на възрастни рибки зебра. Научни данни, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Ролята на зависимото от активността ДНК деметилиране в мозъка на възрастни и неврологичните разстройства. Граници в молекулярната невронаука, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Инхибирането на хистон деацетилазата чрез RGFP966 освобождава спирачките върху сензорната кортикална пластичност и специфичността на формирането на паметта. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015 г.

Браун, MR и Kaczmarek, LK (2011). Модулация на калиеви канали и слухова обработка. Изследване на слуха, 279(1-2), 32-42. направи:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Бичков, М. Л., Василиева, Н. А., Шулепко, М. А., Балабан, П. М., Кирпичников, М. П., & Люкманова, Е. Н. (2018). Lynx1 предотвратява дългосрочната блокада на потенцирането и намаляването на невромодулаторната експресия, причинена от A 1-42 и JNK активиране. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com