Модел на експресия на -тубулин, инверсин и неговата цел разрошени-1 и морфология на първичните реснички при нормално развитие и заболявания на човешки бъбрек

edmund.chen@wecistanche.com

Резюме:Пространствено-времевата експресия на -тубулин, инверсията и разрошените-1 (DVL-1) протеини, свързани с Wnt-сигналния път, и първичната морфология на ресничките бяха анализирани при разработванетобъбреци(14-38-ма седмица на развитие), здрав постнатален (1.5- и 7-години) и патологично променен човекбъбреци,включително мултикистозна дисплазиябъбреци(MCDK), фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS) и нефротичен синдром от финландски тип (CNF). Анализът е извършен чрез двойна имунофлуоресценция, електронна микроскопия, полуколичествени и статистически методи. Цитоплазмената ко-експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1 се наблюдава в проксималните извити тубули (pct), дисталните извити тубули (dct) и гломерулите (g) на анализираните тъкани. По време набъбрекразвитието, общата експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1намаля, докато в постнаталния период леко се увеличи. Най-високите експресии на -тубулин и инверсията характеризират dct и g, докато високото DVL-1 характеризира pct. -тубулин, инверсия и модели на експресия на DVL-1 в MCDK, FSGS и CNFбъбрецизначително се различава от здравия контрол. В сравнение със здравитебъбреци, патологично промененбъбрециимаше дисморфични първични реснички. Различна динамика на експресията на -тубулин, инверсия и DVL-1 по време набъбрекразвитието може да показва, че превключването между канонично и неканонично Wnt-сигнализиране е от съществено значение за нормалнотобъбрекморфогенеза. За разлика от тях нарушеното им изразяване при патологичнибъбрециможе да бъде свързано с анормални първични реснички, водещи до хроничнобъбречни заболявания.

Ключови думи:развитие на човешкия бъбрек; -тубулин; инверсин; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; бъбрек, бъбрек

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

Въведение 

Развитието на дефинитивния или метанефриченбъбрецизапочва по време на петата гестационна седмица (GW), която след това непрекъснато се диференцира, за да образува постоянните бъбреци [1,2]. Сигналните взаимодействия между метанефричния мезенхим и уретерната пъпка осигуряват правилнотобъбрекразвитие по време на нефрогенезата. Накратко, уретерната пъпка индуцира преход от мезенхим към епител (MET) в метанефричния мезенхим, който кондензира и образувабъбречнавезикули, последвани от тела с форма на запетая и S-образна форма и накрая водещи до образуване на гломерули [3]. В замяна на това мезенхимът предизвиква по-нататъшно разклоняване на уретерната пъпка. Метанефричните бъбреци стават функционални екскреторни единици на 11-та седмица от човешкото развитие. Въпреки това, нефрогенезата е завършена в рамките на 34-та до 36-та седмица от развитието на плода, когато множеството разклонения са завършени, но по-нататъшният процес на диференциация на бъбреците продължава в постнаталния период [4,5]. Нарушенията на тези сложни взаимодействия водят до различни вродени аномалии на бъбреците и пикочните пътища (CAKUT), включително дисплазия, поликистозна бъбречна болест, мултикистозна дисплазиязаболяване на бъбреците(MCDK), което води до хроничнозаболяване на бъбреците(CKD) [6].

В това проучване бяхме фокусирани върху външния вид на първичните реснички и Wnt-сигналния път, който играе важна роля по време на нормалната нефрогенеза и вбъбреквъзстановителен процес след остър или хроничензаболяване на бъбреците[7]. Наличието на първични реснички по време на нефрогенезата и големият брой на развитиетобъбрекдефекти, възникващи при пациенти с цилиарно заболяване, показват, че истинската първична функция на ресничките е необходима за нормалнотобъбрекорганогенеза [8,9]. Първичният цилиум е микротубулен органел, важен за тъканната хомеостаза, където -тубулинът е основният компонент [10]. Загубата на ацетилиране на -тубулин в обезсмъртени клетки задейства прехода от епител към мезенхим (EMT), което означава, че ацетилираният -тубулин е важен за стабилизирането на микротубулите [11]. По време на човешкото развитие първичният медииран от ресничките Wnt път позволява клетъчна пролиферация, диференциация и тъканна морфогенеза [12]. Значителен брой деца с увредена първична функция на ресничките и нарушен Wnt-сигнален път развиват ХБН, където вроденибъбречнаразстройствата са отговорни за почти половината от случаите [13]. Най-честата вродена кистозна болест при децата е мултикистозната дисплазиязаболяване на бъбреците(MCDK) [14]. Множество кисти, които не комуникират [15] и липсват нормалнибъбречнапаренхим са характерни микроскопски находки за MCDK. Фокалната сегментна гломерулосклероза (FSGS) е едно от най-честите гломерулни заболявания, които водят до краен стадий.заболяване на бъбреците[16]. В началото FSGS е характерен като фокален, включващ само малка част от гломерулите и сегментен, включващ промени само в сегмент от гломерулния кръг [17]. Вроденият нефротичен синдром от финландски тип (CNF) е необичайно автозомно рецесивно унаследено заболяване.заболяване на бъбрецитепредставено от пренатално избухване на екстензивна загуба на протеин [18], свързано с цистогенеза на проксималните тубули [19]. Много форми на първични гломерулни заболявания развиват протеинурия в резултат на увредената гломерулна филтрационна бариера [20]. Значителен брой проучвания предполагат, че увреждането и дисфункцията на подоцитите имат присъща роля в патогенезата на ХБН протеинурия [21]. Проучването на Vukojevic et al. показва увеличен брой ресничести и слабо диференцирани подоцити в CNF [22]. Предишни проучвания показват, че сигналният път на Wnt/-катенин има основна роля в модерирането на дисфункцията на подоцитите с протеинурия [23]. Има два основни Wnt-сигнални пътя, единият известен като каноничен -катенин-зависим и друг неканоничен, -катенин-независим. По време на мишкатабъбрекразвитие, каноничното Wnt-сигнализиране е активно върху върховете на пъпките на уретера и в S-образни тела [24]. Освен това, Wnt чрез канонично сигнализиране има значение за поддържането на MET по време на нефрогенезата [25]. А именно, свързването на протеиновия комплекс, съдържащ Dvl към мембранния рецептор, е задължително за активиране на пътя на Wnt, докато дезактивирането на ключовите компоненти на този път води до ранна перинатална смъртност поради отсъствието на нефрогенна зона вбъбрек[25]. 

Установено е, че протеинът, който е от решаващо значение като молекулно превключване между канонични и неканонични Wnt сигнални пътища, е инверсия [26]. Въпреки че са открити взаимодействия на различни протеини с инверсия, точната му функция все още не е напълно изяснена. Вбъбречнаепителни клетки, инверсията е разположена в първичните реснички, действайки като цилиарен протеин [27]. В допълнение, инверсията образува стабилен комплекс с тубулин в култури отбъбречнаклетки и те се колокализират in vivo [27,28]. Инверсията изглежда играе съществена роля в ранната морфогенеза на пронефричната система и определянето на ляво-дясната симетрия по време на развитието [29,30]. Значително събитие както за каноничните, така и за неканоничните Wnt-сигнални пътища при набирането на цитоплазмения Dvl към клетъчната мембрана. Тъй като предишни констатации показват, че инверсията и Dvl се локализират в бъбречните епителни клетки, може да се предположи, че инверсията може също да има роля в неканоничното сигнализиране. Нарушаването на регулацията на Wnt-сигнализиране, медиирано от инверсия, задейства аберантна пролиферация в тубулите [31]. Генетичните тестове разкриха DVL-1 мутация при пациенти с автозомно-доминантен синдром на Робиноу, представяйки хетерогенни нарушения при някои пациенти, свързани с урогенитални ибъбречнааномалии [32].

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА

Моделът на експресия в развитието на -тубулин, инверсия и DVL-1 е изследван при различни животински модели. По този начин тяхната експресия в пронефрос на Xenopus laevis е потвърдена чрез използване на интравитална микроскопия [31], докато те са открити в клетъчни линии, получени от миши проксимални тубулни клетки чрез използване на конфокална микроскопия и масспектрометрия [33]. В допълнение, светлинна микроскопия и двойна имунофлуоресценция разкриват тяхното присъствие в срезове от мишкибъбреци[34]. Изследвания върху мишки с нокаут инверсия съобщават за увеличени, дифузни кисти вбъбречнамедула и кортекс, свързани със ситусна висцерална инверсия [35]. При хората мутацията на инверсията се представя с инфантилна нефронофтиза, която води до прекъсване на бременността [36]. Въпреки множеството проучвания върхубъбречна-тубулин, инверсия и модел на експресия и функция на DVL-1, доколкото ни е известно, моделът на експресия на тези протеини в човешката фетална и постнатална човешка тъкан все още не е изследван и доведе до корелация. В допълнение, няма докладвани доказателства, разглеждащи израза на инверсия и DVL-1 в ранното човешко развитие. Ето защо, това проучване имаше за цел да анализира модела на пространствена и времева експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1 по време на фетални и постнатални стадии на здрави хорабъбреци, както и вбъбректъкани на MCDK, FSGS и CNFбъбрециза да се установи евентуална липсваща връзка между тези субекти. А именно, ние предлагаме, че нарушените модели на експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1 протеини може да са основният процес на цистогенеза и анормална функция на първичните реснички, водещи до хроничнобъбречни заболявания. 

Резултати

Анализ на развитието и следродилния периодбъбректъкани се извършва върху отчетливо диференцирани структури набъбрек:проксимални извити тубули (pct), дистални извити тубули (dct) и гломерули (g). По време на анализираните етапи на развитие и в постнатален периодбъбректъкани, -тубулин, инверсия и DVL-1 показват положителни модели на експресия, но с разлики в интензитета, разпределението и количеството. Анализът на патологичниябъбречна тъканна MCDK, FSGS и CNF беше извършено при пълен брой изображения на положителните клетки в сравнение с контрола на здрава бъбречна тъкан.

2.1. Светлинна микроскопия, електронна микроскопия и имунохистохимия (-тубулин) на здрава и патологично променена постнатална човешка бъбречна тъкан

2.1.1. Здравословна постнатална бъбречна светлина

микроскопия на постнаталнабъбректъкан демонстрира добре дефиниранибъбрекструктури, с ясна разлика между медула и кора и образуването на pct, dct и g в кортикалната област. Имунохистохимичното оцветяване на -тубулин разкрива наличието на една първична реснички в центъра на апикалната клетъчна повърхност на всяка тубулна клетка и в 0.018 процента ± 0,00014 процента SD на повърхността на гломерулните клетки. Електронната микроскопия показва наличието само на една първична реснички, произлизаща от базалното тяло на апикалната клетъчна повърхност на тубула (Фигура 1а).

2.1.2. CNF

Повечето от анализираните g са по-малки и лобулирани (80 процента), докато малцинството са с нормален размер или хипертрофични (20 процента, n=100). Установява се сегментна или глобална склероза на g, докато pct и dct са частично разширени и покрити с атрофичен епител. Ултраструктурно се наблюдава загуба на микровили и намаляване на клетъчната височина с мултифрагментация на ядрата. В подоцитите процесите на краката са дифузно загубени. Тубулните първични реснички са дезорганизирани, особено в кистите на проксималните тубули, показващи промени в дължината и цитоплазмената позиция (Фигура 1b).

2.1.3. MCDK

В бъбречната тъкан могат да бъдат намерени спорадични незрели и зрели g.Бъбректъканта е изпълнена с множество овални кисти. Колоновидните епителни клетки покриват кистите и са заобиколени от рехава съединителна тъкан. Имунохистохимичното оцветяване с -тубулин показва множество дълги и неорганизирани първични реснички на повърхността на епителните клетки (Фигура 1в).

2.1.4. FSGS

В 90 процента от g се открива обширна сегментна склероза (n=100), свързана с интерстициална фиброза и признаци на тубулно увреждане. Намаляването на височината на епителните клетки със загуба на микровили се открива в електронен микроскоп, докато ендотелните клетки и мезангиалните области имат правилна ултраструктура. В електронния микроскоп изключително дългата и дислокирана (децентрализирана) реснички се наблюдава на повърхността на дисталната тубулна клетка (Фигура 1е). Подоцитите показват дифузна загуба на израстъци на стъпалото с обширна микровилусна тъкан. Имунохистохимичното оцветяване с a-тубулин показва множество дълги и неорганизирани първични реснички на повърхността на епителните клетки (Фигура 1с).

2.2. Имунохистохимично оцветяване до 心тубулин, инверсия и DVL-1- и статистически анализ на развиващи се и здрави постнатални човешки бъбреци

През 14-та, 15-та и 16-та гестационна седмица, набъбректъканта е представена с различни етапи на развитие на образуване на нефрон: от метанефрични чаши,бъбречнавезикули, за да командват S-образни нефрони, като по този начин образуват нефрогенната зона във външния кортекс (Фигура 2). Диференциране на pct, dct и g може да се наблюдава в кортикалните области по-близо добъбрекмедула. По време на 22-ия GW части от медулата и кората станаха ясно отличителни, докато в 38-ия GW,бъбрекструктурите изглеждат като силно диференцирани, съдържащи зрели форми на pct, dct и g

2.2.1. а-тубулин

По време на развитието а-тубулинът е силно изразен във всички развиващи себъбрекструктури, предимно визуализиращи формата на първичните реснички върху повърхностите на париеталните епителни клетки на капсулата на Bowman, g, pct и dct. В рамките набъбректъкан, 82-97 процента от pct клетките експресират a-тубулин, докато при dct експресията спада от 99 процента на 72 процента в 38-ия GW (виж Фигура 3, Таблица 1). Сред различните етапи на развитие най-силната експресия на a-тубулин се открива в g на 16-ия GWбъбреци, съдържащ 93 процента положителни клетки. гъвкави 14-ти, 15-ти и 22-ри GW (вижте Фигура 3a,b, Таблица 1), около 70 процента от g клетките експресират a-тубулин, докато най-малко експресия се наблюдава в 38-ия GW (p <0,01) с="" 34="" процента="" от="" положителните="" клетки="" (фигура="" 3в).="" в="">бъбректъкан (15-години и 7-годинибъбреци), най-силната имунореактивност към a-тубулин се наблюдава на апикалната клетъчна повърхност на pct и dct (Фигура 3d-f). Експресията на a-тубулин също присъства в перинуклеарната цитоплазма на dct и париеталните епителни клетки на капсулата на Bowman. а-тубулин оцветява всичкибъбречнаструктури със средно 50 процента положителни клетки в pct, 94 процента в dct и 85 процента в g (Фигура 3f). Dct оцветява значително различно от pct (p <0,0001). всички="" изследвани="" структури="" се="" оцветяват="" положително="" към="" a-тубулин,="" със="" 77="" процента="" положителни="" клетки="" в="" pct,="" 72="" процента="" в="" dct="" и="" 58="" процента="" в="" g="">

Фигура 3. Имунофлуоресцентно оцветяване на -тубулин и DAPI в развиващите се и постнатални човешки бъбречни тъкани (a–e). Бъбреци на 14-ти, 15-ти/16-ти, 38-ми GW (a–c);бъбрецина 1.5- и 7--годишни деца (d,e). Положителното оцветяване на -тубулин (стрелки) е показано във всяка структура в кората през фазите на развитие и постнаталните фази (a–e), проксималните извити тубули (pct), дисталните извити тубули (dct) и гломерулите (g). Подробности за първичните реснички в pct (d) и dct (a–c,e) са показани като вложки с по-голямо увеличение (бяла кутия). Увеличение ×40, скална лента 100 µm. Разпределението на -Tubulin положителни клетки по структура през различни етапи на развитие и в постнаталния период е показано на графика (f). Графика (g) (общ брой протеин-позитивни клетки в наблюдаваните структури) показва протеинова експресия, свързана с времето на развитие (линейна регресия) и взаимовръзката на -тубулин с DVL-1 чрез развитие и съзряване (двупосочна ANOVA, последвана от posthoc тест на SIDAK). Данните са показани като средно ± SD.

Разпределението на -тубулин-положителни клетки по структура през различни етапи на развитие и в постнаталния период е показано на графика (f). Графика (g) (общ брой протеин-положителни клетки в наблюдаваните структури) показва протеинова експресия, свързана с времето на развитие (линейна регресия) и взаимовръзката на -тубулин с DVL-1 чрез развитие и съзряване (двупосочен ANOVA, последван от пост-хок тест на Sidak). Данните са показани като средни стойности ± SD.

2.2.2. Двойно имунофлуоресцентно оцветяване до инверсия и DVL-1 и DAPI ядрено оцветяване при развиващи се и здрави постнатални бъбреци Инверсионна експресия при развиваща се и постнатална бъбречна тъкан

В 14-та, 15-та и 16-та GW, инверсията показва силна гранулирана експресия в g и лека гранулирана експресия в цитоплазмата на pct и dct (Фигура 4a, b), докато в 22-ра и 38-ма GW (вижте Фигура 4c), силно положителна експресия се наблюдава в g (Таблица 1). Между 14-ия и 22-ия GW, около 50 процента от клетките експресират версията. В 16-ия GW pct клетките изразяват инверсия в 73 процента от клетките, докато намаляват до 29 процента от клетките (p <0,05) в="" 38-ия="" gw="" (виж="" фигура="" 4f).="" положителна="" експресия="" на="" инверсия="" се="" открива="" в="" приблизително="" 80-90="" процента="" от="" dct="" и="" g="" клетките="" в="">бъбректъкани на 14-та и 16-та GW, с най-ниска експресия в dct на 38-ма GW (p <0.05, p=""><0,0001, съответно),="" където="" 66="" процента="" от="" клетките="" са="" положителни.="" в="">бъбреци, pct оцветява силно в апикалната клетъчна мембрана, докато dct оцветява най-вече в базалната клетъчна мембрана и в перинуклеарната цитоплазма (Фигура 4d, e). На този етап открихме израз на инверсия при всички изследванибъбречнаструктури, включително pct, dct и g, със средна експресия на положителни клетки от 92 процента за pct, 88 процента за dct и 90 процента за g (Фигура 4f). Не наблюдавахме значителна разлика в силата на сигнала на експресията на инверсия между структурите. Най-високата експресия на инверсия се открива в g, със средно 94 процента положителни клетки (Фигура 4f). Установява се значителна разлика при сравняване на оцветяването на g (където 94 процента от клетките се оцветяват положително) с pct, където 58 процента от клетките се оцветяват положително (p < 0.01)="" и="" с="" dct,="" където="" 49="" процента="" от="" клетките="" са="" положителен="" (p=""><0.0001, фигура="">

Експресия на DVL-1 в развиваща се и постнатална бъбречна тъкан

Лека до силна експресия на DVL{{0}} се наблюдава в цитоплазмата на pct, dct и g във феталния период (вижте Фигура 4a–c, Таблица 1). В pct, 76–86 процента от клетките експресират DVL-1 в 14-ия–22-ия GW, докато в 38-ия GW има 57 процента положителни клетки (Фигура 4g). В dct на 14-ти и 15-ти GW 68–70 процента от клетките експресират DVL-1, в 16-ти и 22-ри GW броят на положителните клетки пада до 42–5{{41} } процента , докато в 38-ия GW израз (p <0,001), се="" наблюдава="" в="" 19="" процента="" от="" dct="" клетките.="" експресията="" на="" dvl-1="" се="" увеличава="" в="" g="" през="" феталните="" етапи:="" в="" 14-та="" gw="" тя="" е="" 6="" процента,="" докато="" в="" 15-та,="" 16-та="" и="" 22-ра="" gw="" тя="" се="" увеличава="" до="" 10="" процента="" (p=""><0,01). в="" 38="" gw="" 14="" процента="" от="" g="" клетките="" експресират="" dvl-1="" (фигура="" 4="" g).="" в="" постнаталния="" период="" имунореактивността="" на="" dvl-1="" е="" разпръсната="" в="" цитоплазмата="" (таблица="" 1)="" както="" на="" pct,="" така="" и="" на="" dct="" (фигура="" 4d,e).="" сигналът="" се="" намира="" във="" всички="" изследвани="" структури,="" но="" най-вече="" в="" перинуклеарната="" цитоплазма.="" интензитетът="" на="" експресията="" на="" dvl-1="" е="" значително="" по-висок="" при="" pct="" в="" сравнение="" с="" dct="" и="" g="" (p=""><0,01). 39–45="" процента="" от="" клетките="" в="" pct="" и="" dct="" експресират="" dvl-1,="" докато="" в="" g="" 21="" процента="" от="" клетките="" са="" положителни="" (фигура="" 4="" g).="" не="" открихме="" значима="" разлика="" между="" процента="" на="" имунореактивните="" клетки="" в="">бъбречнаструктури. Процентът на DVL-1 имунореактивни клетки е съответно 34 процента в pct, 36 процента в dct и 27 процента в g (Фигура 4g).

Фигура 4. Двойно имунофлуоресцентно оцветяване на инверсия (зелено), DVL-1 (червено) и DAPI (синьо) в развиващите се и постнатални бъбречни тъкани (14-38-ми GW, 1.5- и {{6 }}годишни бъбречни тъкани). Положителното оцветяване (стрелки) е показано във всяка структура през всички фази на развитие (a – c) и постнаталния период (d, e). Обединени микрофони заедно със структурите от интерес в кората: проксимални извити тубули (pct), дистални извити тубули (dct) и гломерули (g). Колокализацията на инверсия/DVL-1 (стрелка) е показана в обединени микроснимки. Отрицателните контролни оцветявания са показани като вмъквания върху инверсия и DVL-1 (a). Еритроцитите могат да се видят като силно оцветени клетки близо до dct. Подробностите са показани като вмъквания с по-голямо увеличение. Увеличение ×40, скална лента 100 µm. Динамично положително клетъчно разпределение на инверсия и DVL-1 в бъбречните структури (pct, dct, g) през етапите на развитие и следродилния етап са показани на графики (f,g). Графика (h) показва протеинова експресия (общ брой положителни клетки в структурите), свързана с времето на развитие (линейна регресия) и взаимовръзката на инверсията с DVL-1 чрез развитие и съзряване (двупосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Sidak ). Данните са показани като средни стойности ± SD.

Ко-експресия на инверсия и DVL-1 се наблюдава в цитоплазмата на бъбрека g, dct и pct по време на развитието (вижте Фигура 4a–c, сливане). В постнаталния период ко-експресията на инверсия и DVL-1 характеризира различни клетъчни отделения на тубулни клетки в pct и dct, докато ко-експресията в g се характеризира със силното разпространение на инверсионната експресия (вижте Фигура 4d, сливане ). В 7-годишните постнатални бъбреци се наблюдава съвместна експресия на инверсия и DVL-1 в тубулни клетки на dct и pct и в g, където експресията на инверсия леко преобладава в сравнение с DVL-1 (Фигура 4e, обединяване).

2.2.3. Разлики в експресията на -тубулин, инверсия и DVL-1 между различните стадии на развитие на бъбреците и постнаталните бъбреци

Броят на -тубулин-позитивните клетки в pct от феталната бъбречна тъкан е статистически значимо по-висок в сравнение с бъбречната тъкан на 7--годишните деца (13-то (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15-ти="" (p="">< 0.0001)="" и="" 16-ти="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" на="" ранните="" фетални="" стадии="" (13-ти,="" 15-ти,="" 16-ти="" и="" 22-ри="" gw)="" има="" повече="" положителни="" клетки="" в="" сравнение="" с="" 38-ия="" gw="" и="" 1.{19}}годишна="" бъбречна="" тъкан="" на="" деца="" (p=""><0,0001, съответно,="" фигура="" 3f).="" когато="" бяха="" сравнени="" различни="" етапи="" на="" развитие,="" ние="" открихме="" по-ниски="" нива="" на="" експресия="" на="" инверсия="" в="" pct="" на="" 13-ти="" (p="">< 0,0001),="" 15-ти="" (p="">< 0,00001),="" 22-ри="" (p="">< 0,001)="" и="" 38-ми="" (p="">< 0,0001)="" gw="" в="" сравнение="" с="">бъбречнатъкан от 15-годишно дете. При dct беше открита статистически значима по-ниска експресия на инверсия при сравняване на 16-та GW с 38-ма GW бъбречна тъкан (p < 0.0001).="" освен="" това,="" по-ниска="" експресия="" на="" инверсия="" в="" dct="" се="" наблюдава="" в="" бъбречна="" тъкан="" на="" 7-годишно="" дете;="" сравнявайки="" 13-та,="" 15-та="" (p="">< 0,001,="" и="" двете),="" 16-та="" и="" 1.5--годишна="" бъбречна="" тъкан="" с="" dct="" на="" 7--годишна="" бъбречна="" тъкан="" (p="">< 0,00001,="" съответно,="" фигура="" 4f).="" наблюдаваният="" сигнал="" на="" експресия="" на="" dvl-1="" през="" различните="" етапи="" разкри,="" че="" pct="" от="" 13-ия="" (p=""><0,01), 15-ия,="" 16-ия="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Връзка между експресията на -тубулин и инверсията към DVL-1 в развиваща се и постнатална бъбречна тъкан

- Експресиите на тубулин и инверсия бяха сравнени с експресията на DVL-1 през етапите на развитие и в постнаталната бъбречна тъкан. -тубулин има статистически по-висока експресия във всички наблюдавани етапи, в сравнение с експресията на DVL-1 (p < 0.001,="" фигура="" 3g).="" през="" всички="" наблюдавани="" етапи,="" инверсията="" имаше="" по-висока="" експресия="" в="" сравнение="" с="" dvl-1="" (p=""><0,0001, фигура="" 4="">

2.2.5. Сравнение на имунохистохимично оцветяване с -тубулин, версия и DVL-1- и статистически анализ на патологично променена бъбречна тъкан (MCDK, CNF, FSGS) -тубулин Разликата в оцветяването с -тубулин в MCDK, FSGS и CNF беше статистически значима при сравнение до здрава постнатална бъбречна тъкан като контролна група (p < 0.0001,="" съответно).="" диспластичните="" бъбречни="" тъкани="" имат="" значително="" по-висока="" експресия="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група,="" докато="" fsgs="" и="" cnf="" показват="" значително="" по-ниска="" експресия="" на="" -тубулин="" в="" сравнение="" със="" здравата="" контрола="" (фигура="">

Инверсия

Инверсията се изразява в цитоплазмата на дезорганизирани епителни клетки и тубули на MCDK (Фигура 5а). При CNF експресията на инверсия характеризира g и dct, докато се проявява по-малко интензивно в pct кисти (Фигура 5b). При FSGS инверсията е силно изразена в g и dct, но по-малко интензивно в pct кисти (Фигура 5в). Пространствената експресия на инверсията показва статистически значима по-висока скорост на оцветяване в здрави бъбречни тъкани (Фигура 5g) в сравнение с MCDK, FSGS и CNF (p < 0.0001,="">

Фигура 5. Двойно имунофлуоресцентно оцветяване на инверсия (зелено), DVL-1 (червено) и DAPI (синьо) в патологични бъбречни тъкани в MCDK (a), CNF (b) и FSGS (c): тубули (t) , гломерули (g), pct киста (c), височина на pct епителни клетки (*). Структурата и съвместната локализация на клетките на инверсия и DVL-1 (стрелки) са показани в обединените секции с подробности във вмъквания с по-голямо увеличение. Отрицателните контролни оцветявания са показани като вмъквания върху инверсия и DVL-1 (a). Увеличение ×40, мащабна лента 10{{20}} µm. Връзка на -тубулин (d) и инверсия (e) с експресията на DVL-1 в MCDK, FSGS и CNF (двупосочен ANOVA, последван от post hoc тест на SIDAK). Разликата във височината на епителните клетки (f) на FSGS, CNF и MCDK pct в сравнение със здрава контрола (еднопосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Tukey, n=50). Разликата в общия процент на положителни клетки на -тубулин, инверсия и DVL-1 в MCDK, CNF и FSGS в сравнение със здрава контрола (g–i), еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Tukey). Данните са показани като средни стойности ± SD. Значимите разлики са показани с p-стойност (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" е="" много="" слабо="" експресиран="" само="" в="" дезорганизирани="" тубули="" на="" mcdk,="" докато="" в="" cnf="" неговата="" експресия="" характеризира="" dct="" и="" g="" (фигура="" 5a,b).="" при="" fsgs="" dvl-1="" се="" наблюдава="" като="" лека="" реактивност="" в="" g,="" dct="" и="" pct="" (фигура="" 5в).="" здравите="" бъбречни="" тъкани,="" оцветени="" на="" dvl-1,="" показват="" значително="" по-висок="" процент="" на="" оцветяване="" (фигура="" 5="" h)="" за="" разлика="" от="" mcdk="" и="" fsgs="" (p=""><0,0001, и="" двете),="" докато="" не="" е="" установена="" значима="" разлика="" за="">

2.2.6. Връзка между експресията на -тубулин и инверсията към DVL-1 в патологично променена бъбречна тъкан (MCDK, CNF, FSGS)В MCDK, FSGS и CNF, -тубулинът се оцветява значително по-високо от DVL-1 (p < 0.0001,="" съответно,="" фигура="" 5d).="" инверсията="" се="" оцветява="" значително="" по-високо="" в="" сравнение="" с="" dvl-1="" в="" mdck="" (p=""><0,0001) и="" в="" fsgs="" (p=""><0,01, фигура="">

2.2.7. Разлики във височината на епителните клетки на проксималните извити тубули между здрав контрол и патологично променена бъбречна тъкан (MCDK, CNF, FSGS)Височината на pct епителните клетки (n {{0}} на група) беше сравнена между тубулни клетки в здрави бъбречни тъкани и патологично променени бъбречни тъкани (Фигура 5b,c,f). Средната височина на епителните клетки в HC е 12,91 µm ± 1,847 µm и е значително по-висока в сравнение с CNF и FSGS (p < 0.0001,="" съответно).="" средната="" височина="" на="" клетките="" в="" cnf="" pct="" е="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" докато="" при="" fsgs="" е="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" pct="" епителни="" клетки="" на="" mcdk="" не="" показват="" значителни="" промени="" във="" височината="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" в="" сравнение="" с="">

2.2.8. Разлики в първичната дължина на ресничките между здрав контрол и патологично променена бъбречна тъкан (MCDK, CNF, FSGS)

Първичната дължина на ресничките (n= 50 на група) беше сравнена между HC и патологично променени бъбречни тъкани (Фигура 6в). Здравите бъбречни тъкани и MCDK бяха оцветени с -тубулин, за да се увери в специфичността на оцветяването с -тубулин на ресничките (Фигура 6а, b). В здравите бъбречни тъкани първичната реснички е с дължина 5,065 µm ± 1,229 µm, докато при MCDK, CNF и FSGS са значително по-дълги (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Дискусия

Целта на нашето проучване беше да изследваме имунохистохимична експресия на а-тубулин, инверсия и DVL-1 в плодабъбречнатъкан и постнатална бъбречна тъкан. Освен това искахме да проучим дали експресията и моделът на оцветяване на a-тубулин, инверсия и DVL-1 са нарушени при различни бъбречни заболявания в сравнение със здравия контрол. А именно, въпреки обширния интерес на другите изследователи към ролята на a-тубулина, инверсията и DVL-1 по време на развитието на бъбреците, повечето от предишните проучвания са използвали животни или in vitro експериментални модели. Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което показва експресия и локализация на a-тубулин заедно с инверсия и DVL-1 в човешки бъбреци на плода и след раждането и което изследва експресията на споменатите протеини в бъбреците заболявания като MCDK, FSGS и CNF. Ние също така анализирахме промените в дължината и външния вид на ресничките чрез светлинна и електронна микроскопия, тъй като предишното ни проучване вече показа, че цилиарните смущения могат да бъдат свързани с цистогенезата при FSGF и CNF [19].

В каноничния Wnt-сигнален път, свързването на Wnt лиганди към рецептори набира Dvl [37]. Процесите на MET и пътя на полярността на планарните клетки по време на ранните етапи на бъбречната морфогенеза се контролират от Wnt сигнализирането. Чрез медииране на Wnt пътя, първичните реснички контролират клетъчната пролиферация, диференциация и тъканна морфогенеза [12] чрез организиране на клетъчния цитоскелет и клетъчна ориентация, както и удължаване на тубулната структура [2,38]. В нашето проучване -тубулинът, инверсията и DVL-1 присъстват в бъбречните структури и всички са локализирани не само по време на развитието на бъбрека на плода, но и в бъбречната тъкан от 1.5- и {{9 }} годишни деца. Тези констатации са в съгласие с активирането на Wnt-сигналния път, за който е доказано, че се появява още по време на тубулогенеза [39]. Освен това, нашите резултати разкриха, че експресията на -тубулин и инверсията са реципрочно свързани с DVL-1 и че показват статистически значима разлика между техните модели на експресия. Това е в корелация с експерименталните модели, тъй като мутацията на пълното семейство протеини Dvl при мишки води до липса на процес на гаструлация, докато мутациите, които не включват цялото семейство протеини, показват дефекти в разположението на възловите реснички заедно с дефекти на органите [40] . Предишни открития предполагат, че инверсията има роля в клетъчната миграция в Xenopus pronephros. Тъй като този сегмент корелира с примката на Хенле и дисталните тубули на бозайниците, това може да показва значението на инверсията по време на развитието на бъбреците и при хората [41]. В съгласие с тази предпоставка, предишни проучвания разкриват, че мутацията на гена за инверсия може да доведе до нефронофтиза тип 2, която се медиира от анормална експресия на DVL-1 [42]. Въпреки че ролята на първичната реснички е противоречива в регулирането на Wnt-сигналния път, ние открихме, че -тубулинът е колокализиран с инверсия и DVL-1 в анализираните бъбречни проби. Освен това, предишни проучвания посочиха, че първичната реснички заедно с инверсията регулира разграждането на Dvl чрез повлияване на Wnt-сигналния път [43]. При човешки бъбречни заболявания, свързани с развитието на кисти, са наблюдавани анормална локализация и функция на първичните реснички [19]. По същия начин, настоящото проучване също потвърди морфологични промени в образуването на първични реснички при патологични състояния като CNF, FSGS и MCDK. Предишни констатации потвърждават, че свръхактивирането на каноничния Wnt път след увреждане на бъбреците води до необратими структурни промени на бъбречната тъкан [44]. Напротив, първичната реснички получи ролята на превключване от каноничен към неканоничен Wnt път за подпомагане набъбречнаремонт. Освен това беше установено, че свръхактивирането на каноничния Wnt път в трансплантирана бъбречна тъкан има положителна прогностична стойност спрямо бъбречна фиброза [45]. Ако каноничният път на Wnt преобладава за сметка на неканоничния, това подкрепя теорията за бъбречна фиброза като резултат. Нашите констатации за понижена експресия на -тубулин и инверсия в CNF и FSGS предполагат неактивност на неканоничния Wnt път, особено тъй като и двете състояния са склонни да водят до краен стадийбъбречно заболяване.А именно, смята се, че нормалната локализация и функция на първичната реснички могат да бъдат фактор за поддържане на редовен Wnt път и следователно предпоставка за нормално развитие. Обратно, ако пътят на Wnt се засили, това може да доведе до нерегулирана клетъчна пролиферация и диференциация, водеща до канцерогенеза [46]. Както беше описано по-горе, каноничният път на Wnt е задължителен за инициирането на MET и образуването на нефрона, докато неговото нарушение може да доведе добъбречнахипоплазия [47]. Нашите резултати подкрепят тази идея, като разкриват най-ниската експресия на DVL-1 с най-високата експресия на -тубулин в MCDK в сравнение със здрава контрола. Тези резултати могат да означават най-ниското активиране на каноничния Wnt път, което може да бъде основна причина за липсата на образуване на нефрон. За разлика от това, най-високата експресия на -тубулин с най-ниската експресия на DVL-1 може да обясни откритията на множество кисти, тъй като няма организирано удължаване и клетъчна поляризация, ръководени от неканоничния Wnt път. Предишни проучвания също показват, че инверсията инхибира каноничния Wnt сигнален път чрез насочване към Dvl за разграждане [26]. Установено е, че тази стъпка в тяхното взаимодействие е необходима за инхибиране на каноничното Wnt-сигнализиране при поддържането на нормалното тубулно удължение и позициониране. Инверсионната мутация води до регулиране нагоре на канонично Wnt сигнализиране, което впоследствие провокира анормална пролиферация в тубулни клетки. Доказано е, че тази стъпка е от решаващо значение за цистогенезата [42], докато нокаутът на инверсията при мишки води до поликистоза на бъбреците [48]. Според теорията набъбречнацистогенеза, инверсията се счита за "микопротеин", поради локализацията си в първичните реснички вбъбречнатубулни клетки. В нашето изследване първичните реснички присъстваха на апикалната клетъчна повърхност на тубулните клетки във всички анализирани етапи, докато по време на феталните етапи експресията на -тубулин беше по-силна, отколкото в постнаталния период.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Предишни проучвания показват, че първичната функция на ресничките може да бъде повлияна от дисрегулация на -тубулин по време на развитие, което може да доведе до цистогенеза, анормално развитие на бъбреците и възможно хронично бъбречно заболяване в детска възраст [31,49]. Това е в съответствие с нашите констатации за скъсени и дисморфични първични реснички, наблюдавани в MCDK или с множество и изключително удължени или дислокирани реснички, открити в разширени тубули на CNF и FSGS, в сравнение със здрава контрола. В подкрепа на факта, че каноничните и неканоничните Wnt-сигнални пътища, регулирани от първични реснички, се считат за задължителни за нормалното развитие на бъбреците, открихме значително по-ниско оцветяване на инверсия и DVL-1 в MCDK в сравнение със здрава контрола [31,49]. Различната динамика на модела на експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1 през различни фази на развитие на бъбреците може да показва превключване между каноничния и неканоничния Wnt-сигнален път по време на нормалната бъбречна морфогенеза. Предполагаме, че техният обмен определя транскрипция в каноничен път или ред на клетъчна миграция и поляризация по време на развитието на бъбреците в неканоничен сигнален път. Техният баланс и експресия във всички изследвани бъбречни структури предполага тяхната важна роля в нормалното развитие на бъбреците. По време на нормалното развитие на бъбреците (от 13 GW до 38 GW), общата експресия на -тубулин, инверсия и DVL-1 намалява, тъй като бъбречната тъкан придобива зряла морфология. В 15- и 7-годишните бъбречни тъкани, -тубулинът и инверсията показват леко увеличение на експресията, което подкрепя факта, че неканоничният път на Wnt остава активен след раждането. Напротив, DVL-1 продължава с намален модел на експресия, което може да добави към заключението, че каноничният Wnt път е заглушен в здрава бъбречна тъкан. В резултат на патологични бъбречни състояния епителните клетки на бъбрека могат да реагират с повторната поява на ЕМТ и фиброза [50], свързани с реактивиране на каноничния Wnt път [44]. Следователно нарушенията на -тубулин, инверсия и DVL-1, открити в болни бъбреци, може да са основният патологичен механизъм и резултат от преминаването от неканоничен към каноничен път на Wnt в развиващия се бъбрек, намеквайки за преминаването между обратим към необратим бъбрек щета. Освен това, промените в техния пренатален и постнаталенбъбречнаМоделът на експресия може да бъде свързан с увреждане на бъбречната функция в зряла възраст, водещо до вродени заболявания и хронична бъбречна недостатъчност.

4. Материали и методи

4.1. Човешки проби

Бяха събрани проби от фетална бъбречна тъкан след загуба на бременност на 14-ти, 15-ти, 16-ти, 22-ри и 38-ми GW в отделението по гинекология и акушерство на Университетския болничен център Сплит. Целият придобит фетален материал е изследван от патолог, като за изследването са използвани само тъкани без признаци на аномалии, мацерации или вътрематочна смърт и с нормална кариограма. Медицинските досиета на майките бяха прегледани преди вземането на проби и в случай на здравословни проблеми, които биха могли да повлияят на изхода от бременността, бъбречните тъкани бяха изключени от изследването. Зрелостта се определя от обиколката на главата, обиколката на корема и дължината на бедрената кост [51] в зависимост от менструалния календар на пациентите. Екземпляри от 15- и 7-годишна бъбречна тъкан са събрани след случайни смъртни случаи. Пробите са взети в отделението по патология на Университетския болничен център в Сплит. Пробите от мултикистозни диспластични бъбречни тъкани (MCDK) са получени след загуба на бременност, фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS) и нефротичен синдром от финландски тип (CNF) са получени поради нефректомия. Целият получен материал е прегледан и оценен от патолог, който класифицира диагнозите. Протоколът от изследването беше одобрен от Комитета по етика на Медицинския факултет на Университета в Сплит (20 май 2016 г.) в съответствие с Хелзинкската декларация и нейните актуализации (класификационен номер: 003-08/16-03/0001, регистрационен номер: 2181-198-03-04-16-0024, 20 май 2016 г.) [52].

4.2. Имунохистохимия

Фиксацията на събраната тъканна проба се обработва с 4 процента параформалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) в продължение на 24 часа при 22 ◦C. След дехидратиране в 100 процента етанол, пробите се поставят в парафин, както е описано по-рано [53]. Образците бяха нарязани на срезове с дебелина 5 µm с помощта на микротом и впоследствие монтирани върху предметни стъкла за микроскоп. За да се провери запазването на тъканите, всеки 10-ти срез се оцветява с хематоксилин и еозин [54]. Отделянето на феминизацията и имунохистохимията са извършени, както е описано по-горе [2,55,56]. След изплакване в PBS, микроскопските предметни стъкла се инкубират за една нощ с първични антитела във влажна камера при 22 °C (система за оцветяване на слайдове StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Използваните първични антитела са заешко моноклонално анти-алфа тубулиново антитяло (разреждане 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), заешко поликлонално анти-инверсионно антитяло (разреждане 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), миши моноклонален DVL -1 антитяло (1:150 разреждане; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ) и заешко поликлонално анти-гама тубулиново антитяло (за да се провери първичното специфично за ресничките оцветяване с алфа- тубулин, разреждане 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). След изплакване в PBS, вторичните антитела бяха приложени за един час, както е посочено: магарешки анти-заешки IgG H&L, Alexa Fluor 488 (разреждане 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) и кози анти-миши IgG H&L, TRITC (разреждане 1:400; ab6786, Abcam, Кеймбридж, Обединеното кралство) 4',6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI) се използва за оцветяване на ядрата и след 2-min инкубация, слайдове бяха промити в PBS и покрити с монтажна среда и покривни стъкла. Неспецифичното оцветяване беше предотвратено чрез използване на протеинов блок (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) преди първичното приложение на антитяло. Като отрицателна контрола беше проведен тест преди адсорбция, докато специфичността на вторичните антитела беше проверена чрез пропускане на първичните антитела от процедурите на оцветяване.

4.3. Електронна микроскопия

Фиксиране набъбректъкани се извършва в 4% параформалдехид за 24 часа, последвано от постфиксация в 1% осмиев тетроксид за 1 час. Процесът на дехидратация се извършва със серия от етанол и завършва с вграждане в смола LX 112 [22]. Един микрометър тънки срезове бяха оцветени с толуидиново синьо и изследвани, за да се изберат ултратънки срезове. Ултратънки срезове с дебелина 0.05 микрометра бяха изследвани след оцветяване с уранил ацетат и оловен цитрат. За получаване на микроснимките е използван микроскоп JEOL 1200 EX.

4.4. Генетичен анализ

Както беше описано по-рано [19], използвайки левкоцити от периферната кръв, беше извлечена геномна ДНК. Установена е хомозиготна миссенс мутация в гена NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg), което потвърждава диагнозата вроден нефротичен синдром от финландски тип (CNF) [57].

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ

4.5. Анализ на данни

Анализът на сечението беше извършен на FL флуоресцентен микроскоп, използвайки 3 FL флуоресцентни канала (Olympus BX51, Токио, Япония). Изображенията са заснети от цифров фотоапарат DP71 (Olympus, Токио, Япония) при увеличение с висока мощност (×40). Самобъбречнакора, съдържаща проксимални извити тубули (pct), дистални извити тубули (dct) и гломерули (g), представляваха интерес. След това изображенията бяха обработени от софтуер ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Национални здравни институти на САЩ, Bethesda, MD, САЩ, https://imagej.nih.gov/ij/ (достъп на 15 октомври 2018 г.), 1997–2021. ) и Adobe Photoshop (Adobe Inc., Сан Хосе, Калифорния, САЩ) за допълнителна оценка. Преди преброяването на клетките беше използван инструментът ImageJ за разделени канали. След това оригиналната имунофлуоресцентна микроскопична снимка беше извадена от червения или зеления канал (в зависимост от това какъв е бил оригиналният канал) с помощта на инструмента ImageJ за калкулатор на изображения, за да се предотврати изтичане на сигнал. Стойности под прагово ниво 50 се считат за отрицателни. Преброихме имунореактивни сигнали в клетки с най-малко 20 структури (pct, dct или g) на стадий или общ положителен брой клетки на микро снимка на мултикистозна дисплазиябъбректъкан, FSGS и CNF. Класифицирахме клетките като положителни, ако имунофлуоресцентният сигнал се натрупа на всяко ниво на мембраната, цитоплазмата или ядрото над стойност 50, измерена на софтуера ImageJ, използвайки прагова команда. Отрицателните клетки бяха категоризирани като клетки с липса на каквато и да е имунореактивност. Двама независими изследователи анализираха данните.

4.6. Полуколичествен анализ

Интензитетът на -тубулин, инверсия и DVL-1 сигнал за оцветяване беше оценен от двама независими изследователи, използвайки софтуера ImageJ. Общият интензитет на сигнала беше измерен, след като изображението беше зададено в 8-битов тип; след това интензитетът на оцветяване на маркера беше оценен в 20 pct, dct и g чрез измерване на очертаната област на структурата. Ако резултатите между оценителите са различни, трети независим изследовател изясни съмнението. Максималният интензитет на сигнала за -тубулин беше 84,125 ± 3,214 SD, за инверсия беше 71,50 ± 2,715 SD и за DVL-1 80.916 ± 1,875 SD. Най-високата наситеност на цвета на сигнала върху снимките на микроскопа е отбелязана като 3 (66,66–99,99 процента от общия интензитет на изображението на сигнала), следвана от 2 (33,33–66,66 процента) за междинния интензитет на сигнала и 1 (0,33 процента –33,33 процента) за нисък интензитет на сигнала (Таблица 1.).

4.7. Статистически анализ

За определяне на разликите между етапите и структурите беше направен тестът на Kruskal-Wallis, последван от post hoc на Dunn с помощта на софтуер GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ, www.graphpad.com (достъп на 15 октомври 2018.)). Броят на положителните клетки беше изразен в проценти като средна стойност ± стандартно отклонение (SD), докато статистическата значимост беше призната при p <0.05. броят="" на="" анализираните="" структури="" беше="" 4200="" в="" 35="" проби,="" с="" общ="" брой="" преброени="" 135="" 256="" клетки.="" използвахме="" 2-way="" anova="" с="" post="" hoc="" теста="" на="" sidak,="" за="" да="" тестваме="" разликите="" в="" експресията="" на="" -тубулин,="" инверсия="" и="" dvl-1="" в="" различни="" етапи="" на="" развитие.="" за="" да="" изследваме="" протеиновата="" експресия="" по="" отношение="" на="" времето="" на="" развитие,="" използвахме="" линейна="" регресия.="" еднопосочен="" anova,="" последван="" от="" post="" hoc="" тест="" на="" tukey,="" беше="" използван="" за="" изследване="" на="" разликите="" в="" експресията="" на="" -тубулин,="" инверсия="" и="" dvl-1="" при="">бъбректъкан в сравнение с тъканите на MCDK, FSGS и CNF. Разликите в експресията на протеини между MCDK, FSGS и CNF бяха изследвани с 2-way ANOVA, последван от post hoc тест на Sidak. Еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Tukey, беше използван за оценка на разликите в дължината на ресничките и височината на епителните клетки на pct между здрав контрол и патологиченбъбрекносни кърпи. Данните бяха показани като средна стойност ± стандартно отклонение (SD) със статистическа разлика, призната при p <>