Полезни за здравето свойства на екстракта от лозови семена и неговото влияние върху избрани биохимични маркери в кръвта, черния дроб и бъбреците на Rattus Norvegicus

edmund.chen@wecistanche.com

Резюме:Кадмият (Cd) е тежък метал, който се среща във всички области на околната среда, включително хранителната верига. В тялото той причинява оксидативен стрес, като произвежда свободни радикали, които са вредни за клетките. Екстрактът от гроздови семена (GSE) съдържа широк спектър от биологично активни компоненти, които спомагат за неутрализиране на неблагоприятните ефекти на свободните радикали. В това проучване са наблюдавани ефектите на GSE, приготвен от полуустойчив лозов сорт Season, който е богат на феноли, върху биохимичните маркери на кафяви плъхове, изложени на въздействието на кадмий. GSE повишава плазмената антиоксидантна активност и вбъбреции черния дроб, съдържанието на Cd е значително понижено от съвместното приложение на GSE. Съответно, повишаването на съдържанието на креатинин и активността на аланин аминотрансферазата и намаляването на активността на каталазата и супероксиддисмутазата, причинени от кадмий, се забавят от съвместното приложение на GSE. Резултатите от тази работа показват, че екстрактът от гроздови семки предлага защитен ефект срещу приема на тежки метали в организма.

1. Въведение

Кадмият (Cd) е тежък метал, който се среща във всички области на околната среда; той е част от земната кора, съдържа се във водата, натрупва се в растенията и присъства в организмите. В допълнение към хранителната верига (по отношение на растенията повечето зърнени култури, кореноплодни растения и зеленчуци са източници, докато сред животинските органи, предимно черният дроб ибъбрециса източник), важен източник на кадмий за хората е цигареният дим, издишванията от различни видове горене, металургичната промишленост и някои електрически инсталации [1,2]. В тялото кадмият се свързва предимно с металотионеин, албумин и други плазмени протеини в кръвта. Кадмият е опасен токсичен метал, който причинява оксидативен стрес, като произвежда свободни радикали, които са вредни за клетките. Свободните радикали могат да увредят протеините, липидите, ензимите и ДНК и следователно трябва да бъдат неутрализирани от антиоксиданти, преди да навлязат в клетките [3].

Ако не се неутрализира, Cd причинява разпадането на червените кръвни клетки [4], натрупва се в организма, особено в черния дроб ибъбреци— и поради сходството си с цинка, който е основен елемент, лесно влиза в ензимни реакции и участва в биохимични процеси [5]. Извежда се много бавно и трудно от организма [6]. Добре известно е, че антиоксидантите могат да имат защитен ефект срещу оксидативен стрес и увреждане от тежки метали и тази експериментална работа се основава на този факт. Екстрактът от гроздови семена (GSE) съдържа широка гама от биологично активни компоненти в своята матрица [7], които спомагат за неутрализиране на неблагоприятните ефекти на свободните радикали. GSE предпазва клетките от увреждане чрез регулиране на клетъчното окислително увреждане, намаляване на увреждането на органите, подобряване на баланса между оксиданти и антиоксиданти и намаляване на освобождаването на възпалителни медиатори. Освен това има противовъзпалителни, антиапоптотични и пролиферативни ефекти [8]. Особено значимо е високото съдържание на кондензиран флаван-3-ол или процианидини, които се изследват като алтернативен метод за лечение на сериозни заболявания [9,10]. Съдържанието и съставът на фенолните съединения от гроздови семена, както и антиоксидантната активност на екстракта от семена, могат да бъдат повлияни от сорта на лозата, подложката, климатичните условия или техниките на отглеждане [11–13] и следователно антиоксидантните свойства, като както и защитните ефекти на конкретния екстракт, не могат лесно да бъдат предвидени. Целта на тази работа е да се проучи защитния ефект на GSE, получен от полуустойчив сорт лоза Cerason върху биохимични маркери в кръвта, плазмата, черния дроб ибъбрецина кафяви плъхове, които са били изложени на въздействието на кадмий.

Ключови думи:екстракт от гроздови семена; антиоксиданти; кадмий; rattus norvegicus; биохимични маркери; защитен ефект; бъбрек, Бъбречна

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ

2. Резултати и дискусия

2.1. Антиоксидантна активност и фитохимичен състав на екстракт от гроздови семена

Екстрактът от гроздови семена, приготвен от полуустойчивия сорт Cerason, е тестван за антиоксидантна активност, общо полифенолно съдържание и избрани индивидуални антиоксиданти. Антиоксидантната активност се определя спектрофотометрично, като се използват четири метода, базирани на различни принципи (DPPH•, ABTS• plus, FRAP, FR), а общите полифенолни съединения се определят с метода на Folin–Ciocalteu. В зависимост от използвания метод, антиоксидантната активност варира от 7 до 31 mg/g еквивалент на галова киселина (GAE), а общото полифенолно съдържание е 9,3 mg/g GAE (Таблица 1). Резултатите от тази част от експеримента сочат високия антиоксидантен потенциал в гроздовите семки.

2.2. In vivo определяне на ефекта на екстракта от гроздови семена при плъхове

2.2.1. Определяне на съдържанието на кадмий в кръвта, черния дроб и бъбрецитеКадмият е най-разпространеният токсичен метал във фуражите. След перорално приложение, той се абсорбира от червата, транспортира се до черния дроб и се конюгира с тиолови групи на металотионеин (MT). Освен това, Cd може да се свърже с албумин или други протеини в кръвта [14]. Впоследствие Cd се натрупва в тялото, отделя се бавно от тялото чрез урината и изпражненията и има биологичен полуживот от около 20 години. Най-голямото количество (около една трета) кадмий се намира вбъбреккора. В кръвта най-много кадмий (около 90 процента) присъства в червените кръвни клетки. Той е токсичен за широк спектър от органи и основните мишени сабъбреци, кости и бели дробове [15–17]. Съобщава се, че GSE понижава концентрациите на кадмий в червените кръвни клетки и вбъбреци,като има предвид, че съдържанието му в черния дроб се увеличава [14]. Резултатите за съдържанието на кадмий в кръвта в това изследване са показани на фигура 1А. В началото на експеримента в кръвта на животните са открити 3,2 µg/kg кадмий. По време на експеримента, след 14 дни, средната стойност на кадмий в групата с добавяне на GSE и кадмий е значително по-висока, отколкото в други групи (10,8 µg/kg, p=0.023). След 28 дни променливостта на данните беше твърде висока, за да се наблюдава статистическа значимост.

В началото на експеримента не е открит кадмий в черния дроб (Фигура 1B) на опитните животни. Съответно не е открит кадмий в черния дроб на животните от контролната и GSE групи по време на експеримента. От друга страна, след 14 дни от експеримента, средната стойност на кадмий в групата с добавяне на кадмий е 5,8 mg/kg, а в групата с добавяне на кадмий и GSE средната стойност е 5,2 mg/kg. И двете стойности са значително различни от контролната група (p=0.002 и p=0.018 за групата само с кадмий и групата с кадмий и GSE, съответно). След 28 дни средната стойност в групата с добавяне на кадмий се повишава до 6,7 mg/kg, което се различава значително от нивото на кадмий в групата с добавяне на кадмий и GSE, което леко намалява до 4,8 mg/kg (p=0.008).

В началото на експеримента не беше открит кадмий вбъбреци(Фигура 1C) на експерименталните животни. Съответно не е открит кадмий вбъбрецина животните от контролната и GSE групи по време на експеримента. От друга страна, след 14 дни средната стойност на кадмий в групата с добавяне на кадмий е 9,5 mg/kg, а в групата с добавяне на кадмий и GSE средната стойност е 6,5 mg/kg. И двете стойности са значително различни от контролната група (p < 0.001="" и="" за="" двете="" групи).="" след="" 28="" дни="" средната="" стойност="" в="" групата="" с="" добавяне="" на="" кадмий="" се="" е="" повишила="" до="" 16,6="" mg/kg,="" което="" се="" различава="" значително="" от="" нивото="" на="" кадмий="" в="" групата="" с="" добавяне="" на="" кадмий="" и="" gse,="" което="" се="" е="" повишило="" само="" леко="" до="" 10,4="" mg/kg.="" kg="" (p="0.009)." по="" този="" начин,="">бъбреции в черния дроб, съдържанието на Cd е значително понижено от приложението на GSE. GSE съдържа фенолни съединения, които могат да хелатират Cd, като по този начин намаляват натрупването на Cd. Образуването на тези хелати вероятно е довело до намалена способност на протеините да свързват Cd, който по този начин може да бъде елиминиран по-ефективно от тялото [18].

2.2.2. Определяне на съдържанието на креатинин и урея

По отношение на натрупването на кадмий вбъбреци, набъбреке един от най-важните целеви органи за индуцирана от Cd токсичност. Следователно, набъбрекв плазмата се определят маркери креатинин и урея. Определянето на креатинин е добър индикатор за гломерулна филтрация и се използва главно за проследяване на хода назаболяване на бъбреците. Връзката между концентрацията на креатинин и гломерулната филтрация е хиперболична; тъй като гломерулната филтрация намалява, секрецията на креатинин също намалява [19]. Повишеният прием на тежкия метал кадмий води доувреждане на бъбрецитеи следователно намалена ефективност на секрецията на креатинин. В резултат на това повишеното ниво на креатинин в кръвта показва aбъбречнаразстройство [20].

В нашето проучване нивата на креатинина бяха повишени с Cd, в съответствие с публикуваните по-рано резултати [21]. Средната стойност на съдържанието на креатинин (Фигура 2А) при експерименталните животни в началото на експеримента е 3.0 mg/L. В групата, получаваща кадмий, има значително увеличение на наблюдаваните стойности до 5,1 mg/L (след 14 дни, p=0.015) и до 6,2 mg/L (след 28 дни, p < 0.001).="" в="" групата,="" за="" която="" gse="" е="" прилаган="" едновременно="" с="" кадмий,="" увеличението="" на="" този="" маркер="" е="" по-ниско="" (4,2="" mg/l="" след="" 14="" дни="" и="" 5,5="" mg/l="" след="" 28="" дни)="" и="" статистически="" значимо="" само="" след="" 28="" дни,="" в="" сравнение="" с="" контролата="" (="" р=""><0,001). по="" този="" начин="" повишаването="" на="" концентрацията="" на="" креатинин="" се="" забавя="" от="" съвместното="" приложение="" на="" gse,="" което="" предполага="" намаляване="" на="" токсичния="" ефект,="" причинен="" от="" кадмий.="" в="" групата,="" получаваща="" само="" gse,="" имаше="" нормални="">

Уреята е количествено най-важният продукт от разграждането на аминокиселините и протеините. Образува се в черния дроб от амоняк, освободен при реакции на дезаминиране по време на метаболизма на аминокиселините. Екскретира се от организма главно чрезбъбрецичрез гломерулна филтрация и тубулна резорбция [22]. В случай чебъбречни заболявания, скоростта на производство на урея надвишава скоростта на нейния клирънс, което води до повишаване на нивото на уреята в кръвта. Освен това кадмият инхибира включването на аминокиселини в протеините, причинявайки уремия [21]. От друга страна, когато чернодробната функция е нарушена, синтезът на урея намалява и следователно и нейната концентрация в плазмата [20]. По този начин концентрацията на урея в кръвта зависи от съдържанието на протеин в храната,бъбречнаекскрецията и метаболитната функция на черния дроб.

В нашето проучване нивата на урея бяха повишени с Cd, в съответствие с публикуваните по-рано резултати [21]. Средната стойност на съдържанието на урея (Фигура 2В) при опитните животни в началото на експеримента е 207 mg/L. В групата, приемаща кадмий, има значително увеличение на наблюдаваните стойности до 329 mg/L (след 14 дни) и 425 mg/L (след 28 дни). В групата, за която GSE е прилаган едновременно с кадмий, увеличението на този маркер е само малко по-ниско - 325 mg/L след 14 дни и 381 mg/L след 28 дни. И двете групи, получаващи само кадмий и кадмий заедно с GSE, се различават значително от контролната група след 14 (p=0.001 и p=0.002, съответно) и 28 дни от експеримента (p <0.001 за="" двете).="" в="" групата,="" получаваща="" само="" gse,="" са="" открити="" нормални="">

2.2.3. Определяне на плазмената антиоксидантна активност

Кадмият предизвиква редица ефекти, свързани предимно с оксидативния стрес. Тъй като Cd не е редокс-активен, той не генерира директно реактивни кислородни видове. Независимо от това, тяхното производство след излагане на Cd е докладвано в много проучвания и прегледано от Cuypers et al. [23]. Механизмите, водещи до редокс смущения по време на експозиция на Cd, включват изчерпване на редуцирания глутатион, причинено от афинитета на Cd към тиоловите групи, заместването на Fe с Cd в протеините, което води до повишени концентрации на редокс-активно свободно Fe, митохондриална дисфункция и индукция на NADPH оксидази, които катализират образуването на супероксидни радикали [23]. По време на оксидативен стрес, антиоксидантни съединения като феноли могат да прекратят производството на нови реактивни видове чрез превръщането им в стабилни радикални форми. Следователно растителните екстракти, богати на феноли, могат да осигурят защитни ефекти срещу Cd или Cd-съдържащи съединения [24].

В това проучване средната стойност на плазмената антиоксидантна активност (Фигура 3) при експерименталните животни в началото на експеримента беше 0.71 mg/L. Наблюдава се леко увеличение във всички експериментални групи в сравнение с контролната група. Въпреки това, единствената значителна разлика е тази между групата, лекувана с GSE, и контролната група след 28 дни (p=0.012), потвърждавайки положителния ефект на GSE върху плазмената антиоксидантна активност. Докладваните по-рано резултати са двусмислени; понякога се установява повишаване на плазмения антиоксидантен потенциал, причинено от GSE [25], а понякога не [14].

2.2.4. Определяне на активността на ALT и AST

Оксидативният стрес е свързан със загуба на функционална цялост на мембранната архитектура, причинена от повишена липидна пероксидация. От своя страна повишената пропускливост на цитоплазмената мембрана води до изтичане на чернодробни маркерни ензими (ALT и AST) в кръвта [14]. Наистина, ALT и AST са диагностично значими дори при ограничено увреждане на черния дроб поради интоксикация и тяхното повишаване в серума, причинено от кадмий, е докладвано по-рано [14] и е потвърдено от това проучване. Средната стойност на активността на ALT (Фигура 4А) при експерименталните животни в началото на експеримента беше 0.84 µkat/L. В групата, получаваща кадмий, е регистрирано значително увеличение на наблюдаваните стойности до средно 1,52 µkat/L след 14 дни (p < 0.001)="" и="" 1,87="" µkat/l="" след="" 28="" дни="" (p="" {{="" 13}}.004).="" в="" групата,="" за="" която="" gse="" се="" прилага="" едновременно="" с="" кадмий,="" нарастването="" на="" този="" маркер="" е="" значително="" по-бавно,="" отколкото="" в="" групата,="" получаваща="" само="" кадмий="" (1,23="" µkat/l="" след="" 14="" дни="" и="" 1,92="" µkat/l="" след="" 28="" дни).="" след="" 14="" дни="" от="" експеримента="" тази="" група="" се="" различава="" както="" от="" контролната="" група="" (p="0.009)," така="" и="" от="" групата="" с="" кадмий="" (p="0.026)," докато="" след="" 28="" дни="" се="" различава="" значително="" само="" от="" контролната="" група="" (p="0.003)." в="" групата,="" получаваща="" само="" gse,="" стойностите="" също="" се="" повишават="" до="" 1,17="" µkat/l="" след="" 14="" дни.="" тази="" стойност="" се="" различава="" значително="" от="" контролната="" група="" (p="0.024)" и="" е="" сравнима="" със="" стойността="" на="" групата,="" получаваща="" както="" gse,="" така="" и="" кадмий.="" след="" 28="" дни="" стойностите="" на="" групата="" само="" с="" gse="" приличат="" на="" контролната="">

Средната стойност на съдържанието на AST (Фигура 4B) при експерименталните животни в началото на експеримента е 2,07 µkat/L. В групата, получаваща кадмий, статистически значимо увеличение на наблюдаваните стойности е регистрирано едва след 28 дни от експеримента (3,52 µkat/L, p=0.001). Изненадващо, в групата, за която GSE е прилаган едновременно с кадмий, увеличението на този маркер е по-бързо и значително различно от контролната група както след 14 дни, така и след 28 дни (съответно 2,67 и 2,84 µkat/L, p {{15 }}.043 и за двете), въпреки че стойността е малко по-ниска от тази на групата само с кадмий след 28 дни. Вариантът само за GSE имаше нормални стойности.

В нашия експеримент, приложението на GSE успя да забави увеличаването на активността на ALT. Този ефект съответства на резултатите, докладвани по-рано [14] и може би е причинен от извличане на липидни пероксиди чрез пренос на водород от фенолно съединение към липиден пероксид, съдържащ свободни радикали. От друга страна, в дългосрочен план този ефект е слаб. Увеличаването на активността на AST, причинено от кадмий, беше доста ускорено от прилагането на GSE. Въпреки това, в по-дългосрочен план, има лек спад в активността на AST. По този начин GSE може частично да компенсира токсичния ефект на Cd върху клетъчните мембрани.

2.2.5. Определяне на SOD и CAT активности в черния дроб

В допълнение към директното участие в окислителните реакции, кадмият инхибира активността на антиоксидантни ензими като SOD и CAT, ензими, способни да детоксикират съответно супероксидните радикали и водородния пероксид [14]. SOD е ензим, който ефективно потушава супероксидния радикал и го превръща в по-малко токсичния водороден пероксид, който може да бъде допълнително разграден от каталаза или пероксидаза [26]. CAT е ензим, който се намира в почти всички живи организми, които са изложени на кислород. Той действа като катализатор за разграждането на водородния прекис във вода и кислород [27]. Той има един от най-високите числа на преобразуване сред ензимите [28] и като антиоксидантен ензим е един от защитните механизми, които водят до поддържане на баланса в човешкото тяло [29]. Механизмът на индуцираното от Cd намаляване на ензимните активности вероятно е директното свързване на Cd към активните центрове на ензимите [30].

Намаляването на SOD и CAT активностите също се наблюдава в това проучване. В началото на експеримента средната ензимна активност на SOD в черния дроб (Фигура 5А) на експерименталните животни е 18,4 U/mg от протеина. След 14 дни от експеримента активността на SOD е значително по-висока в групата, получаваща GSE (21,1 U/mg), отколкото в двете групи, получаващи кадмий (p < 0.001="" и="" p="" {{="" 9}}.009="" съответно="" за="" групите="" само="" с="" кадмий="" и="" кадмий="" с="" gse),="" но="" само="" в="" групата,="" получаваща="" само="" кадмий,="" активността="" на="" sod="" е="" значително="" по-ниска="" (16,7="" u/mg),="" отколкото="" в="" контролната="" група="" (p="0" .005).="" след="" 28="" дни="" от="" експеримента="" и="" двете="" групи,="" получаващи="" кадмий,="" се="" различават="" значително="" от="" двете="" контролни="" групи="" (16,4="" u/mg,="" p="0.002" и="" 17,6="" u/mg,="" p="0.023" за="" кадмий="" само="" и="" кадмий="" с="" gse,="" съответно)="" и="" групата,="" лекувана="" само="" с="" gse="" (p=""><0,001 и="" p="0.005" само="" за="" кадмий="" и="" кадмий="" с="" gse,="">

В началото на експеримента средната CAT ензимна активност в черния дроб (Фигура 5B) е 32,7 U/mg от протеина. След 14 дни от експеримента активността на CAT е значително по-висока в групата, получаваща GSE (33,5 U/mg), отколкото в двете групи, получаващи кадмий (p=0.002 и p=0.031 за само с кадмий и съответно с кадмий с GSE групи), но само в групата, получаваща само кадмий, CAT активността е значително по-ниска (23,8 U/mg), отколкото в контролната група (p=0.005). Въпреки това, след 28 дни, CAT активността в групата, получаваща GSE заедно с кадмий, намалява допълнително до 27,1 U/mg, достига стойностите на групата само с кадмий (25,8 U/mg) и се различава значително от контролната група (p { {21}}.033). Групата, лекувана само с GSE, се различава значително от двете групи с кадмий (p=0.026 и p=0.012 само за кадмий и съответно за кадмий с GSE). Интересно е, че намаленията, причинени от кадмий, са забавени от съвместното приложение на GSE. За CAT, тези ефекти на GSE са наблюдавани по-рано [14]. Хелатиращият ефект на фенолните съединения, съдържащи се в GSE, вероятно ще намали способността на кадмия да се свързва с активното място на ензима.

2.2.6. Определяне на MT съдържание

Кадмият не подлежи на директни метаболитни преобразувания, но във всички тъкани той е свързан главно с металотионеин (MT). МТ принадлежи към група вътреклетъчни протеини с ниско молекулно тегло, богати на цистеин с молекулно тегло 6–10 kDa. Основната роля на МТ в организма включва поддържане на цинковата хомеостаза, детоксикация на тежки метали и защита срещу оксидативен стрес. Експресията на МТ се индуцира от много екзогенни и ендогенни фактори като UV радиация, тежки метали, хормони на стреса, свободни кислородни радикали, медиатори на възпаление, инфекция, травма и онкогенеза [31,32]. МТ се синтезира до голяма степен в черния дроб ибъбреки се освобождава в кръвта. Въпреки че МТ е отговорен за натрупването на кадмий в тъканите чрез понижаване на неговата екскреция, МТ предпазва от остра, както и хронична индуцирана от Cd токсичност [33]. В нашето проучване съдържанието на МТ се наблюдава в кръвта, черния дроб ибъбрек.

Средната стойност на съдържанието на МТ в кръвта (Фигура 6А) на експерименталните животни в началото на експеримента е 23,9 nmol/g. След 14 дни промените са минимални и след 28 дни се наблюдава голяма вариабилност между повторенията, което води до статистическа неубедителност (p=0.948). Средната стойност на съдържанието на МТ забъбреци(Фигура 6В) на експерименталните животни в началото на експеримента е 21.46 nmol/g. Стойностите не се променят значително в нито една експериментална група по време на експеримента (p=0.938). Средната стойност на съдържанието на МТ в черния дроб (Фигура 6С) на експерименталните животни в началото на експеримента е 17,15 nmol/g. След 14 дни съдържанието на МТ се повишава леко във всички експериментални групи и разликите спрямо контролната група са значителни за групата само с Cd и групата само с GSE (p=0.008 и p=0 .046, съответно). След 28 дни съдържанието на МТ в групата с GSE се върна до стойността на контролната група, докато съдържанието на МТ в групата с Cd остана повишено и се различава както от контролната, така и от групата с GSE (p=0.046 и p=0.035, съответно). В групата, получаваща GSE заедно с кадмий, съдържанието на МТ не се различава значително от контролата - което е в съответствие с по-ниското съдържание на кадмий, открито в черния дроб на тази група - в сравнение с групата само на Cd (разликата е значителна след 28 дни от експеримента).

Като цяло, статистически значими промени в съдържанието на МТ, причинени от Cd, се наблюдават само в черния дроб. По-рано беше докладвано увеличение на MT в кръвта на експериментални животни, получаващи кадмий [34]. В този случай резултатите предполагат, че детоксикацията на Cd чрез МТ може по-скоро да се случи в черния дроб.

3. Материали и методи

3.1. Дизайн на експериментаКафяви плъхове от вида Wistar (на осем седмици, 235 ± 3 g) бяха разделени на четири групи от шест индивида: A) контролна група плъхове, следващи обикновена диета (n=6); B) група плъхове, към чиято диета е добавен GSE (200 mg GSE/ден) (n=6); C) група, на която е даден кадмий (2 mg Cd/ден - по-конкретно, CdCl2, разтворен във вода) (n=6); и D) група, на която е дадена диета, съдържаща кадмий (2 mg Cd/ден), към която е добавен GSE (200 mg GSE/ден) (n=6). Екстрактът е взет от семената на лозовия сорт Cerason; неговото приготвяне и характеризиране са описани в раздел 3.2. (Екстракт от лозови семена). Екстрактът се претегля ежедневно в доза от 200 mg, преди да се приложи на експерименталните кафяви плъхове (200 mg GSE за всеки плъх; 0,85 g/L kg телесно тегло). GSE се прилага с вода. На плъховете са дадени влажни хранителни смеси и безвредна вода (за бебета) ad libitum. Веднъж седмично постелята на животните се сменяше. След 14 и 28 експериментални дни три животни от всяка група бяха евтаназирани и кръвта им беше събрана чрез сърдечна пункция. Преди събирането се прилага интраперитонеално лечение с Fraxiparin (0,01 mL/kg) и след това на животните се дава диетилов етер под инхалационна анестезия. След това се събира кръвна проба в покрити с хепарин микроепруветки (или епруветки с EDTA — за анализи на МТ и кадмий; без последващо центрофугиране) и това е последвано от внимателно центрофугиране (800 g/10 min) и събиране на кръв плазма за допълнителен анализ. Черният дроб и дяснобъбрекбяха извлечени за допълнителен анализ. Проучването е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и протоколът е одобрен от Експертната комисия за осигуряване на хуманното отношение към експерименталните животни на Университета Мендел в Бърно (за проект IGA-ZF/2016-AP011).

3.2. Екстракт от лозови семена

Лозовите семена (сорт Cerason—Merlot × Seibel 13 666) бяха сортирани, почистени, изсушени и смлени. Сортирането става чрез джибри на сепарираща машина, където семената се отделят от обелките. Отделените по този начин семена впоследствие се изплакват, празните семена се отстраняват, а останалите семена се почистват. Почистените и измити семена се сушат в сушилня при 50 ◦C в продължение на 12 часа. Това беше последвано от смилане на семената с помощта на лабораторна мелница IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Германия). Смлените семена се екстрахират в 75 процента етанол за 120 часа (22 ◦C, разклащат се при 50 RPM; IKA KS 260 Basic, производител: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Германия) в съотношение една част смлени семена към десет части етанол (m/m). След това екстрактът се поставя в епруветки от 25 mL (Eppendorf, Хамбург, Германия) и се центрофугира (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, Германия) при 4 ◦C и RCF 25,000× g. От епруветката се взема центрофугирана проба и се прехвърля във вакуумна изпарителна дестилационна колба (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Германия), където етанолът се изпарява. Изпаряването се извършва във вакуум при 90 ◦C и екстрактът се прехвърля в петриеви панички и се лиофилизира във вакуум при 53 ◦C (лиофилизатор Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, Чехия). След като е приготвен, екстрактът се прилага на опитните животни.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ

3.3. Определяне на антиоксидантна активност и общо съдържание на полифеноли

За да се осигури обективност на резултатите, бяха използвани четири принципно различни метода за определяне на антиоксидантната активност. Пробите бяха анализирани на автоматичен спектрофотометър BS-400 (Mindray, Shenzen, Китай). Всички проби бяха анализирани в три екземпляра, като получената стойност съответства на средната стойност на тези измервания. Тези анализи бяха извършени следвайки Sochor et al. [35].

3.3.1. Определяне на антиоксидантната активност с помощта на ABTS метода

Разтвор за определяне на антиоксидантна активност чрез ABTS анализ се приготвя чрез смесване на два разтвора - разтвор 1: 7 mM разтвор на ABTS, получен чрез претегляне на m=9.60 mg на 5 mL дестилирана вода; и разтвор 2: 4,95 mM разтвор на калиев персулфат, получен чрез претегляне на m=1.67 mg на 5 mL дестилирана вода. Полученият разтвор се разрежда 1:10 с дестилирана вода и се оставя на тъмно и студено за 12 часа. След това 150 µL от реагент R1 (7 mM ABTS и 4,95 mM калиев персулфат) се пипетират в пластмасови кювети, последвано от добавяне на 3 µL от пробата и се измерва в спектрофотометър (λ=660 nm) за 12 мин. Съгласно калибровъчната крива, абсорбцията се превръща в еквивалентно съдържание на галова киселина; антиоксидантната активност се изчислява от кривата на калибриране, като се използва галова киселина като стандарт (10–200 mg·L1) и резултатите се изразяват като еквиваленти на галова киселина.

3.3.2. Определяне на антиоксидантната активност с помощта на DPPH метода

Първо се претеглят m {{0}}.35 mg радикал DPPH. Това количество се прехвърля в 250 mL мерителна колба и се допълва с метанол. След това 150 µL от реагент R1 (0.095 mM DPPH) се пипетират в пластмасови кювети, последвано от добавяне на 15 µL от пробата за измерване. DPPH тестът се основава на способността на стабилния свободен радикал 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил да реагира с донори на водород. DPPH показва силна абсорбция в спектъра на ултравиолетовата видима спектроскопия (UV-VIS). Абсорбцията се измерва в продължение на 12 минути при λ=505 nm. Според калибровъчната крива абсорбцията се преобразува в еквивалентно съдържание на галова киселина.

3.3.3. Определяне на антиоксидантната активност с помощта на метода за намаляване на желязо антиоксидантната мощност

Бяха използвани три разтвора за определяне на антиоксидантната активност с помощта на метода за редуциране на антиоксидантната сила на желязо (FRAP)—(1) TPTZ разтвор: 10 mM TPTZ (m=78.02 mg), разтворен в 25 mL от 40 тМ НС1; (2) Разтвор на FeCl3: 20 mM FeCl3 (m=135.13 mg), разтворен в 25 mL дестилирана вода; и (3) ацетатен буферен разтвор: 0,02 М ацетатен буфер рН 3,6 (m=775 mg натриев ацетат, разтворен в 250 mL дестилирана вода, рН коригирано с оцетна киселина). Трите разтвора се смесват в съотношение 1:1:10 (TPTZ:FeCl3:ацетатен буфер). След това 150 µL от реагента се пипетират в пластмасови кювети и се добавят 3 µL от пробата. Абсорбцията се измерва за 12 минути при λ=605 nm. Антиоксидантната активност се изчислява от калибрационната крива, като се използва галова киселина като стандарт (10–200 mg·L1). Резултатите са изразени като еквивалент на галова киселина.

3.3.4. Определяне на антиоксидантната активност с помощта на метода на свободните радикали на хлорофилина

Общо 200 µL от реагент R1 (0,1 М HCl, екстракт от хлорофил, реакционен буфер, катализатор) се пипетират в пластмасови кювети и след това се добавят 8 µL от пробата. Този метод използва способността на хлорофилин (натриево-медна сол на хлорофила) да приема и отдава електрони, като същевременно стабилно променя максимума на абсорбция. Този процес се обуславя от алкалната среда и добавянето на катализатор. Абсорбцията се измерва в продължение на 12 минути при λ=450 nm. За изчислението са използвани последните измерени стойности. Резултатите са изразени като еквивалент на галова киселина.

3.3.5. Определяне на общата концентрация на полифенол

Методът на Folin-Ciocalteu беше използван за определяне на общите полифенолни съединения. Всички проби бяха анализирани в три екземпляра и получената стойност беше получена като средна стойност на тези измервания. Проба от 40 µL се пипетира в кювета (3 mL) и се разрежда с 1960 µL дестилирана вода. Впоследствие към кюветата се добавят 50 µL реагент Folin-Ciocalteu. Сместа се разклаща старателно и след 3 минути се добавят 300 uL 20 процента разтвор на Na2CO3 декахидрат. Реакционната смес се разклаща и инкубира при 22 °C за 120 минути. След това време абсорбцията (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Йена, Германия) беше измерена при λ=750 nm спрямо празна проба. Резултатите са изразени като еквивалент на галова киселина.

3.4. Определяне на антиоксиданти чрез HPLC

Определяне на отделни антиоксидантни компоненти с помощта на високоефективна течна хроматография с масспектрометър. Анализите на пробите, използвани за оценка на флавоноиди и проантоцианини, бяха извършени в хроматографска система Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ), състояща се от следните устройства: резервоари за подвижна фаза, дегазатор, бинарна помпа, резервоар за проба с автосамплер и масов детектор с Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Разделянето на пробите се извършва в хроматографски колони Zorbax SB C18 с размери 50 × 2.1 mm и размер на частиците 2.7 µm. Периодът на анализ винаги е бил 6 минути. Другата скорост на газа носител беше 0,6 mL·min1. Органичният компонент на подвижната фаза е градиент на метанол (разтворител В), а водната съставка съдържа 0,05 М амониев формиат (разтворител А). Градиентът на подвижната фаза е както следва: време 0 минути: 50 процента разтворител А и 50 процента разтворител В; време 2.5 минути: 100 процента разтворител А и 0 процента разтворител В; време 5 минути: 50 процента разтворител А и 50 процента разтворител В. Температурата на термостата на колоната се регулира до 45 ◦C.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

3.5. Определяне на избрани биохимични маркери

Биохимични маркери в кръвта, плазмата, черния дроб ибъбрекот животните бяха наблюдавани, за да се определи защитният ефект на GSE срещу отрицателните ефекти на кадмия. Бяха извършени следните анализи: (1) Анализи на плазма: обща плазмена антиоксидантна активност, креатинин, урея, ALT, AST. (2) Кръвни анализи: MT. (3) Чернодробни анализи: SOD, CAT, MT. (4)Бъбреканализи: МТ.

3.5.1. Определяне на общата плазмена антиоксидантна активност,Креатинин, урея, ALT и AST Автоматичен биохимичен анализатор BS{{0}} (Mindray, Shenzen, Китай) беше използван за анализиране на общата антиоксидантна активност на плазмата, креатинина, уреята, ALT и AST. Определяне на общата антиоксидантна активност на плазмата За определяне на антиоксидантната активност на плазмата е използван методът на свободните радикали [35]. Този метод използва способността на хлорофилина (натриево-медната сол на хлорофила) да приема и отдава електрони, като същевременно стабилно променя максимума на абсорбция. Този процес се обуславя от алкалната среда и добавянето на катализатор. Общо 200 µL от реагент R1 (0,1 М НС1, хлорофилинов екстракт, реакционен буфер и катализатор) се пипетират в пластмасови кювети, след което се добавят 8 µL от пробата. Абсорбцията беше измерена за 12 минути при λ=450 nm и последната измерена стойност беше използвана за изчислението. Антиоксидантната активност се изчислява от калибрационната крива, като се използва галова киселина като стандарт и резултатите се изразяват като еквивалент на галова киселина.

Определяне на съдържанието на креатининПринципът на метода е фотометричното определяне на цветния комплекс на креатинин с алкален пикрат, чиято скорост на образуване е пропорционална на концентрацията на креатинин в пробата. За определяне на креатинина беше използван диагностичен комплект от Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Германия). Общо 180 µL от реагент R1 (0,16 mM натриев хидроксид) се пипетират в кюветата, последвано от добавяне на 10 µL от пробата и 30 µL от реагент R2 (4 mM пикринова киселина). Абсорбцията се измерва за шест минути при λ=505 nm. Стойността на абсорбция на реагент R1 самостоятелно с пробата и стойността на абсорбция след 6 минути инкубация с реагент R2 бяха използвани за изчислението.

Определяне на аланин аминотрансферазаЗа определяне на ALT беше използван диагностичен комплект от Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Германия). Първо, 150 µL реагент R1 (100 mM Tris буфер рН 7,5; 500 mM L-аланин, 1200 U/L лактат дехидрогеназа) и 15 µL плазмена проба бяха автоматично пипетирани в кюветите. След това автоматично се пипетират 30 µL от реагент R2 (15 mM 2-оксоглутарат, 0,18 mM NADH) и сместа се инкубира в продължение на 5 минути. Абсорбцията се измерва при λ=340 nm. Стойностите на абсорбция на реагент R1 самостоятелно с пробата и стойностите на абсорбция след 5 минути инкубация с пробата бяха използвани за изчислението. Резултатът се преобразува според калибровъчната крива в ензимната активност в µkat/L.

Определяне на аспартат аминотрансферазаЗа определяне на AST беше използван диагностичен комплект от Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Германия). Първо, 150 µL реагент R1 (80 mM Tris буфер рН 7,8, 240 mM L-аспартат, 1200 U/L малат дехидрогеназа) и 15 µL плазмена проба от експериментални животни бяха автоматично пипетирани в кюветите. Впоследствие се извършва смесване и инкубиране при 37 ◦C за 270 s. След това автоматично се пипетират 30 µL от R2 реагент (15 mM 2-оксоглутарат, 0,18 mM NADH) и сместа се инкубира за 5 минути. Абсорбцията се измерва при λ=340 nm. Стойностите на абсорбция на реагент R1 самостоятелно с пробата и стойностите на абсорбция след 5 минути инкубация с пробата бяха използвани за изчислението. Резултатът се преобразува според калибровъчната крива в ензимната активност в µkat/L.

Определяне на уреяСледната процедура беше използвана за определяне на уреята: 200 µL от реагент R1 (Tris буфер pH 7,8, ADP, уреаза и GLDH) и 200 µL от реагент R2 (2-оксоглутарат, NADH) бяха автоматично пипетирани в кювети, последвано от проба с обем 4 µL, след което сместа се смесва и инкубира при 37 ◦C за 30 s. Впоследствие беше измерена абсорбцията при λ=340 nm и след още 60 s отново беше измерена абсорбцията. Стойностите на абсорбцията след 30 s и след още 60 s бяха използвани за изчислението. Стойностите се изваждат една от друга и резултатът се преобразува според калибровъчната крива в съдържанието на урея.

Определяне на общите протеини по биуретовия методОпределянето на общите протеини по биуретовия метод е описано подробно в друга публикация [9]. Общо 180 µL биуретов реагент (15 mM натриево-калиев тартарат, 100 mM NaI, 5 mM KI и 5 mM CuSO4) се пипетират в кюветата, последвано от 45 µL от пробата. След десет минути инкубация при 37 ◦C се измерва абсорбцията при дължина на вълната λ=546 nm. Принципът тук е реакцията на пептидната връзка с Cu (II) в алкална среда, с образуване на синьо-виолетов цвят. Стойността на абсорбция само на реагента и стойността на абсорбция след десет минути инкубация с пробата бяха използвани за изчислението.

3.5.2. Определяне на супероксид дисмутаза (SOD) и каталаза (CAT) Определяне на SOD активност, Търговски комплект (19160 SOD, Merck KGaA, Дармщат, Германия) беше използван за определяне на активността на SOD (SOD, EC 1.15.1.1). Измерването се извършва в пластмасова кювета на автоматичен анализатор BS 400 (Mindray, Shenzen, Китай). Първо, 200 µL от реагент R1 (20 × буфер, разреден WST разтвор) се пипетират в кюветата и реагентът се инкубира при 37 °C за 108 s (1 min, 48 s). След това се пипетират 20 µL от пробата и при 378 s (6 минути, 18 s) реакцията започва чрез добавяне на 20 µL реагент R2 (167 × буферно разреден ензимен разтвор). Сместа се инкубира за 72 s (1 min, 12 s) и след това се измерва абсорбцията при λ=450 nm. Кинетиката на реакцията се измерва за 180 s (3 min) и абсорбцията се отчита на всеки девет секунди. Уредът изчислява средното увеличение на абсорбцията за минута (∆A) и активността на SOD на измерените проби, съгласно уравнението за калибриране. Резултатите бяха изразени в U/mL и впоследствие преобразувани в mg протеин.

3.5.3. Определяне на съдържанието на металотионеинОпределянето на концентрацията на металотионеин в кръвта, черния дроб ибъбрецина кафявите плъхове беше извършено с помощта на техниката за отстраняване на адсорбционен трансфер (AdTS) с диференциална импулсна волтаметрия (DPV). За анализа са взети 200 µL от анализирания супернатант и са смесени с 1 800 µL от реактива на Brdiˇcka в измервателен съд, след което е извършено самото електрохимично определяне. Анализът беше извършен в съответствие с описан по-рано протокол [37]. Използва се класическа триелектродна връзка. Работният електрод беше висящ живачен капков електрод (HMDE) с капкова площ 0.4 mm2, докато референтният електрод беше Ag/AgCl/3 M KCl, а спомагателният беше платинен електрод. Базовият електролит (1 mmol·L1 [CO(NH3)6]Cl3 и 1 mol·L1 амониев буфер; NH3(aq) плюс NH4Cl, pH 9,6) се променя за всяка измерена проба. Параметрите на DPV бяха както следва: начален потенциал 0.7 V, краен потенциал 1,75 V, кипене 5 s, време на отлагане 240 s, време на модулация 0.0 5 s, интервално време 0,25 s, потенциална стъпка 0,00105 V, скорост на сканиране 0,0042 V/s и амплитуда на модулация 0,02505 V. Определянето на MT се извършва на измервателно устройство, състоящо се от 695 Autosampler, свързан към измервателен уред VA Stand 693 и контролиран от контролен блок 693 VA TraceAnalyser (всички Metrohm, Herisau, Швейцария). Цялата измервателна система беше охладена до 4 ◦C с помощта на Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Германия). Получените волтамограми бяха експортирани в програмата VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, Швейцария) и анализираните проби бяха деоксигенирани чрез активно барботиране на аргон с чистота 99,999 процента.

3.5.4. Определяне на съдържанието на кадмий в кръвта, черния дроб и бъбреците Разлагане на пробите  Използван е микровълнов екстрактор Ethos One (Milestone, Sorisole, Италия) за разграждането на черния дроб ибъбрекпроби, а микровълнов екстрактор Multiwave 3000 (Anton Paar Graz, Австрия) беше използван за разлагането на кръвните проби. Минерализацията се извършва по мокър начин, като се използва 65 процента азотна киселина (HNO3 супра чиста) (Merck KGaA, Дармщат, Германия) и 30 процента водороден пероксид (H2O2 супра чиста) (Merck KGaA, Дармщат, Германия) Общо 0,4 g от черен дроб илибъбрекпробата се претегля в серия от теффлонови контейнери и към пробата се добавят 5 mL 65 процента HNO3, 3 mL 30 процента H2O2 и 2 mL Milli Q H2O. Контейнерите се затварят и инструментът се стартира съгласно инструкциите на производителя. Микровълновото разлагане продължи 40 минути при 210 ◦C. Впоследствие пробите се охлаждат за 45 минути и се съхраняват при 4 ◦C в PE контейнери. Общо 0,01 g кръвна проба се претеглят в серия от стъклени контейнери и към пробата се добавят 300 µL 65 процента HNO3 и 200 µL 30 процента H2O2. Контейнерите се затварят и инструментът се стартира съгласно инструкциите на производителя. Микровълновото разлагане продължава 40 минути при температура 140 ◦C. Впоследствие пробите се охлаждат за 45 минути и се съхраняват при 4 ◦C до определянето с AAS.

Определяне на кадмий чрез атомно-абсорбционна спектрометрияКадмият се определя на устройство Agilent 280/240 Series AA Systems (Agilent Technologies). Черният дроб ибъбрекпробите бяха анализирани в пламък ацетилен-въздух (Fa AAS), а кръвните проби чрез електротермична пулверизация (ETA AAS) при дължина на вълната 228,8 nm. Серия от калибриране с концентрации от 0–20 µg·L за анализи на ETA AAS и 0–10 mg·L1 за Fa AAS беше приготвена от стандартен разтвор на кадмий (Analytika Praha, Праг, Чехия), с концентрация 1.000 ± 0,002 g·L1. Това беше последвано от измерване на серийните разтвори за калибриране и изграждане на калибрационните криви, след което минерализацията на кръвта, черния дроб ибъбрекбяха измерени проби.

3.6. Статистически анализВсички измервания бяха извършени в три екземпляра. Извънредните стойности бяха идентифицирани с теста на Grubbs и изключени (бяха открити общо две извънредни стойности). Преди статистически анализ, данните бяха трансформирани чрез логаритмична трансформация и анализирани чрез еднопосочен ANOVA (всяка времева точка поотделно) с Tukey HSD post-hoc тест. Прагът за статистическа значимост беше определен като p <>

4. Изводи

Съществува неотдавнашна фармацевтична и икономическа тенденция да се търсят нови лекарства сред растителните вторични метаболити, които са вещества, които могат да помогнат за защита срещу редица заболявания. Благодарение на важните биологично активни компоненти, които лозовите семена съдържат в своята матрица, те могат да се използват (и вече се използват) за медицински цели. Известно е, че екстрактите от гроздови семена предпазват тъканите от увреждане, свързано с оксидативен стрес, причинено от токсичния тежък метал кадмий. Тази защита вероятно се влияе от фенолния състав на използваните гроздови семена. В това проучване екстракт от гроздови семена, приготвен от полуустойчивия сорт Cerason с доста високо фенолно съдържание, е тестван за защитни ефекти срещу промени, предизвикани от кадмий. Изследваният GSE е в състояние да повиши плазмената антиоксидантна активност, когато се прилага самостоятелно и да понижи съдържанието на кадмий в черния дроб ибъбрецина плъховете при съвместно приложение. Съответно, повишенията на чернодробния маркерен ензим ALT ибъбрекмаркерният креатинин, причинен от кадмий, се забавя от GSE. Освен това, намаляването на активността на антиоксидантните ензими SOD и CAT, причинено от кадмий, се забавя от съвместното приложение на GSE. Тези резултати показват, че GSE е мощен защитен агент срещу ефектите на тежките метали.