Екстравирусна ДНК в аденоасоциирани вирусни векторни препарати индуцира зависими от TLR9 вродени имунни отговори в човешки плазмоцитоидни дендритни клетки

Адено-асоциирани вирусни (AAV) векторни суспензии, произведени или в човешки HEK клетки, или в клетки на насекоми Spodoptera frugiperda (Sf9), се различават по отношение на остатъчните компоненти на клетката гостоприемник, както и специфичните за вида пост-транслационни модификации, показани на AAV капсидните протеини . Тук анализирахме въздействието на тези разлики върху имуногенните свойства на вектора. Стимулирахме човешки плазмоцитоидни дендритни клетки с различни партиди произведени от HEK клетки и Sf9 клетъчно произведени AAVCMV-eGFP вектори, получени от различни производители. Установихме, че AAV8-CMV-eGFP, както и AAV2-CMV-eGFP векторите индуцират специфични за партидата, но не специфични за производствената платформа или специфични за производителя възпалителни цитокинови отговори. Те могат да бъдат намалени или премахнати чрез блокиране на сигнализирането на подобен на такса рецептор 9 или чрез ензимно редуциране на ДНК във векторните партиди, използвайки ДНКаза. Успешна HEK клетъчна трансдукция чрез третирани с ДНКаза AAV партиди и ДНК анализи показват, че ДНКазата не повлиява целостта на вектора, но разгражда екстравирусната ДНК. Ние заключаваме, че както HEK-, така и Sf{21}}клетъчно получените AAV препарати могат да съдържат имуногенни екстравирусни ДНК компоненти, които могат да предизвикат специфични за партидата възпалителни имунни отговори. Това предполага, че подобрените стратегии за отстраняване на екстравирусни ДНК примеси могат да бъдат инструмент за намаляване на имуногенните свойства на AAV векторни препарати.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Последното десетилетие стана свидетел на огромен интерес към разработването на нови стратегии, базирани на рекомбинантен аденоасоцииран вирус (AAV), както за основни изследвания, така и за клинични приложения1–3. Основната причина се крие във факта, че AAV векторите са изключително гъвкави инструменти в областта на генната терапия, като се има предвид способността им да доставят ефективно и безопасно терапевтични гени до целевите тъкани4. Въпреки това, нарастващ брой изследователи независимо докладват констатации, предполагащи локален и системен имунен отговор след доставяне на AAV в предклинични и клинични проучвания 5–8.

Показано е, че AAV векторите активират вродени рецептори за разпознаване на имунни модели, като рецептор, подобен на такса (TLR)2 и TLR9, което води до освобождаване на възпалителни цитокини и интерферони тип I (IFN)9,10. Имуногенните компоненти на AAV, които могат да стимулират тези отговори, включват капсидни протеини и векторен геном 9, 10. Имунните отговори след прилагане на AAV също могат да бъдат предизвикани от примеси във векторната суспензия 5,11. Тези примеси са дефинирани като всеки компонент, присъстващ в суспензията на пречистения AAV вектор, различен от желания продукт12 и резултат от производствения процес на вектора. Два от основните методи за производство на клинични рекомбинантни AAV вектори включват трансфекция на плазмидна ДНК в HEK клетки и инфекция на клетки на насекоми Spodoptera frugiperda (Sf9) с баколувирус13. Съответно, потенциално имуногенни примеси, съдържащи се в AAV векторни суспензии, могат да включват ендотоксини, компоненти на среда за клетъчна култура, реагенти, които се използват за пречистване на AAV, протеини и ДНК, получени от гостоприемни клетки, и остатъчна бакуловирусна ДНК или плазмидна ДНК5. Допълнителни фактори, които биха могли да повлияят на имуногенността на AAV векторни суспензии, са пост-транслационни модификации (PTM), отпечатани върху капсида от различните платформи за производство на вектор5. Важно е, че AAV векторите, получени от HEK клетки и Sf9 клетки, се различават значително по отношение на техните PTMs, техните остатъчни протеинови примеси в клетката гостоприемник11 и потенциално също в техните ДНК примеси (HEK клетъчна ДНК срещу Sf9 клетъчна ДНК, както и остатъчна плазмидна ДНК срещу бакуловирусна ДНК)14. Плазмоцитоидните дендритни клетки (pCDs) са специализиран вроден имунен клетъчен тип, който секретира големи количества тип I IFN и провъзпалителни цитокини при вирусни инфекции9,15 и играят основна роля в усещането на AAV вектори9. Съответно, за да анализираме дали разликите между произведените от HEK клетки и Sf9-клетъчно произведените AAV вектори водят до разлики в техните имуногенни свойства, ние стимулирахме човешки pDCs с различни партиди от същия AAV вектор, получен от двете производствени системи и различни производители. Установихме, че половината от изследваните векторни партиди предизвикват специфични за партидата провъзпалителни имунни отговори, които не са свързани нито със системата за производство на вектор, нито с производителя. Тези отговори са медиирани от TLR9 сигнализиране и са податливи на третиране на векторните партиди с DNase. Успешна HEK клетъчна трансдукция както от нетретирани, така и от третирани с ДНКаза AAV векторни партиди и ДНК анализи на AAV препарати предполагат, че ДНКазата не повлиява целостта на AAV частиците, а по-скоро е насочена към некапсулирана екстравирусна ДНК. Взети заедно, това предполага, че AAV векторни препарати могат да съдържат некапсулирана екстравирусна ДНК, която може да повлияе на имуногенните свойства на AAV векторни препарати в човешки pDCs.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Резултати

AAV индуцира специфични за партидата вродени имунни отговори в човешки pDC.

Проучванията показват, че AAV векторите, получени от HEK клетки и Sf9 клетки, се различават по отношение на техните PTMs и примеси, съдържащи се във вирусните суспензии11. Ние предположихме, че тези фактори могат да доведат до разлики в имуногенните свойства между векторни партиди, получени от HEK клетки и Sf9 клетки. За да тестваме тази хипотеза, ние анализирахме общо осем векторни партиди от AAV серотип 8 (AAV8), съдържащи идентичната ДНК последователност на промотора на цитомегаловирус (CMV) и идентичния трансген за протеина с повишена зелена флуоресценция (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; пет HEK- и три Sf9 клетъчни партиди) и четири AAV2-CMV-eGFP партиди (две HEK- и две Sf9 клетъчни партиди) от три различни производителя [производител A; Viral Vector Core Facility на Университета на Айова (Айова, САЩ), производител B; Virovek (CA, USA) и производител C; Vigene Biosciences (MD, САЩ)]. За да се увеличат максимално сходствата между партидите, седемте AAV8 партиди от производител А и производител В (Таблица 1) бяха произведени с помощта на същия оригинален плазмид. Освен това, цифрова PCR регистрация на капчици (ddPCR) на векторните геноми (vg) на AAV векторните партиди беше извършена при паралелно измерване, използвайки две различни мишени: едната в последователността на CMV, а другата в последователността на eGFP на векторите. Резултатите, получени чрез количественото определяне на целта на CMV, бяха използвани за титруване на векторните партиди на AAV в следващите експерименти (Таблица 1). pDCs са специализирани вирусни сензори, които масово произвеждат тип I IFNs при вирусна инфекция15, включително AAV вектори9. За да изследваме дали продуцираните от HEK-клетки и Sf9-клетъчно произведените AAV вектори се различават по способността си да предизвикват вродени имунни отговори в имунокомпетентни клетки, ние стимулирахме човешки pDCs с изброените по-горе AAV векторни партиди. За тази цел, pDCs бяха пречистени от периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCs) на отделни здрави човешки донори чрез отрицателна селекция, използвайки магнитно активирано клетъчно сортиране (MACS). Анализът на поточната цитометрия потвърди чистотата на изолираните pDC от над 90% (фиг. S1). Десет, pDC на отделен донор бяха посяти и стимулирани с AAV8 и AAV2 векторни партиди при MOI от 1:1 × 106 vg/клетка за 18 часа. MOI от 1:106 vg/клетка, приложен към общо 12 500 клетки в 50 ul/ямка, се превръща в титър от 2,5 × 1011 vg/ml. Използвахме този титър, тъй като той е в обхвата на това, което се прилага в проучвания за генна терапия на ретината при хора (напр. 1 × 1012 vg/ml16 или 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) и нечовекоподобни примати (напр. 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). Стимулирането с превозното средство служи като контрола. Инкубирането с AAV8 и AAV2 векторни партиди не доведе до откриваема трансгенна експресия в pDCs. Въпреки това четири от осемте партиди AAV8 (партиди A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) и две от четири партиди AAV2 (партиди B-Sf9-1, B-Sf9-2) индуцират реактивна клетъчна пролиферация в стимулираните pDCs (фиг. 1а). Това беше придружено от освобождаване на провъзпалителни цитокини (IP-10, MIP-1 и TNF-) и тип I IFN (IFN-). Обратно, нито клетъчна пролиферация, нито освобождаване на цитокини са индуцирани от оставащия AAV8 (партиди A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) и партиди AAV2 (партиди C-HEK-1, C-HEK-2). Тези резултати бяха потвърдени в три до четири независими експеримента, всеки извършен с клетките на един отделен донор (Фиг. 1a-c и Таблица S1). Специфичните за партидата разлики в концентрациите на цитокини в тези независими експерименти бяха статистически анализирани с помощта на модел на линеен смесен ефект и пост-хок тест на Дънет (Q=2.6) чрез сравняване на средните стойности на най-малките квадрати на различните векторни партиди AAV с управлението на превозното средство (таблици S2 и S3). Това демонстрира статистически значими разлики в цитокиновите отговори между "имуногенни" AAV векторни партиди (AAV8 партиди A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} или AAV2 партиди B-Sf9-1, B-Sf9-2 съответно) и контрола, но без значителни разлики между "неимуногенни" партиди AAV вектор (AAV8 партиди A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 или AAV2 партиди C-HEK-1, C-HEK-2 съответно) и контрол (Таблица S3). Концентрациите на останалите измерени цитокини, включени в мултиплексния анализ, са под диапазона на анализа (т.е. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) или нито „имуногенните“, нито "неимуногенните" векторни партиди индуцират значителни увеличения на тяхното освобождаване (т.е. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (фиг. S2), което предполага степен на специфичност в AAV-медиирания цитокинов отговор. За да се изследват цитокиновите отговори в по-ранна времева точка, pDC бяха стимулирани с "имуногенния" AAV8 вектор партида A-HEK-1. Наблюдавахме значително повишаване на концентрацията на TNF- в супернатантата още на 2 часа след pDC стимулация. Този модел на реакция може да бъде потвърден в три експеримента, всеки извършен с клетките на един отделен донор (фиг. S3). За да изследваме дали по-висока доза от "неимуногенна" векторна партида AAV8 е в състояние да предизвика имунен отговор, ние стимулирахме pDCs с технически максимално приложимия MOI (1: 4.61 × 106 vg). Интересно е, че нито реактивна клетъчна пролиферация, нито цитокинови отговори са открити при стимулация с този повишен титър (фиг. S4). Противно на нашата хипотеза, тези резултати показват, че вродените имунни отговори към AAV в pDCs са специфични за партидата и не са свързани със специфична производствена система или метод на производител/пречистване.

Таблица 1. Различни партиди AAV8 и AAV2 вирусни вектори, използвани в това изследване.

Фигура 1. Индуциране на AAV вектор, специфични за партидата имунни отговори в човешки pDCs. Човешки pDC бяха стимулирани с различни партиди AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1 × 106 vg) за 18 часа (a) Представителни изображения в светло поле на pDCs, стимулирани с контролен носител (горно изображение) или партида имуногенен AAV вектор (долно изображение). Лентата на скалата е 100 μm. (b) Освобождаване на цитокини на IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 от AAV8-стимулирани pDCs. (C) Освобождаване на цитокини от AAV2-стимулирани pDCs. Представителни графики на един от три до четири независими експеримента. Тъй като при измерванията на IFN- 2 (b,c) и измерването на TNF (c) някои стойности паднаха под обхвата на анализа, константата 1 беше добавена към всички измерени стойности на IFN- 2 и TNF- за представяне в полулогаритмична графика. Показани са медиани и интерквартилни диапазони. В етикетите на отделните векторни партиди трите производителя са представени с буквите A, B и C; Векторите, получени от HEK-клетки и Sf9-клетки, са обозначени с "HEK и "Sf9" и съответните партиди от същия производител и същата производствена система са номерирани с "1, 2, 3". Оградете в кръг: Произведени от HEK векторна партида; триъгълник: Sf9-изведена векторна партида; черно: векторна партида от производител A; оранжево: векторна партида от производител B; зелено: векторна партида от производител C.

Имунният отговор към AAV стимулация в pDCs не се влияе от разликите в съотношението капсид/VG.

Предклиничните проучвания показват, че разликите в броя на пълните и празните векторни частици в AAV векторни суспензии могат да повлияят на имунния отговор18. За да се оцени дали разликите в имуногенните свойства между анализираните векторни партиди се дължат на разлики в съотношението на пълни и празни векторни частици, ние определихме титъра на векторните капсиди във всички AAV партиди чрез AAV титруване ELISA и изчислихме капсид/VG съотношение. Интересното е, че са открити големи разлики в съотношението капсид/vg между всички AAV партиди (фиг. 2). Приблизително два пъти повече капсиди от vg (2:1) бяха открити в AAV8-CMV-eGFP партиди A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } и AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; и четири пъти повече (4:1) в AAV8 партида A-Sf9-1. В останалите партиди се наблюдава съотношение 1:1. Въпреки това, не са открити значителни разлики между съотношенията капсид/vg на "имуногенни" и "неимуногенни" AAV векторни партиди в AAV8 (P=0.27), нито в AAV2 (P=0.37) векторни партиди (фиг. 2). Това предполага, че разликите в имуногенните свойства на анализираните AAV векторни партиди също не са свързани с разликите в съотношението на пълни и празни векторни частици.

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Разпознаване на "имуногенни" AAV8 векторни партиди от TLR9.

Доказано е, че вроденото имунно разпознаване на AAV от миши и човешки pDCs се медиира от ДНК чувствителен TLR99. Съответно, ние оценихме дали TLR9 също участва в разпознаването на нашите "имуногенни" AAV8 векторни партиди. За тази цел pDCs се посяват, както е описано, и се култивират с TLR9 антагониста H154 (50 µM), последвано от стимулация с "имуногенните" AAV8 векторни партиди A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 и A-Sf9-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). След 18 часа не са наблюдавани доказателства за клетъчна пролиферация (Фиг. 3а) и е измерено значително намаляване на освобождаването на IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- (Фиг. 3б). Това показва, че имунните отговори към "имуногенни" AAV8 векторни партиди в човешки pDCs се медиират от TLR9 сигнализирането.

Фигура 2. Сравнение на съотношенията капсид/vg между различни AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP векторни партиди. Съотношенията капсид/vg се получават от измервания на абсорбцията (ELISA) и резултати от ddPCR на (a) осем AAV8 векторни партиди и (b) четири AAV2 векторни партиди. Прекъснатите линии разделят "имуногенните" от "неимуногенните" AAV векторни партиди. Стълбчетата показват средните стойности и стандартните отклонения на репликите. Статистическата значимост се определя с помощта на несдвоен t-тест на Student.

Фигура 3. Разпознаването на "имуногенни" AAV8-CMV-eGFP векторни партиди от pDCs зависи от TLR9. Човешките pDC бяха третирани с TLR9 антагониста H154 (50 μM), последвано от стимулация с "имуногенни" AAV8 векторни партиди (MOI: 1:1 × 106 vg) в продължение на 18 часа. ( а ) Представителни изображения в ярко поле на пречистени pDCs, третирани с "имуногенни" AAV векторни партиди (горно изображение) или "имуногенни" AAV векторни партиди и H154 (долно изображение). Скалата е 100 μm. (b) Освобождаване на цитокини на IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 от стимулирани pDCs. Тъй като при измерванията на IFN- 2, някои стойности паднаха под обхвата на анализа, константата 1 беше добавена към всички измерени стойности на IFN- 2 за представяне в полулогаритмична диаграма. Показани са средните стойности и стандартните отклонения. Статистическата значимост се определя с помощта на еднопосочен ANOVA и post hoc анализ на Holm-Sidak. P стойности: По-малко или равно на 0,05: *; По-малко или равно на 0,01: **; По-малко или равно на 0,001: ***.

Лечението с ДНКаза намалява имунните отговори на "имуногенни" векторни партиди AAV8 и AAV2.

Докато "имуногенните" AAV8 вектори предизвикаха TLR9-зависим имунен отговор в pDCs, не бяха индуцирани такива отговори от "неимуногенните" партиди. TLR9 се активира в отговор на ДНК, по-специално ДНК, съдържаща неметилирани CpG мотиви9. Важно е, че нашите ddPCR измервания потвърдиха, че едни и същи компоненти на вирусна ДНК присъстват както в "имуногенни", така и в "неимуногенни" векторни партиди. Взети заедно, това предполага, че неопакованата/свободна ДНК във вирусната суспензия, а не интравирусната ДНК може да бъде причинителят на наблюдаваните имунни отговори към "имуногенни" векторни партиди на AAV. Следователно, ако остатъчната свободна ДНК присъства във вирусната суспензия на "имуногенните" векторни партиди AAV8, вроденият имунен отговор трябва да бъде отслабен от DNase. За да се тества тази хипотеза, "имуногенни" AAV8 и AAV2 векторни партиди бяха предварително третирани с DNase I (100 ug/ml) за 30 минути преди AAV стимулация. За да се изключат неспецифични ефекти от лечението с DNase върху pDCs или AAV частиците, при стимулациите само с AAV, векторите бяха подложени на третиране с DNasemock преди стимулиране на pDC. При тези фалшиви лечения без ДНКаза, AAV частиците се инкубират при 37 градуса в идентична среда за смилане на ДНКаза за същия период от време като третираните с ДНКаза AAVs. Десет, pDCs бяха посяти и стимулирани с DNase предварително третирани или фалшиво третирани "имуногенни" AAV векторни партиди (MOI: 1:1 × 106 vg). pDCs, които са инкубирани само с DNase или фиктивно третирани с носител, служат като контроли. Интересното е, че лечението с ДНКаза на "имуногенните" AAV8 и AAV2 векторни партиди намалява реактивната клетъчна пролиферация (фиг. 4а) и или напълно премахва (AAV8 партиди A-HEK-2 и A-Sf9-1; AAV2 партиди B-Sf9-1 и B-Sf9-2) или значително намалено (AAV8 партиди A-HEK-1 и A-HEK-3) освобождаването на IP{{40} }, MIP-1, TNF- и IFN- след AAV стимулация (фиг. 4b,c). За да потвърдим, че наблюдаваният ДНКазен ефект всъщност е причинен от смилането на екстравирусна ДНК, а не от ефекта на ДНКазата върху целостта на вектора, ние изследвахме дали лечението с ДНКаза на AAV векторни партиди е повлияло на трансдукционния капацитет на AAV. Тъй като приложението на AAV не доведе до откриваема pDC трансдукция, HEK клетките бяха използвани за тези анализи, тъй като HEK клетките са добре известен клетъчен модел за анализиране на ефективността на трансдукция при AAV трансдукция19. Стимулирахме HEK293T клетки с третирани с ДНКаза и фиктивно третирани AAV8 и AAV2 векторни партиди (MOI: 1: 8 × 104 vg) и оценихме ефективността на трансдукция чрез флуоресцентна микроскопия 3 дни след приложението на вектора. Както е описано, AAV2 векторите показват по-висока мощност на трансдукция в сравнение с AAV8 векторите. Нещо повече, важно е, че предварителното третиране с DNase нито намалява ефективността на трансдукция в получените от HEK, нито в получените от Sf9- клетки AAV8 и AAV2 векторни партиди (фиг. S5a, b). Тези резултати предоставят допълнително доказателство, че ефектът на DNase върху имуногенните свойства на векторните партиди се дължи на разграждането на екстравирусната ДНК. Въпреки че TLR9 антагонистът H154 по същество премахва освобождаването на провъзпалителни цитокини за всичките четири имуногенни AAV8 партиди (фиг. 3), предварителното третиране с ДНКаза може също така да елиминира провъзпалителния цитокинов отговор за AAV8 партидите A-HEK{{75} } и A-Sf9-1, докато не го премахна напълно за AAV8 партиди A-HEK-1 и A-HEK-3 (фиг. 4). За да проверим дали увеличеното време за лечение с ДНКаза може да отмени този цитокинов отговор, повторихме симулационните експерименти на pDCs след десетократно увеличение на времето за инкубация на ДНКаза на съответните партиди (A-HEK-1 и A-HEK{{87} }). Ние наблюдавахме, че след третиране с ДНКаза на векторите в продължение на 5 часа, средните концентрации на цитокини в супернатанта на AAV-стимулираните клетки допълнително намаляват, като вече не се различават значително от тези на контрола на носителя. Този модел на реакция може да бъде потвърден в три експеримента, всеки извършен с клетките на един отделен донор (фиг. S6). Това предполага, че централната причина за зависимия от TLR9-провъзпалителен имунен отговор в pDC е наистина екстравирусна ДНК. За да тестваме дали освобождаването на интравирусна ДНК повишава имуностимулиращата активност на AAV векторите, ние съзнателно отворихме вирусните капсиди на "имуногенния" AAV8 партид A-HEK-1 чрез термична обработка при 95 градуса за 10 минути . Термично обработената векторна партида след това се използва за стимулиране на pDCs. Въпреки че няма разлики в реактивната клетъчна пролиферация при AAV8 партида A-HEK-1 стимулация с и без термична обработка, има значително увеличение на освобождаването на IP-10, MIP-1 , TNF- и IFN- в състояние на нагряване, което показва, че освобождаването на капсулирана вирусна ДНК във векторната суспензия може да допринесе за индуцирането на имунни отговори (фиг. 5). Заедно тези данни показват, че AAV векторните препарати могат да съдържат екстравирусни ДНК замърсители, които могат да предизвикат специфични за партидата имунни отговори в pDCs. Тези отговори се медиират от TLR9 сигнализиране и могат да бъдат намалени/премахнати чрез третиране на векторните партиди с DNase.

Фигура 4. Предварителното третиране с ДНКаза намалява имунните отговори, индуцирани от „имуногенни“ векторни партиди AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP. Човешки pDC бяха стимулирани с третирани с ДНКаза "имуногенни" AAV8 векторни партиди за 18 часа (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Представителни ярки полеви изображения на пречистени pDCs, стимулирани с "имуногенни" AAV векторни партиди (горно изображение) и "имуногенни" AAV векторни партиди, предварително третирани с 1{{30}}0 ug/ml ДНКаза I (долното изображение). Лентата на скалата е 500 μm. (b) Освобождаване на цитокини на IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 от AAV8-стимулирани pDCs. (c) Освобождаване на цитокини от AAV2-стимулирани pDCs. Тъй като при измерванията на IFN- 2 (b и c) и измерването на TNF (b), някои стойности паднаха под обхвата на анализа, константата 1 беше добавена към всички измерени стойности на IFN- 2 и TNF- за представяне в полулогаритмичен график. Показани са средните стойности и стандартните отклонения. Статистическата значимост беше определена с помощта на еднопосочен ANOVA и post hoc анализ на Holm–Sidak. P стойности: По-малко или равно на 0,05: *; По-малко или равно на 0,01: **; По-малко или равно на 0,001: ***.

Проучвателен анализ на екстравирусни ДНК замърсители в AAV8 векторни препарати.

За извършване на първата проучвателна характеристика на екстравирусните ДНК компоненти в векторните партиди на AAV, представителен „имуногенен“ (A-HEK-1) и „неимуногенен“ (B-HEK-1) Анализирани са векторни партиди, получени от HEK клетки. Тези партиди бяха или третирани с ДНКаза в pDC среда в продължение на 30 минути при 37 градуса, както е описано по-горе, или бяха фалшиво третирани и ултрафилтрирани с помощта на 100 kDa филтриращо устройство, или бяха третирани само фалшиво (фиг. S7a– g). Последователното отделяне на биоанализатор LabChip и оценката на пречистената ДНК разкриха наличието на сравними количества векторна ДНК (фиг. S7b–g) в третирани и фалшиво третирани проби от всяка партида, потвърждавайки, че нито ултрафилтрацията, нито третирането с ДНКаза са повлияли съдържанието на ДНК вътре в капсида. Освен това, той показа, че само „имуногенната“ (Фиг. S7a–d), но не и „неимуногенната“ векторна партида (Фиг. S7a, e–g) съдържа допълнителни ДНК молекули с размери от 100 до 450 bp (Фиг. S7c,d и h). Важно е, че тези допълнителни ДНК молекули могат да бъдат открити в фалшиво третираната проба и ултрафилтрираната проба, но на практика отсъстваха в третираната с ДНКаза проба (фиг. S7a-d). Това показва, че тези ДНК молекули представляват екстравирусни ДНК замърсители, които могат да бъдат разградени от ДНКаза, но не могат да бъдат отстранени от векторната суспензия чрез ултрафилтрация. Финансирането, че тези замърсители могат да бъдат открити само в "имуногенната", но не и в "неимуногенната" векторна партида, доказва, че появата на тези екстравирусни ДНК молекули е специфична за партидата и може допълнително да предполага, че тези молекули индуцират или допринасят към имуностимулиращите свойства на вектора. За оценка на потенциалния източник на замърсяващата ДНК в „имуногенните“ (A-HEK-1) и „неимуногенните“ (B-HEK-1) партиди от количествен (q)PCR анализ на HEK клетъчна ДНК, плазмидна ДНК и AAV векторна ДНК. Шаблонна ДНК от третирани с ДНКаза, фалшиво третирани и ултрафилтрирани и само фалшиво третирани проби от всяка партида беше използвана за амплификация на Alu повторение, мултикопие на NPIP ген на ядрения геном и митохондриални 16S rRNA генни последователности (mt16S) от HEK клетъчен произход , за амплификация на AAV8 инвертиран краен повторен ампликон (ITR2; произход на вектор и трансгенна плазмидна ДНК) и за амплификация на ампликон за blah (резистентност към ампицилин) ген (Amp; произход на плазмидна ДНК) (Таблица S4). Сравнение на съотношенията на ΔCt стойностите на HEK клетъчен ДНК-специфичен ампликон спрямо ITR2 ампликона (т.е. Alu срещу ITR2, NPIP спрямо ITR2 и mt16S спрямо ITR2) и плазмидния ДНК-специфичен ампликон спрямо ITR2 ампликона (Amp спрямо ITR2), съответно показва, че двете партиди съдържат незначителни количества HEK клетъчна ядрена и митохондриална ДНК. За разлика от това, анализът разкри прилично количество плазмидна ДНК както в "имуногенната", така и в "неимуногенната" векторна партида (около 1/32 и 1/50, съответно, по отношение на броя на копията спрямо AAV ДНК), съотношение, което е в обхвата на стойностите, докладвани за други AAV вектори12 (фиг. S7). Независимо от това, няма очевидни разлики в относителното съотношение на векторна ДНК към плазмидна и HEK клетъчна ДНК между третирани с ДНКаза и фалшиво третирани или ултрафилтрирани и фалшиво третирани проби от двата векторни партиди (фиг. S8). Това може да предполага, че неопакованата замърсителна ДНК е подобна по състав на целевата последователност на тази на пакетираната ДНК. Въпреки това, ограничение на qPCR анализа е размерът на замърсената ДНК (100–450 bp), която ще съдържа прилична част от фрагменти с непълна целева последователност.

Фигура 5. Освобождаването на интравирусна ДНК чрез термична обработка на вектори усилва провъзпалителните цитокинови отговори в pDCs. Освобождаване на цитокини на IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 от pDCs 18 часа след стимулация с топлинно обработен AAV8 lot A-HEK-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Хоризонталните линии показват средни стойности и стандартни отклонения. Статистически значими разлики между цитокиновите отговори, индуцирани от топлинно третирани и нетретирани вектори, се определят чрез използване на t-теста на Student. P стойност: По-малко или равно на 0.01: **; По-малко или равно на 0,001: ***.

Дискусия

AAV векторите са един от най-обещаващите инструменти в генната терапия. Въпреки това, натрупването на доказателства оспорва мнението, че имуногенността на AAV е незначителна5. В светлината на това става все по-важно да се разберат по-добре механизмите, чрез които възникват имунните отговори на AAV. В това проучване ние демонстрираме, че (1) AAV8 и AAV2 индуцират специфични за партидата вродени имунни отговори в човешки pDC, които не са специфични нито за съотношението капсид/vg, нито за производствената платформа, нито за производителя/метода на пречистване; (2) вродените имунни отговори в pDCs зависят от сигнализирането на TLR9 и могат да бъдат намалени чрез предварително третиране с DNase; (3) Лечението с ДНКаза не засяга целостта на векторната частица, тъй като не намалява скоростта на трансдукция на AAV8 и AAV2 векторни партиди в HEK293T клетки; и (4) AAV векторни партиди могат да съдържат екстравирусни ДНК молекули, които могат да бъдат отстранени чрез третиране на векторната партида с ДНКаза. Това предполага, че както HEK-, така и Sf{15}}клетъчно получените AAV препарати могат да съдържат екстравирусни ДНК примеси, които стимулират вроден имунен отговор. В скорошно проучване беше извършен сравнителен анализ с помощта на AAV вектори от различни видове клетки гостоприемници (HEK клетки и Sf9 клетки)11. Авторите установиха, че векторите, получени от HEK- и Sf9-, се различават по отношение на техните PTMs и техните остатъчни протеинови примеси в клетката гостоприемник във всички тествани от тях AAV серотипове и производители. Освен това, те анализираха цитокиновия отговор на първичните човешки фибробласти към AAV трансдукция и откриха, че HEK- и Sf9-получените вектори може да се различават по своите имуногенни свойства. В нашето проучване ние също сравнихме тези две основни производствени системи, използвайки различни партиди от една и съща AAV конструкция от различни производители и два различни серотипа. Въпреки това, векторно-индуцираните имунни отговори, които наблюдавахме в нашия човешки pDC модел, не бяха специфично свързани с дадена производствена система, производител или серотип, вместо това те бяха специфични за партидата. Предишни предклинични и клинични проучвания на генна терапия на ретината съобщават, че имунните отговори към AAV вектори, като очно възпаление или инфилтрация на имунни клетки, могат да бъдат повлияни от разликите в съотношенията капсид/vg18 или разликите в дозите5. Timmers et al.18 показаха, че премахването на празни AAV капсиди от вирусната суспензия намалява възпалението и подобрява вирусната трансдукция в предклинично проучване с нечовекоподобни примати. И все пак нашите резултати показаха, че повишени съотношения капсид/vg са налице както сред „имуногенните“, така и сред „неимуногенните“ векторни партиди на AAV, което означава, че по-голям брой капсиди (празни капсиди) във вирусната суспензия не е отговорен за индуцирането на специфичните за партидата на вектора имунни отговори в нашия човешки pDC модел. Освен това, преди това показахме, че AAV8 индуцира имунни отговори по дозозависим начин при нечовекоподобни примати 6, 8. Въпреки това, увеличаването на дозата на "неимуногенните" AAV вектори в това проучване не е достатъчно, за да предизвика имунен отговор в човешки pDC. Следователно, за да разберем причината за разликите в имуногенните свойства на векторите, ние изследвахме механизма, включен в разпознаването на "имуногенните" AAV партиди. Използването на in vitro имунокомпетентни клетъчни модели позволи на учените да проучат по-точно ролята на TLR пътищата във вродените имунни отговори, генерирани от AAV вектори 9, 10. Zhu et al.9първо описват, че pDCs, но не конвенционалните DCs или не-pDCs, освобождават големи количества тип I IFN и провъзпалителни цитокини в отговор на AAV стимулация и демонстрират участието на TLR9 пътя в разпознаването на AAV8 и AAV2 с помощта на мишки pDC. Авторите също така наблюдават, че AAV2 индуцира TLR9-зависими имунни отговори в човешки pDC. В нашето изследване, с използването на един от най-специфичните TLR9 антагонисти, H1549,21–24, ние индиректно показахме, че не само AAV2, но също и AAV8 вектори индуцират TLR9-зависими вродени имунни отговори в човешки pDCs, но по много специфичен начин. Тъй като TLR9 е ДНК рецептор, това предполага, че имунните отговори към "имуногенни" AAV векторни партиди са индуцирани от ДНК компоненти. Въпреки това, въпреки че нашите ddPCR измервания са потвърдили, че едни и същи опаковани ДНК компоненти присъстват както в "имуногенни", така и в "неимуногенни" векторни партиди, "неимуногенните" партиди не предизвикват имунни отговори в pDCs. В допълнение, лечението с ДНКаза или намалява, или премахва имуностимулаторните свойства на "имуногенните" векторни партиди на AAV, но не намалява ефикасността на трансдукция на тези вектори в HEK клетки, което предполага, че лечението с ДНКаза на AAV е насочено към некапсулирана екстравирусна ДНК в векторна суспензия, но не повлиява целостта на векторния геном в непокътнатия капсид. Това беше допълнително потвърдено чрез сравнителни ДНК анализи на представителни третирани с ДНКаза и фалшиво третирани "имуногенни" и "неимуногенни" векторни партиди.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Взети заедно, всички тези експерименти показват, че имунният отговор към "имуногенни" векторни партиди в pDCs не е бил организиран от ДНК, съдържаща се в AAV частиците (т.е. векторен геном или потенциални ДНК примеси, опаковани в AAV капсидите), а от достъпна екстравирусна ДНК компоненти, съдържащи се във вирусните суспензии (т.е. ДНК извън или незащитена от вирусния капсид). Ние също така наблюдавахме, че когато ДНК, съдържаща се във вирусните капсиди на "имуногенна" векторна партида, беше изложена на клетките чрез термична обработка на вектора, имаше повишаване на имунния отговор. Не е ясно дали повишаването на имуностимулиращата активност след отваряне на капсидите се дължи на едноверижната ДНК на вектора или се дължи на потенциални примеси, опаковани в AAV капсидите, като остатъчни нуклеинови киселини на гостоприемни клетки, остатъчни хелперни ДНК последователности, последователност на гръбнака фрагменти, опаковани заедно с касетата или обратно праймиране от ITR, което води до малки гръбначни фрагменти, опаковани в AAV12,25. Точният механизъм на екстравирусно усвояване на ДНК от pDCs остава неизвестен. Отзивчивостта на pDCs към CpG олигонуклеотиди показва, че pDCs могат да реагират на свободна ДНК26. Това предполага, че имунният отговор в pDC може да бъде предизвикан от поглъщането на свободна замърсяваща ДНК, съдържаща се във векторната суспензия. Освен това е показано, че pDCs могат да поемат AAV вектори27 алтернативно, което предполага, че потенциална свързана с капсид ДНК може да бъде транспортирана в клетката по време на поглъщането на AAV частици. Наличието на екстравирусно ДНК замърсяване в AAV векторни препарати може или да бъде присъщо свойство на съответната векторна партида, произтичащо от процеса на производство и пречистване на векторите, или може да се дължи на освобождаването на капсулирана ДНК поради неподходящи условия на съхранение . Всички векторни партиди, изследвани в тези експерименти, са получени през същия период от време (5 от 8-те изследвани векторни партиди AAV8, от които две са "имуногенни" (A-HEK-2; A-HEK-3) и три бяха „неимуногенни“ (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) дори бяха произведени паралелно специално за това проучване), партидите от всеки производител беше изпратен в едни и същи транспортни кутии и при получаване всички партиди бяха съхранявани една до друга в едно и също чекмедже на защитен с аларма температура -80 градуса фризер, преди аликвотни части от всички партиди да бъдат размразени едновременно и приложени към pDCs в експерименти един до друг. Това силно предполага, че процесът на производство и пречистване на AAV, а не неподходящото съхранение, е отговорен за разликите в съдържанието на екстравирусна ДНК и имуностимулиращите свойства на тези партиди. В миналото векторните партиди на AAV с клинична степен, произведени за генна терапия (alipogene tiparvovec, Glybera), вече не бяха разрешени поради големи количества примеси, включително потенциално имуногенна остатъчна ДНК на клетка гостоприемник28. Отстраняването на ДНК примеси от вирусните суспензии обикновено се извършва по време на производствения процес. Тук рутинно се прилага третиране с Benzonase29 или DNase30, за да се елиминира остатъчната ДНК от крайната вирусна суспензия. Това третиране, в зависимост от протокола, продължава между 30 минути и 3 часа и след това ензимът се инактивира от химикали като соли на цезиев хлорид30. В нашите експерименти четири от петте AAV8 партиди, получени от Viral Vector Core Facility на Университета на Айова, и двете AAV2 векторни партиди от Virovek бяха открити като имуногенни в pDCs. Както е описано в раздела "Материали и методи", процесът на пречистване на векторните партиди и от двата производителя включва няколко стъпки на пречистване, някои от които се различават значително една от друга. По този начин процесът на пречистване в Core Facility в Айова включва обработка с турбонуклеаза, последвана от ултрацентрофугиране с градиент на йодиксанол, колонна хроматография с анионен обмен, флатерна стерилизация и обмен на буфер с използване на центробежни филтри. За разлика от тях Virovek прилага третиране с бензоназа, ултрацентрофугиране в CsCl, последвано от обезсоляване и филтърна стерилизация. Процесът на пречистване на Vigene, от друга страна, не включва обработка с ДНКаза, но, както се използва от Core Facility в Айова, включва градиентно ултрацентрофугиране с йодиксанол. Изненадващо обаче нито една от трите векторни партиди, получени от Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 и 2), не индуцира имунни отговори в pDC, което предполага, че „неимуногенни " векторни партиди също могат да бъдат генерирани с производствени процеси, които не включват третиране с ДНКаза.

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Като цяло, отчасти сходните и отчасти различни стъпки на пречистване, използвани от тримата производители, затрудняват свързването на имуногенните свойства на векторите, наблюдавани в pDC, с една стъпка в производствения процес. Клиничните изпитвания използват вектори с клас на добра производствена практика (GMP), които са подложени на строг контрол на качеството. Нито един от векторите от тримата производители, използвани в това проучване, не е с клас на добра лабораторна практика (GLP) и следователно може да бъде с по-ниска чистота от векторите с клиничен клас. По този начин е важно да се признае, че GMP векторите, използвани в клинични изпитвания при хора, могат или не могат да проявят разликите, които наблюдавахме в настоящото изследване, и че уместността на нашите открития за клиничната употреба на генни терапии не е ясна. Въпреки това, според нашия собствен опит, значителни специфични за партидата разлики в концентрацията на замърсяващи компоненти, като например протеини на клетка гостоприемник, могат да възникнат дори при вектори с GMP клас и дори при вектори с GMP клас няма еднакво договорени спецификации за това какви нива са приемливо5. Като цяло, подобряването на производствения процес на AAV вектори е от ключово значение за избягване на наличието на остатъчни примеси във вирусните суспензии, за да се сведе до минимум потенциалът за нежелани имунни отговори. В заключение, ние демонстрирахме, че екстравирусните ДНК примеси могат да повлияят на имуногенните свойства на AAV вектори в човешки pDCs. Необходими са допълнителни проучвания, за да се изследват последиците от тези констатации за безопасността на AAV-медиираната генна терапия при животински модели или хора.

Препратки

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Геномно инженерство с помощта на адено-асоцииран вирус: приложения за основни и клинични изследвания. Mol. тер. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. AAV-медиирано доставяне на ген до 3D органоиди на ретината, получени от човешки индуцирани плурипотентни стволови клетки. Вътр. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Ефикасност и безопасност на voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) при пациенти с RPE65-медиирана наследствена дистрофия на ретината: рандомизирано, контролирано, отворено, фаза 3 изпитване. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Развиване на AAV-доставени терапевтични средства към крайни изцеления. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Имунни отговори към генна терапия на ретината с използване на адено-асоциирани вирусни вектори – Последици за успеха и безопасността на лечението. Прог. ретина. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. AAV8 може да индуцира вродени и адаптивни имунни отговори в окото на приматите. Mol. тер. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Намалена трансдукция на ретината и повишена трансгенно насочена имуногенност с интравитреално доставяне на rAAV след задна витректомия при кучета. Джийн Тер. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Надлъжна оценка на хиперрефлективни фокуси в ретината след субретинално доставяне на адено-асоцииран вирус при нечовекоподобни примати. Превод Vis. Sci. техн. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88 пътят е критичен за адаптивните имунни отговори към вектори за генна терапия на аденоасоциирани вируси при мишки. J. Clin. разследване. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Toll-подобен рецептор 2-медииран вроден имунен отговор в човешки непаренхимни чернодробни клетки към адено-свързани вирусни вектори. Хепатология 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG и др. Методите имат значение: Стандартните производствени платформи за рекомбинантен AAV произвеждат химически и функционално различни вектори. Mol. тер. Методи Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Свързани с продукта примеси в рекомбинантни AAV вектори с клиничен клас: Характеризиране и оценка на риска. Биомедицина 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Производство на рекомбинантни адено-асоциирани вирусни вектори за клинични изпитвания. Mol. тер. Методи Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Фармакология на производството на рекомбинантен адено-асоцииран вирус. Mol. тер. Методи Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Плазмоцитоидна дендритна клетъчна биология и нейната роля при имуномедиирани заболявания. Clin. Превод Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Ефикасност и безопасност на генната терапия на ретината, използваща адено-асоцииран вирусен вектор за пациенти с хороидеремия: рандомизирано клинично изпитване. JAMA Офталмол. 137, 1247–1254 (2019).

17. Велебер, Р. Г. и др. Резултати 2 години след генна терапия за вродена амавроза на Leber с дефицит на RPE65- и тежка дистрофия на ретината в ранна детска възраст. Офталмология 123, 1606–1620 (2016).

18. Timers, AM et al. Очен възпалителен отговор на интравитреално инжектиране на адено-асоцииран вирусен вектор: Относителен принос на генома и капсида. тананикам Джийн Тер. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et al. Сайт-насочената мутагенеза подобрява ефективността на трансдукция на рекомбинантни AAV вектори, получени от капсидна библиотека. Mol. тер. Методи Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et al. Проучване на ефикасността на трансдукция ex vivo/in vitro на първични клетки и клетъчни линии на бозайници с девет естествени адено-асоциирани вируса (AAV1-9) и един конструиран адено-асоцииран вирусен серотип. Virol. Й. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Ефект на супресивна ДНК върху CpG-индуцирано имунно активиране. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Антагонистът на Toll-подобен рецептор 9 потиска хуморалния имунитет при експериментална автоимунна миастения гравис. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK и др. Създаване на адено-асоциирани вирусни вектори за избягване на вродени имунни и възпалителни реакции. Sci. Превод Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Структура, механизъм и терапевтична полезност на имуносупресивни олигонуклеотиди. Pharmacol. Рез. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. AAV препаратите съдържат замърсяване от ДНК последователности в производствените плазмиди директно извън ITR. Mol. тер. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. et al. TLR9 сигнализира след транслокация от ER към CpG ДНК в лизозомата. Нац. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Основните подгрупи от човешки дендритни клетки се трансдуцират ефективно от самодопълващи се адено-асоциирани вирусни вектори 1 и 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Доклад за оценка: Глибера. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Достъп на 03 март 2022 г. (2012 г.)

29. Arden, E. & Metzger, J. Евтин, независим от серотип протокол за нативно и биоинженерно пречистване на рекомбинантен адено-асоцииран вирус. J. Biol. Методи 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Производство и характеризиране на адено-асоциирани вирусни вектори. Нац. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Производство на аденоасоциирани вирусни вектори за in vitro и in vivo приложения. Sci. Справка 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Високата чистота на AAV вектор води до независимо от серотипа и тъканта повишаване на ефективността на трансдукция. Джийн Тер. 17, 503–510 (2010).