Фарнезилтрансферазният инхибитор LNK-754 отслабва аксоналната дистрофия и намалява амилоидната патология при мишки, част 2

Живо изображение на неврони

За експерименти с изображения на живо, невроните се приготвят както по-горе и се поставят в 35 mm стъклени дънни съдове (MatTek # P35G-1.5-14C) за 7 дни в култура. 10nM LNK-754 или лонафарниб след това се добавя към кондиционирана среда, контролните култури се третират с DMSO като носител. След 48 часа третиране, средата беше заменена с кондиционирана среда от нетретирани паралелни плочи от неврони. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) се добавя към кондиционираната среда и невроните се инкубират за 30 минути при 37 градуса.

Невроните са важна част от нервната система, способни да приемат, обработват и предават информация и са материалната основа на човешкия интелект и поведение. Имунитетът е важна гаранция за човешкото тяло да устои на болестта. Той може да идентифицира и унищожи патогени и анормални клетки и да поддържа здравето на тялото.

Изследванията показват, че има силна връзка между невроните и имунната система. Невроните могат да повлияят на имунната система чрез освобождаване на различни невротрансмитери, като норепинефрин, епинефрин и др. Тези невротрансмитери могат да променят активността на имунните клетки, да подобрят пролиферацията и функцията на имунните клетки и да подобрят имунитета на организма. В същото време имунната система може също да повлияе на функцията на невроните чрез различни пътища. Имунните клетки могат да секретират различни цитокини и хормони, влияещи върху растежа, развитието и функцията на невроните чрез имунни пътища.

В допълнение, психологически и социални фактори могат да повлияят на имунитета и невронната функция. Отрицателните емоции като стрес, безпокойство и депресия могат да повлияят неблагоприятно на имунната система и невроните, намалявайки имунитета на организма. Положителните емоции, положителните социални взаимоотношения и здравословният начин на живот могат да насърчат здравословното развитие на имунитета и невроните.

За да обобщим, съществува интерактивна и взаимно поддържаща се връзка между невроните и имунитета. Поддържането на психично здраве, положителното посрещане на живота и възприемането на добри навици на живот могат да насърчат имунитета на тялото и здравословното развитие на невроните. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. Освен това месото може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Изобразяването на неврони с изтичане на времето беше извършено с помощта на Ti2 микроскоп с широко поле. Изобразяването започва веднага след 30 минути и продължава не повече от 30 минути. 1-s експозиции бяха правени всяка минута и 20–30 отделни области на чиния бяха изобразени в рамките на 30 минути. Количественото определяне на разстоянието и скоростта на частиците LysoTracker и кимографските анализи бяха извършени с помощта на софтуера NIS Elements и описани подробно по-долу. В отделни експерименти 1 μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) беше добавен към кондиционирана среда и заснетите изображения на живи неврони бяха направени за не повече от 15 минути с помощта на конфокален микроскоп Nikon A1 с обектив 60X (NA 1.4) и NIS Elements софтуер.

Живо изображение на мозъчни тъкани

{{0}}месечни 5XFAD мишки бяха интраперитонеално инжектирани всеки ден в продължение на 3 седмици и след завършване на лечението мишките бяха анестезирани и перфузирани с разтвор, съдържащ 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM кинуренат , 0,01mM DL-2-амино-5-фосфонопентанова киселина, 5mM глутатион, 25mM глюкоза, 125mM NaCl, 1,4mM NaH2PO4 и 25mM NaHCO3.

След това мозъците бяха бързо дисектирани в ледено студен оксигениран ACSF, съдържащ 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, {{10}}.5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM захароза, 25 mM глюкоза, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM кинуренат, 0.01mM DL-2-амино-5-фосфонопентанова киселина и 5mM глутатион. 300 μm коронални срезове бяха получени с помощта на вибриращ микротом Compresstome VF-200 (Precision Instruments) и оставени да почиват за 30 минути за възстановяване при 32 градуса в кислороден ACSF разтвор, съдържащ следните 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, 0.5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM захароза, 25mM глюкоза, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM кинуренат, 0.01mM DL2-амино-5-фосфонопентанова киселина и 5mM глутатион.

След това срезовете се прехвърлят в 35 mm съдове със стъклено дъно (MatTek # P35G-1.5-14C), съдържащи окислен ACSF с 25nM LysoTracker-Green и 1:10,000 разреждане на 1mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich), който иначе е идентичен с ACSF, използван по време на периода на възстановяване. Жизнеспособността на среза беше потвърдена с помощта на изобразяване на тъкани с изтичане на времето. Срезовете се инкубират с LysoTracker-Green и Tiazine Red за 15 минути при стайна температура и след това кортикалните мозъчни региони се изобразяват веднага в същия разтвор при 32 градуса на конфокален микроскоп Nikon A1 с обектив 60X (NA 1.4) и софтуер NIS Elements за не повече от 30 минути.

Екстракция на мозъка и имуноблотинг

Мишките бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на ксилазин (15 mg/kg) и кетамин (100mg/kg), перфузирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (1XPBS) с фенилметилсулфонил флуорид (20ug/ml), леупептин (0,5 ug/ ml), натриев ортованадат (20 μM) и дитиотреитол (0,1 mM), последвано от отстраняване на мозъка. Всички буфери, използвани за протеинова екстракция, съдържат коктейл от протеазен инхибитор III (#535140, Millipore) и инхибитор на Halt фосфатаза (#78420, Thermo Fisher Scientific). Хемимозъчните тъкани бяха претеглени и ръчно хомогенизирани с помощта на хомогенизатор dounce 1:10 (w/v) в 1XPBS.

След хомогенизиране, лизатите се центрофугират при 20,8{{10}}0g за 30 минути при 4 градуса. Разтворимата фракция (супернатанта) се отстранява и утайката се ресуспендира чрез пипетиране в буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) [50mM Tris, 0,15M NaCl, 1% октилфеноксиполиетоксиетанол (IGEPAL), 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0,1% SDS и 0,5 % натриев деоксихолат при рН8] за инкубиране върху лед за 30 минути.

Пробите се обработват с ултразвук (Misonix XL{{0}}) за 20 секунди върху лед и след това се центрофугират при 20,800 g за 30 минути при 4 градуса. RIPA-разтворимата фракция (супернатант) се отстранява и утайката се ресуспендира в 5М гуанидин (рН 8.0) за анализ на неразтворими протеини. Всяка проба се обработва с ултразвук за 20 секунди върху леда, върти се за 1 час при стайна температура и след това се центрофугира при 20,800 g за 30 минути при 4 градуса. Тестът за бицинхонинова киселина (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) беше използван за измерване на протеиновата концентрация на всяка проба.

За Western blots, 20 ug протеин от всяка проба се зареждат върху 4-12% NuPAGE (Invitrogen) гелове и се разделят с помощта на MOPS буфер при намалени и денатурирани условия. Протеините се прехвърлят върху мембрана от поливинилиден дифлуорид и се развиват с помощта на Pierce ECL (подобрена хемилуминесценция; Thermo Fisher Scientific). Разработените сигнали се визуализират с помощта на ProteinSimple FCR (FluorChem R) и последващите хемилуминесцентни сигнали се определят количествено с помощта на софтуера AlphaView (ProteinSimple). Всички петна бяха анализирани с помощта на инструмента за локална фонова корекция, с изключение на петното HDJ-2, което беше анализирано с помощта на инструмента за фонова връзка във връзка с мултирегионална корекция на фона (софтуер AlphaView).

A 42 ELISA

За измерване на A 42 в хемимозъчни хомогенати от 5XFAD мишки, наличен в търговската мрежа ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) беше използван следвайки инструкциите на производителя за анализиране на гуанидин и PBS-разтворим A 42 в хемимозъци. За измерване на A 42 в мозъците на hAPP/PS1 мишки се използва наличен в търговската мрежа ELISA (h амилоид 42 ELISA високо чувствителен, Te Genetics Company, Цюрих, Швейцария). ELISA се извършва съгласно протокола на производителя.

Имунофлуоресценция на мозъчна тъкан на мишка

След перфузия мозъците бяха екстрахирани и хемимозъците бяха фиксирани в 10% формалин, последвано от криоконсервация в 30% разтвор на захароза в 1XPBS. Използван е замразяващ плъзгащ се микротом за събиране на 30- μm коронални или сагитални срезове. Срезовете се поставят серийно в 12-плака с ямки в криопротективен разтвор (1xPBS, 30% захароза и 30% етилен гликол) и се съхраняват при -20 градуса до употреба. Имунофлуоресцентното оцветяване се извършва чрез първо промиване на срезове три пъти в 1XTBS и след това срезове инкубиране в 16 mM глицин в 1XTBS за 1 час при стайна температура. След 3 допълнителни промивания в 1XTBS, срезовете бяха блокирани в 5% кози серум в 0,25% Triton X-100 в 1XTBS за 2 часа при стайна температура.

След това срезовете се инкубират за една нощ в първични антитела в разтвор на 0.25% Triton X-100, 1% говежди серумен албумин и 1XTBS при 4 градуса. След това се извършва вторично имунооцветяване с вторични антитела, маркирани с AlexaFluor на магаре в концентрация 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) се използва за монтиране на срезове, преди да бъдат изобразени на Ti2 микроскоп с широко поле или лазерно сканиращ конфокален микроскоп Nikon A1 за количествено определяне на изображението с помощта на софтуера Nikon NIS Elements за придобиване.

Всички настройки за придобиване остават същите между генотиповете и всички изображения са получени в рамките на един и същ период на изобразяване за отделни експерименти (Северозападен университетски център за усъвършенствана микроскопия и Център за изображения на Nikon).

Количествено определяне на изображението

Миши мозъци

Имунофлуоресцентното количествено определяне на имунооцветяването на мозъчна тъкан на мишка беше извършено на 3-5 среза на животно, от Bregma координати от приблизително -0.94 до -2.55 mm, които бяха изобразени с помощта на 10X обектив на Ti2 микроскоп с широко поле. Количествените анализи, включително праговете на размера и интензитета, бяха извършени с помощта на софтуера Nikon NIS-Elements (Northwestern University Nikon Imaging Center).

В зависимост от сигнала, праговете бяха зададени с помощта на инструмента за общ анализ въз основа на размера, формата и контраста на обекта и след това бяха създадени двоични маски за всеки канал и област от интерес. Праговото определяне беше извършено отделно за всеки канал, за да се изолират сигналите, представляващи интерес, чрез оптимизиране на съотношението сигнал/шум и елиминиране на неспецифични фонови сигнали. За изчисляване на LAMP1, BACE1 или LysoTracker-Green покрита площ, както и измервания на интензитета на флуоресценция на LAMP1 и Lysosensor в първични неврони, регионите от интерес бяха ръчно проследени с помощта на NIS-Elements и беше създаден двоичен слой за всеки регион от интерес.

За да се изчисли съотношението на LAMP1 към A 42, площта на LAMP1 в дистрофичните неврити се нормализира към площта на A 42 на базата на индивидуална плака и средните съотношения на мишка между групите на лечение се определят количествено. Анализът на коефициента на корелация на Pearson за BACE1 и LAMP1 беше извършен с помощта на NIS-Elements на база на плака върху проекции с максимален интензитет на 30 μm Z-stack изображения, направени с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп Nikon A1 с размер на стъпката 1 μm.

За да се изчисли съотношението на LysoTrackerGreen към Tiazine red, площта на LysoTracker-Green в дистрофичните неврити се нормализира към площта на Tiazine Red на базата на индивидуалната плака и средното съотношение на мишка се определя количествено между третираните групи. Четири коронарни секции от Bregma координати от приблизително -1.70 до -2.55 mm бяха използвани за изчисляване на площта или интензитета на всеки сигнал във всяка съответна мозъчна област за всяка мишка. Анализът на покритата с плака площ и размера на плаката се извършва, като се използва средната стойност от пет секции на мишка от Bregma координати от приблизително -0.94 до -2.55 mm. Изборът на секция, получаването на изображение, проследяването на изображението и количествените оценки бяха извършени от човек, който не е запознат с групите за лечение и генотипите.

Първични неврони

За количественото определяне на LAMP1 имунооцветяването във фиксирани първични неврони на мишка, соми бяха ръчно проследени на базата на морфология с помощта на NIS-Elements и беше създадена двоична маска за всеки интересен регион и канал. Използва се прагово определяне за оптимизиране на LAMP1 сигнали и разграничаване на LAMP1 в неврити, включително дендрити и аксони, чрез изолиране на пиксели от LAMP1, положителни за тубулинови пиксели.

Клетъчните сома LAMP1 сигнали бяха изключени от общата LAMP1 област, за да се анализират LAMP1 везикули в неврити. За анализ на подвижността на LysoTracker-Green в невроните, изображенията бяха количествено определени с помощта на NISElements. Скоростта и разстоянието на общите частици LysoTrackerGreen във всеки кадър бяха проследени с помощта на функцията за автоматично проследяване на движение в NIS-Elements. Зададен е праг и е приложен към всички филми въз основа на размера и интензитета на флуоресценцията на частиците LysoTracker-Green за елиминиране на фоновия шум.

За генериране на кимограф, изобразяване с изтичане на времето на единични неврони беше извършено на 60X конфокален микроскоп и аксоните бяха идентифицирани морфологично. Процентът на честотата на частиците, движещи се в антероградна или ретроградна посока, или стационарни, се определя количествено чрез разделяне на броя на частиците за всяка група на общия брой частици. За кимографски анализи движещите се частици се определят като имащи скорост над 0,1 μM/sec.

Статистически анализ

Софтуерът GraphPad Prism v8 беше използван за извършване на статистически анализи, включително анализ на дисперсията (ANOVA) с posthoc тестове при сравняване на повече от две проби и несдвоени t-тестове, когато се сравняваха само две проби. Конкретни подробности за теста, включително броя на повторенията, вида на последващите тестове и P стойностите са посочени в легендите на фигурите. Всички количествени показатели са нанесени на графика при средна стойност ± SEM. Заключението за значимост беше, когато стойността на P беше по-малка от 0.05, обозначена с *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com