Rho-GTPase активиращ протеин миозин MYO9A, идентифициран като нов кандидат ген за моногенна фокална сегментна гломерулосклероза

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1, Ashima Gulati2,6, Mathieu Lemaire3,7, Timothy Nottoli4, Allen Bale3 и Alda Tufro1,5

1 Катедра по педиатрия, Секция по нефрология, Медицинско училище Йейл, Ню Хейвън, Кънектикът, САЩ; 2 Катедра по вътрешни болести, Секция по нефрология, Медицинско училище Йейл, Ню Хейвън, Кънектикът, САЩ; 3 Катедра по генетика, Yale School of Medicine, Ню Хейвън, Кънектикът, САЩ; 4 Yale Gene Editing Center, Yale School of Medicine, Ню Хейвън, Кънектикът, САЩ; и 5 Катедра по клетъчна и молекулярна физиология, Yale School of Medicine, Ню Хейвън, Кънектикът, САЩ

КЛЮЧОВИ ДУМИ: ФСГС; взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин; MYO9A варианти; RhoA активност

Фокална сегментна гломерулосклероза(FSGS) е подоцитопатия, водеща до бъбречна недостатъчност, чиято молекулярна причина често остава неразрешена. Тук ние описваме рядка безсмислена хетерозиготна мутация на MYO9A загуба на функция (p.Arg701*) като възможен фактор за заболяване при двойка братя и сестри с фамилнаFSGS/протеинурия. Варианти на MYO9A с несигурно значение бяха идентифицирани чрез секвениране на цял екзом в група от 94 доказани с биопсия пациенти с FSGS. MYO9A е неконвенционален миозин с Rho-GAP домейн, който контролира свързването на епителните клетки, омрежва и свързва актина и деактивира малкия протеин GTPase, кодиран от гена RHOA. Активността на RhoA е свързана с цитоскелетната регулация на образуването на актинови стресови влакна и контрактилитета на актомиозин. Myo9A беше открит в миши и човешки подоцити in vitro и in vivo. Разработени мишки Knockin, носещи p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X), генерирани чрез генно редактиране

протеинурия, изтриване на подоцити иFSGS. Бъбреци и подоцити от Myo9AR701X/D мутантни мишки разкриват хаплонедостатъчност на Myo9A, повишена активност на RhoA, намалено взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин, нарушено прикрепване на подоцити и миграция. Нашите резултати показват, че Myo9A е нов компонент на цитоскелетния апарат на подоцитите, който регулира активността на RhoA и функцията на подоцитите. По този начин Myo9AR701X/þ мишките с нокаут рекапитулират пробандния FSGS фенотип, демонстрират, че p.R701X Myo9A е мутация, причиняваща FSGS при мишки, и предполагат, че хетерозиготни мутации със загуба на функция MYO9A могат да причинят нова форма на човешка автозомно доминантна FSGS. Следователно, идентифицирането на MYO9A патогенен

варианти при допълнителни индивиди с фамилни или спорадичниFSGSе необходимо, за да се установи приносът на гена към заболяването.

Преводна декларация

Тази работа идентифицира мутация на загуба на функция на миозин 9A (MYO9A) в семейство с протеинурия и фокална сегментна гломерулна склероза (FSGS) иMYO9A вариантис несигурно значение в кохорта на FSGS. Myo9A нокаутните мишки, носещи p.Arg701* мутация, развиват протеинурия иFSGS, възпроизвеждайки фенотипа на пробандите. Този нов животински модел предоставя нови механични прозрения за функциите на Myo9A в подоцитите и дава възможност за тестване на експериментални терапии за FSGS. Данните предполагат, че хетерозиготната загуба на функция MYO9A мутации могат да допринесат заFSGSпатогенеза. Предлагаме включването на MYO9A в панелите за генетично изследване на FSGS.

Фокална сегментна гломерулосклероза(FSGS) е хистологична лезия, която може да доведе до краен стадий на бъбречно заболяване.1 Генетичните изследвания показват, че FSGS е до голяма степен подоцитопатия, тъй като подоцитите експресират повечето от причиняващите мутантни гени.2,3 Въпреки това, молекулярната причина за FSGS е неизвестна в повече от половината от случаите.3 Следователно идентифицирането на допълнителни гени, причиняващи FSGS, и тяхната молекулярна патогенеза е клинично значимо. Тук идентифицираме миозин 9A (MYO9A) като нов кандидат-ген за човешки FSGS чрез секвениране на целия екзом (WES). Общата цел на това проучване е да се определи дали редкият вариант MYO9A, идентифициран при пациенти, променя функцията на подоцитите и причинява FSGS in vivo. MYO9A кодира неконвенционален, немускулен миозин, който преди това не е бил свързан с бъбречно заболяване при хора.4 Мутации на MYO9A са докладвани при пациенти с артрогрипоза и вроден миастеничен синдром.5,6 Миозините са семейство от молекулярни двигатели, които свързват актина, за да генерират сила и движение и да обслужват множество клетки функции, включително регулиране на подвижността и формата, трафик на органели и сигнализиране.7–9 Съобщава се, че мутациите на миозин IIA (MYH9) и миозин 1E (MYO1E) причиняват гломерулна болест и автозомно рецесивен FSGS.10–12 клас-9 миозините включват MYO9A и MYO9B, които се експресират съответно от епителни и имунни клетки.9,13 Техните отличителни черти са процесираща единична глава, която се движи върху F-актин и Rho-гуанозин трифосфатаза активиращ протеин (Rho-GAP) опашка домен, който инактивира RhoA. Myo9A mRNA се експресира в епендималния епител на мозъка и в епитела на тестисите, белите дробове и бъбреците. 4 Мишките с нокаут Myo9A развиват прогресивна хидроцефалия, лека хидронефроза и тубулопатия. 14, 15 In vitro Myo9A контролира свързването на епителните клетки и колективната клетъчна миграция. 9 Важно е, че Myo9A е достатъчен за кръстосано свързване и свързване на актинови нишки, предизвикващи образуването на актинови мрежи.16

RhoA модулира динамиката на подоцитния актин и поддържа пропускливостта на гломерула.17 Смущенията на активността на Rho-гуанозин трифосфатаза (Rho-GTPase) в подоцитите водят до гломерулна болест (разгледана в Mouawad et al.18). Мутациите на низходящите ефектори (INF2)19 и регулаторите на Rho гуанозин дифосфат дисоциация-инхибитор алфа (ARHGDIA)3 и Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 причиняват протеинурия и FSGS. По този начин фината настройка наRho-GTPase активносте от решаващо значение за поддържането на нормален подоцитен фенотип in vivo. 18

Тук съобщаваме, че MYO9A е нов подоцитен протеин, който, когато е мутиран в мишки, води до протеинурия, изтриване на крака (FPE) и FSGS, възпроизвеждайки човешкия фенотип, свързан с p.Arg701* MYO9A вариант. Нашите открития разкриват значението на Myo9A в подоцитите, демонстрират, че Myo9A регулира RhoA на подоцитите и предоставят първото доказателство, че p.Arg701* Myo9A причинява дисфункция на подоцитите, като не успява да регулира отрицателно RhoA и намалява взаимодействието Myo9A-актин-калмодулин.

цистанчемогалекуват бъбречно заболяванеподобрявамбъбречна функция

МЕТОДИ

УЕС

WES на ДНК проби от 2 засегнати братя и сестри и 94 кохортни субекта от клиничното изпитване за фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS-CT; NCT00135811) беше извършено в Центъра за анализ на генома на Йейл и клиничната лаборатория на Йейл за ДНК на платформи Illumina.21–26 FSGS- CT кохорта WES набор от данни беше разпитан за идентифициранеMYO9A вариантис ограничение на честотата на незначителни алели #{{0}}.01 процента за хетерозиготни варианти и #0,1 процента за хомозиготни и комбинирани хетерозиготни варианти, оценени с помощта на биоинформатични резултати MetaSVM,27 SIFT,28 и CADD29. Вариантите на MYO9A бяха потвърдени чрез секвениране на Sanger. Генен панел от 64 гена, причиняващи FSGS, базиран на OMIM, онлайн менделово наследство при човека, база данни (omim.org) и литература, свързана с "FSGS", "гломерулна протеинурия" или "нефротичен синдром" (или комбинация от тези термини) бяха използвани за идентифициране на подходящи варианти.

Генериране на чукащи мишки Myo9AR701X

Ние генерирахме Myo9AR701X нокаутни мишки чрез CRISPR/Cas9-медиирано редактиране на гени.30 Пълните методи са включени в Допълнителните методи. Myo9AR701X нокини и диви котила, мъжки и женски, бяха използвани следвайки одобрените от Комитета за грижа и използване на животните протоколи на Yale Animal Research Center.

Хистология/IF

Биопсия на човешки бъбрек и бъбреци на мишка бяха обработени за хистология, имунофлуоресценция (IF) и трансмисионна електронна микроскопия (TEM), както е описано. 31, 32 IF беше извършена в замразени срезове на бъбрек на мишка и култивирани подоцити. Първичните антитела бяха миши анти-MYO9A (клон 4C11; Abnova, Тайпе, Тайван), заешки анти-подоцин (P0372; Sigma, St. Louis, MO), заешки анти-ламинин (L9393; Sigma), заешки анти-аквапорин2 (PAS -78809; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и заешки анти-мегалин;33 вторични антитела бяха Alexa Fluor-488 и 594-конюгирани (Invitrogen). Изображенията са получени с помощта на конфокален микроскоп Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Япония) или Leica SP5-Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Германия).

Имуноблот/имунопреципитация

Протеините се разделят чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел и се имуноблотират, както е описано по-горе;31,32 с анти-MYO9A (клон 4C11), актин (A2066; Sigma), калмодулин (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), глицералдехид{{ 9}} първични антитела на фосфат дехидрогеназа (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Коимунопреципитацията се извършва, както е описано, 34, 35 с анти-MYO9A заешко поликлонално антитяло (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), последвано от имуноблотинг

cistanche за фокална сегментна гломерулосклероза

Количествен PCR

Общата РНК се транскрибира обратно с помощта на iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), амплифицирана с iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и Myo9A праймери за полимеразна верижна реакция (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 и 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 с помощта на CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad). Myo9a иРНК се нормализира до GAPDH иРНК с 2-DDCt метода, както е описано.36

ТЕМ/имуноелектронна микроскопия

ТЕМ беше извършена, както е описано.32 За имунозлато ЕМ, миши бъбрек от див тип беше фиксиран, ултратънките криосекции бяха угасени, блокирани и инкубирани с първично антитяло на мишка анти-MYO9A (клон 4C11). Вторичното антитяло беше заешко анти-миши IgG, златният конюгат беше козе-анти-заешко 10 nm злато. Срезовете бяха постфиксирани, оцветени и изследвани на FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM.

Първично изолиране на подоцити и функционални анализи

Подоцитите бяха изолирани от див тип и Myo9AR701X/þ бъбреци, както е описано 34 с малко модификации. 37,38 Тестовете за адхезия бяха извършени, както е описано и количествено определени с помощта на оцветяване с кристално виолетово.37

Myo9A нокдаун

Нокдаун на Myo9A (Myo9AKD) беше индуциран в обезсмъртени миши подоцити от див тип, използвайки Myo9A малка интерферираща РНК (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Кеймбридж, Обединеното кралство), следвайки инструкциите на производителя. Нетрансфектирани подоцити и подоцити, трансфектирани с ненасочена siRNA (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-control, Dharmacon) служат като контроли.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>T мутация, споделена от пробанд, сестра и майка (отгоре, означена с *) и последователност от див тип (WT) от бащата (отдолу), базирана на човешка MYO9A референтна последователност NM_006901.4. (b) Бъбречна биопсия от пробанд показва FSGS и лек интерстициален инфилтрат (оцветяване с периодична киселина – Шиф, оригинално увеличение X 400). (c) Семейното родословие показва сегрегация на генотип-фенотип: индивиди с протеинурия/FSGS и вариант на MYO9A p.R701X (плътни символи), див тип (празен символ) или неизвестен генотип MYO9A (обозначен с #). (d) Див тип MYO9A (NP_008832.2) протеинови домейни: двигателен домейн (сив) включва бримка 2 (жълт) и място за свързване на калмодулин (червено), домейн на врата (син), домейн на опашка (розов) ) включително Rho–гуанозин трифосфатаза активиращи протеини (Rho-GAP) домен (зелен); границите на домейна са обозначени с номер на аминокиселинен остатък; прогнозираният p.R701X MYO9A завършва в калмодулин-свързващото място в бримка 2, без домейните на шията и опашката, звездичките показват местоположението на миссенсаMYO9A вариантис неизвестно значение идентифицирани. (e) Еволюционно запазване на аминокиселинни остатъци, променени от MYO9A missense (продължение)

Фигура 1|(продължение) мутации, идентифицирани при пациенти с FSGS: MYO9A променени остатъци p.D156G (p.Asp156) и p.E765D (p.Glu765) (червени стрелки) са силно запазени чрез филогенеза. Номера за достъп: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) и X. tropicalis (XP_002934596.2) бяха използвани за подравняване на множество последователности на MYO9A с Clustal Omega, EMBL-EBI (Европейска молекулярна биология Лаборатория – Европейски институт по биоинформатика, https://www.ebi.ac.uk/Tools/MSA/clustalo/). За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.kidney-international.org.

RhoA активност

Активният RhoA беше измерен с Rho-активиращ падащ тест (Millipore), следвайки инструкциите на производителя.39 Активният RhoA беше открит чрез имуноблотинг.40

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на софтуер GraphPad Prism 8 (Сан Диего, Калифорния) с несдвоен t-тест на Student с корекция на Welch или дисперсионен анализ на Welch, според случая. P < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

РЕЗУЛТАТИ

Идентифициране на варианти на MYO9A при пациенти с протеинурия и FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* MYO9A вариант, показващ автозомно доминантно унаследяване на мутацията (Фигура 1в). Генотип от чичо по майчина линия с хронично бъбречно заболяване не е наличен. MYO9A p.Arg701* (p.R701X) се очаква да доведе до загуба на функция, дължаща се на безсмислено медиирано разпадане на иРНК или на срязване в бримка 2 на главен домейн на MYO9A (Фигура 1d), което е необходимо за Myo9A да омрежва актин .16 Допълнителна таблица S1 показва всички варианти, споделени от братята и сестрите. Не са открити мутации в FSGS или гени, причиняващи нефротичен синдром, докладвани до момента в нито един брат (допълнителна таблица S2). Доколкото ни е известно, това е първият доклад, свързващ мутацията на загуба на функция MYO9A с бъбречно заболяване при хора.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 другите 3 варианта на миссенс се считат за доброкачествени въз основа на 3 резултата за прогнозиране на биоинформатиката. Аминокиселините, заместени във вариантите на p.Asp156Gly и p.Glu765Asp, е вероятно да имат подходяща функция, тъй като тези остатъци се запазват чрез еволюция (Фигура 1е). Ние също идентифицирахме 1 пациент, носител на вариант на MYO9A (p.Arg2283His), който не отговаря на нашите критерии за честота на незначителни алели, докладвани по-рано при синдром на вродена миастения.6 Няма патогенни мутации или вредни варианти в гените, причиняващи FSGS/NS/протеинурия (допълнителна таблица S2 ) са идентифицирани при 5-те индивида с варианти на MYO9A.

Експресия на MYO9A в подоцити и гломерулна болест

Експресията на Myo9A протеин се открива чрез имуноблотинг в миши бъбреци и миши и човешки подоцити (Фигура 2а). Имуноцитохимията потвърди цитоплазмената експресия на MYO9A в човешки подоцити (Фигура 2b). Имунореактивният Myo9A се открива чрез IF микроскопия в миши гломерули, където той частично се колокализира с подоцин (Фигура 2в). Двойното маркиране и конфокалната микроскопия очертават локализацията на Myo9A по външния аспект на гломерулната базална мембрана (GBM), плътно съседна или колокализирана с подоцин (Фигура 2d) и ламинин (Фигура 2e). Immunogold EM демонстрира точната локализация на Myo9A. Златните частици се разпределят в цитоплазмата на процеса на крака и клетъчното тяло на подоцитите (Фигура 2f и g, допълнителна фигура S1B и D). Прорезните диафрагми са равномерно немаркирани. Мезангиалните и ендотелните клетки не показват значително маркиране. Златни частици също се откриват в проксималните тубулни клетки (допълнителна фигура S1C).

За да оценим дали експресията на Myo9A е нарушена при гломерулни заболявания, ние изследвахме 2 модела на мишки, свързани с протеинурия в нефротичен диапазон. По подобен начин, гломерулният Myo9A е намален при мишки с медиирана от стрептозотоцин напреднала диабетна гломерулосклероза, индуцирана от свръхекспресия на Vegfa, 32 в сравнение с Myo9A, открит при мишки с диабет, които не свръхекспресират Vegfa (Фигура 3b) и недиабетни мишки (Фигура 2c). Локализацията на процеса на крака на подоцитите Myo9A и намаленият гломерулен Myo9A в двата модела на протеинурични заболявания предполагат, че Myo9A може да играе роля в бариерната функция на гломерулната филтрация.

Таблица 1|Варианти на Missense MYO9A, идентифицирани в групата пациенти на FSGS-CT

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P1704S, p.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Варианти, филтрирани при честота на второстепенния алел #0,01 процента, n=94 проби след анотацията на ANNOVAR.

Генно редактирани MYO9AR701X мишки за развитие на FSGS

За да определим дали безсмислената мутация на p.Arg701* (p.R701X) MYO9A причинява гломерулна болест при мишки, ние генерирахме p.Arg701* (тук наречени Myo9AR701X) мишки чрез CRISPR/Cas9-медиирано генно редактиране.30 Хетерозиготни Myo9AR701X/þ мутантни мишки (Фигура 4а) дават жизнеспособни мутантни малки по менделски начин, демонстрирайки, че мутацията не е ембрионално смъртоносна. Хомозиготните мутанти развиват прогресивна хидроцефалия (допълнителна фигура S2), атаксия и гърчове и почти всички умират преди 3-седмична възраст, напомняйки на Myo9A-нулевите мишки.14 Хетерозиготните Myo9AR701X/þ мутанти нямат очевиден фенотип при раждането, плодовити са и оцеляват до зряла възраст.

Всички Myo9AR701X мутантни мишки развиват FPE и протеинурия, макар и на различна възраст. Хомозиготни Myo9AR701X/R701X мутанти показват дисморфни гломерули, тубулна дилатация и протеинови отливки при светлинна микроскопия на 2-седмична възраст (Фигура 4b, Допълнителна фигура S3A). TEM на 2-седмично стари Myo9AR701X/R701X мутантни бъбреци разкрива екстензивен FPE, дебел и неправилен GBM и липса на прорезни диафрагми, заменени от прилепнали връзки (Фигура 4d). За разлика от това, 2-седмични хетерозиготни Myo9AR701X/þ мутанти показват нормална бъбречна хистология и ултраструктура на гломерулната филтрационна бариера (Фигура 4c и e), неразличими от див тип котила (Фигура 4f), както е потвърдено от количественото определяне на процесите на краката (FP/mm GBM) (Фигура 4g). Албуминурия се открива в проби от урина както от хетерозиготни, така и от хомозиготни Myo9AR701X мутантни мишки чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (Фигура 4h) на 2-седмична възраст.

На 4-месечна възраст хетерозиготни Myo9AR701X/þ мишки показват FSGS при светлинна микроскопия (Фигура 5a и g) и TEM разкрива FPE (бели стрелки), анормални прорезни диафрагми (къси черни стрелки), неправилен GBM и мезангиална експанзия (Фигура 5b) . Количественото определяне на процесите на стъпалото показва значително FPE в Myo9AR701X/þ в сравнение с див тип възрастни бъбреци (Фигура 5в). Този гломерулен фенотип е забележително подобен на този, наблюдаван в бъбречната биопсия на пробанд (Фигура 1b). Възрастни хетерозиготни Myo9AR701X/þ мутантни мишки имат значително по-високи съотношения на албумин-креатинин в урината, отколкото съответстващи на възрастта мишки от див тип (Фигура 5d) и не показват доказателства за полиурия или загуба на тегло (Фигура 5e и f). При периодично изследване на киселина-Шиф, възрастни Myo9AR701X/þ бъбреци показват FSGS с различна тежест (стрелки, Фигура 5g) и липса на тубулна атрофия и дилатация или интерстициални инфилтрати. Двойно маркиране и конфокална микроскопия откриват Myo9A в проксималните тубули, периферно спрямо мегалин (върхове на стрелки, Фигура 5h и k), докато Myo9A не се открива в дистални сегменти на нефрон, експресиращи аквапорин2 (Фигура 5h и i). Етикетирането на двата тубулни маркера при възрастни Myo9AR701X/þ е неразличимо от бъбреците от див тип чрез конфокална микроскопия (Фигура 5h и k и i и l). Обратно, оцветяването с Myo9A в проксималните тубули и в гломерулите е намалено в Myo9AR701X/þ (Фигура 5h и i) в сравнение с бъбреците от див тип (Фигура 5k и l). Заедно тези открития показват, че p.Arg701* е FSGS-причиняваща Myo9A мутация при мишки, която обобщава фенотипа и автозомно доминантното наследяване на хетерозиготния MYO9A p.Arg701* вариант, идентифициран в пробанда.

Как p . Arg701* Myo9A мутацията индуцира FSGS?

Използвахме мишки Myo9AR701X knock-in, за да изследваме молекулярната патогенеза на FSGS, причинена от p.Arg701* MYO9A мутация. Експресията на Myo9A в бъбреците на Knockin Myo9AR701X значително намалява в хетерозиготите и не се открива в хомозиготите чрез IF (Фигура 6а) и имуноблотинг (Фигура 6b и c). Извършихме количествена PCR, за да оценим дали хаплонедостатъчността, медиирана от безсмислено разпадане на иРНК42, възниква в Myo9AR701X/þ мутанти. Експресията на Myo9A mRNA в Myo9AR701X/þ бъбреците е w50 процента по-ниска, отколкото в бъбреците от див тип (48,3 ± 5,6 процента; P <0,0001) (фигура="" 6d),="" което="" е="" в="" съответствие="" с="">

Намаленият Myo9A намалява взаимодействието му с актин и калмодулин

Проверихме дали хаплонедостатъчността на Myo9A променя взаимодействието Myo9A-актин-калмодулин. Експериментите за коимунопреципитация, сравняващи бъбреци и подоцити от див тип и Myo9AR701X/þ, потвърждават взаимодействието на Myo9A с актин и с калмодулин и показват, че взаимодействието на Myo9A с двата протеина намалява с w50 процента в Myo9AR701X/þ мутантни бъбреци и подоцити (Фигура 6e и f), намаление подобно на това на Myo9A в пълна дължина. Обратно, нивата на експресия на актин и калмодулин остават непокътнати (вход, Фигура 6e и f). За да анализираме взаимодействията на Myo9A в условията на намалена експресия, ние индуцирахме w50 процента Myo9AKD в обезсмъртени миши подоцити от див тип, използвайки siRNA, оценени чрез количествена PCR и имуноблотинг (Фигура 7а и b), след което проведохме експерименти за коимунопреципитация. Myo9AKD намалява взаимодействието Myo9A-актин-калмодулин пропорционално на експресията на Myo9A (Фигура 7в). Заедно резултатите от коимунопреципитация показват, че хетерозиготната p.Arg701* Myo9A мутация и Myo9AKD намаляват изобилието на Myo9A и по този начин неговото взаимодействие с актин и калмодулин. Тъй като Myo9A кръстосано свързва актина в моларно съотношение 1:1,16 нашите данни предполагат, че намаленият Myo9A в хетерозиготни Myo9AR701X/þ подоцити може да наруши Myo9A-медиираното кръстосано свързване и групиране на актин.

Фигура 2|(продължение) до podocin (зелено) от страната на GBM (върхове на стрелки). Вмъкванията показват по-голямо увеличение. Решетки=25 mm. ( д ) Конфокалната микроскопия показва Myo9A оцветяване, близко съседно или колокализирано с ламинин (зелено) по протежение на външния аспект на GBM (вмъквания и стрелка). Решетки=25 mm. (f,g) Локализация на Myo9A чрез имунологична електронна микроскопия в гломерули на миши бъбреци от див тип: златни частици (черни стрелки) се наблюдават в тялото на подоцитната клетка (POD) и цитоплазмата на крака (FP), виждат се някои златни частици в основата на FP до гломерулната базална мембрана, но не и при прорезните диафрагми. Барове ¼ 500 nm. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.kidney-international.org.

Мутацията Myo9AR701X повишава Rho-A активността

Измервахме активността на RhoA, използвайки падащ анализ в Myo9AR701X мутант и мишки от див тип, фокусирайки се върху хетерозиготен Myo9AR701X/þ, за да осигурим механистична представа за човешкия p.Arg701* MYO9A фенотип. Активният RhoA е значително увеличен в Myo9AR701X/þ цели бъбреци (Фигура 8а), изолирани гломерули (Фигура 8b) и първични подоцити (Фигура 8с), в сравнение със съответните контролни проби от див тип. Степента на увеличение на GTP-RhoA в проби Myo9AR701X/þ варира от w60 процента в изолирани гломерули до w2- пъти в цели бъбреци и в подоцити (Фигура 8a–c). Активният RhoA е малко по-висок при хомозиготни, отколкото при хетерозиготни мутантни бъбреци, но разликата не е значима (Фигура 8а). Заедно тези експерименти показват, че Myo9AR701X причинява повишена активност на RhoA

Myo9AR701X/D мутация и Myo9AKD променят поведението на подоцитите

За да оценим ефекта от нарушеното взаимодействие Myo9A-актин и повишената RhoA активност, открита в Myo9AR701X/þ мутантни подоцити върху тяхната функция, ние измерихме адхезията и подвижността на подоцитите, използвайки анализи на прикрепване и миграция, сравнявайки див тип с мутантни първични подоцити в контролни условия и на RhoA сигнализиращо инхибиране с Rho-свързан киназен инхибитор Y27632. Тези експерименти ясно показват, че Myo9AR701X/þ уврежда подвижността на подоцитите (Фигура 8d; Допълнителна фигура S4) и прикрепването на подоцитите (Фигура 8e) по начин, зависим от активността на RhoA. За да оценим директно ефекта на хаплонедостатъчността на Myo9A върху функцията на подоцитите, ние проведохме анализи на прикрепване и миграция, сравнявайки див тип миши подоцити с Myo9AKD подоцити, експресиращи w50 процента Myo9A mRNA и протеин (Фигура 7a и b). Подоцити, третирани с нетаргетираща siRNA, служат като допълнителен контрол. Myo9AKD значително намалява прикрепването и миграцията на подоцитите, същият дефект, наблюдаван в Myo9AR701X/þ подоцитите (Фигура 8f и g). Взети заедно, механистичните данни показват, че хетерозиготна p.Arg701* Myo9A мутация води до хаплонедостатъчност на Myo9A, което води до намалено взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин и повишен активен RhoA в бъбреците, по-специално в подоцитите. Ние тълкуваме, че заедно тези механизми нарушават функцията на подоцитите, което се показва от намалено прикрепване и подвижност in vitro и от наличието на протеинурия in vivo.

ДИСКУСИЯ

Това проучване идентифицира Myo9A като нов компонент на цитоскелетния апарат на подоцитите, който влияе върху функцията на подоцитите чрез отрицателно регулиране на активността на RhoA. Ние описваме рядка безсмислена мутация MYO9A (p.Arg701*), свързана с

фамилна FSGS/протеинурия и демонстрират, че тази мутация причинява FSGS-подобни лезии при мишки, предоставяйки представа за механизма на заболяването.

Нашите констатации подкрепят схващането, че MYO9A е кандидат ген за FSGS и че p.Arg701* MYO9A е вариант, замесен в човешкия FSGS, въз основа на насоките на Американския колеж по медицинска генетика за приписване на причинно-следствена връзка с помощта на алгоритми за прогнозиране на гени, алелни честоти, експериментални животински модели , и функционални анализи.43,44 Пробандните братя и сестри, носещи p.Arg701* MYO9A, нямат мутации в гени, причиняващи FSGS, известни до момента, и не показват доказателства, предполагащи вторични причини за FSGS. Този вариант косегрегира в малък род, следвайки автозомно доминантен модел на унаследяване с променлива експресивност. Предполага се, че MYO9A p.Arg701* е вариант със загуба на функция, отсъства от контролните екзоми и има алелна честота<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

WES скринингът на голяма група от несвързани FSGS деца и млади възрастни41 идентифицира 2 пациенти с редки хетерозиготни MYO9A миссенс варианти (p.Asp156Gly и p.Glu765Asp). И двата варианта на MYO9A missense включват силно запазени остатъци, имат незначителни алелни честоти<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Фигура 3|Гломерулна експресия на Myo9A в миши модели на гломерулна болест. (a) Нефротичен синдром в развитието, индуциран от свръхекспресия на Vegfa31: имунофлуоресценцията показва Myo9A (червен) в гломерули от нормални, неиндуцирани 2-седмични мишки и ясно намалена експресия на Myo9A в гломерули от нефротични мишки, свръхекспресиращи Vegfa, докато подоцин (зелен) е непроменена. (b) Индуциран от стрептозотоцин диабет със или без свръхекспресия на Vegfa32: имунофлуоресценцията открива Myo9A (зелено) в гломерули от неиндуцирани диабетни бъбреци (DM контрол) и значително намален имунореактивен Myo9A в гломерули от мишки с диабет, свръхекспресиращи Vegfa, които развиват диабетна гломерулосклероза (напреднал DN), 40,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (син) показва ядра от двете секции с очертани гломерули (щрихована бяла линия). Решетки=50 mm. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www. бъбрек-междунар.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>T мутацията замества CGA, кодиращ Arg (R) с TGA, стоп кодон, който предсказва прекратяване на транслацията при аминокиселина 701. (b) Представително периодично киселинно-шифово оцветяване от 2-седмичен хомозиготен Myo9AR701X/R701X мутантен бъбрек показва анормални гломерули, тубулна дилатация и протеинови отливки. Бар=20 mm. (c) Представително периодично киселинно-шифово оцветяване от 2-седмичен хетерозиготен Myo9AR701X/þ бъбрек показва нормална хистология. Бар=20мм. (d) Представителна трансмисионна електронна микроскопия от 2-седмичен гломерул Myo9AR701X/R701X показва масивно изтриване на израстъка на стъпалото (бели стрелки), липса на прорезни диафрагми, заменени от прилепнали връзки (черни стрелки) и удебелена, неправилна гломерулна основа мембрана (GBM). Шина =1 mm. (д) Представителна трансмисионна електронна микроскопия от 2-седмичен хетерозиготен Myo9AR701X/þ гломерул показва нормални процеси на краката (черни тънки стрелки) и нормални прорези на диафрагмите (бели тънки стрелки). Шина =1 mm. (f) Трансмисионна електронна микроскопия от 2-седмичен WT котило показва нормална гломерулна филтрационна бариера: тънки израстъци на краката, свързани с прорезни диафрагми, фенестрирани ендотелни клетки (EC) и тънък GBM. Шина =1 mm. ( ж ) Количествено определяне на изтриването на крака на 2-седмична възраст: хомозиготни Myo9AR701X/R701X бъбреци показват по-малко от половин крак (FPs)/mm GBM, отколкото WT или хетерозиготни Myo9AR701X/þ котила, което показва тежко изтриване на крака. P <0.0001 (анализ="" на="" дисперсията).="" (h)="" кумаси="" синьо="" оцветяване="" на="" разтворени="" проби="" от="" урина="" с="" натриев="" додецилсулфат-полиакриламиден="" гел="" електрофореза="" показва="" албуминурия="" (alb)="" както="" в="" myo9ar701x/r701x="" (плюс="" ),="" така="" и="" в="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" плюс),="" докато="" wt="" урината="" не="" съдържа="" албумин.="" говежди="" серумен="" албумин="" (10="" mg)="" служи="" за="" контрол="" на="" молекулното="" тегло.="" pod,="" подоцит.="" за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">

Фигура 5|Анализ на фенотипа на възрастни хетерозиготни мишки Myo9AR7{{20}}1X/D knockin. (a) Представително оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) от 4--месечен Myo9AR701X/þ бъбрек показва гломерул с екстензивна фокална сегментна гломерулна склероза и мезангиална пролиферация. Стълб=50 mm (b) Представителна трансмисионна електронна микроскопия от 4--месечен Myo9AR701X/þ бъбрек показва обширно изтриване на израстъка на крака (бели стрелки), частична подмяна на прорезните диафрагми (тънки черни стрелки) от прилепнали връзки (дебели черни стрелки). Стълб =2 mm (c) Количествено определяне на изтриването на процеса на крака при възрастни Myo9AR701X/þ мутантни мишки: хетерозиготни (Het) Myo9AR701X/ þ на възраст 4 месеца показват 2,2±0,06 FP/mm, в сравнение с дивия тип (WT ) 3,7±0,13 FP/mm. ****стр<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0,001. (e) Обемът на урината (24 часа) и (f) телесното тегло не се различават при WT (n=18) и Myo9AR701X/þ (Het, n=16) мишки. ( g, j ) Представително PAS оцветяване от Myo9AR701X / þ ( g ) и WT ( j ) бъбреци: ( g ) показва ранна фокална склероза (стрелки) и мезангиална пролиферация в 2 гломерула, нормални тубули обратно към гърба и без инфилтрати; (j) показва нормални гломерули и тубули в WT бъбрек. Барове=50 mm. (h,k) Конфокална микроскопия на Myo9A/Megalin имунофлуоресценция: (h) Myo9AR701X/þ бъбрек показва ограничен Myo9A (червен) сигнал (стрелки) в проксималните тубулни клетки, маркирани с мегалин (зелено), проксималните тубули не са разширени; ( k ) WT бъбрек показва по-изобилен Myo9A (стрелки), съседен на мегалин в проксималните тубулни клетки. Барове=25 mm. (i,l) Конфокална микроскопия на Myo9A/Aquaporin2 (AQP2) имунофлуоресценция: (i) Myo9AR701X/þ бъбрек показва ограничено Myo9A (червено) в гломерула (върхове на стрелки), Myo9A не се открива в дистални нефронови сегменти, белязани с AQP2 (зелено) , които не са разширени; ( l ) WT бъбрек показва Myo9A оцветяване в гломерула и AQP2 оцветяване в дистални нефронови сегменти. Барове=25 mm. EC, ендотелни клетки; FP, крак процеси цитоплазма; GBM, гломерулна базална мембрана. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.kidney-international.org.

Фигура 6|Експресия на Myo9A и взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин в Myo9AR701X бъбреци и подоцити. (a) Имунофлуоресценцията открива гломерулен Myo9A и подоцин: Myo9A гломерулното имунооцветяване (червено) е силно в бъбреците от див тип (WT), намалява значително в Myo9AR701X/þ гломерулите и не се открива в Myo9AR701X/R701X гломерулите; подоцин (зелен) се локализира в подоцитите при всички мишки; частичната колокализация на подоцит-Myo9A е показана чрез сливане (жълто). Барове=50 mm. (b) Имуноблотинг: интактна Myo9A (280 kDa) експресия намалява до приблизително половината в Myo9AR701X/þ (хетерозиготни [Het]) бъбреци и не се открива в Myo9AR701X/R701X (хомозиготни [Hom]) бъбреци, *по-малки ленти (<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-кратно намаление на експресията на Myo9A от ДНК масив, докладван при диабетни плъхове Zucker.49 Заедно данните за експресията на Myo9A предполагат, че Myo9A може да играе роля в бариерата на гломерулната филтрация.

За да разберем уместността на p.Arg701* MYO9A безсмислена мутация in vivo, ние генерирахме Myo9AR701X нокаутни мишки чрез генно редактиране. Хомозиготни Myo9AR701X/R701X мутанти развиват прогресивна хидроцефалия, водеща до смърт до 3-седмична възраст, подобна на Myo9A-нулевите мишки.14 На 2-седмична възраст хомозиготните Myo9AR701X/R701X бъбреци разкриват тежък гломеруло-тубуларен фенотип: екстензивен FPE, GBM аномалии, и недостиг на прорезни диафрагми и разширени тубули, свързани с албуминурия. Възрастни Myo9A-нулеви мишки са показали проксимална тубулопатия, полиурия и протеинурия с ниско молекулно тегло.15 За съжаление в доклада не са включени гломерулни ултраструктурни данни;15 изненадващо Myo9A на възраст от 3- до 6- месеца -нулевите мишки не са се поддали на прогресивна хидроцефалия, както е описано по-рано.14 Тъй като хомозиготните Myo9AR701X/R701X мутанти не оцеляват до зряла възраст, можем само да установим ранния гломерулен фенотип, описан тук. Тубулната дилатация, наблюдавана при 2-седмични Myo9AR701X/R701X мутанти, може да представлява ранно доказателство за тубулопатията, описана при възрастни Myo9A-нулеви мишки.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-кратно в първични подоцити (c), Western blots, представителни за n=3 до 4 независими експеримента, лизати, събрани от 3 мишки всеки, количествено определяне (средно ± SD), анализ на дисперсията (ANOVA) (a ) или несдвоен t-тест (b,c). *П<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Ключова констатация от това проучване е, че хетерозиготните Myo9AR701X/þ нокаутни мишки са фенотипно нормални при раждането, но развиват албуминурия, FSGS и FPE на подоцитите на 4-месечна възраст, демонстрирайки, че p.Arg701* Myo9A е мутация, причиняваща FSGS в възрастни мишки. Забележително е, че Myo9AR701X/þ хистологичните и ултраструктурните промени на мутантните бъбреци рекапитулират диагностичните характеристики на бъбречната биопсия на пробанда. Освен това, Myo9AR701X/þ мутантните мишки развиват значителна албуминурия, а не масивна албуминурия, възпроизвеждайки ненефротичната протеинурия, наблюдавана при пробандните братя и сестри и при много пациенти с FSGS в зряла възраст.50 Предполага се, че делецията на Myo9A може да причини гломерулна склероза, вторична на полиурична тубулопатия .15 Неконвенционалните миозини са замесени в реабсорбцията на албумин от проксималните тубули чрез техните взаимодействия с Dab2 и кубилин, но участието на Myo9A в този процес не е доказано.51 Не открихме никакви доказателства за тауопатии, като полиурия, тубулна дилатация, атрофия , или анормално разпределение на проксимални или дистални тубулни маркери при възрастни хетерозиготни Myo9AR701X/þ мишки. Тези данни не подкрепят хипотезата, че FSGS, наблюдаван при Myo9AR701X/þ мишки, е резултат от обструкция или тубулни дефекти.

Механично установихме, че Myo9A mRNA и Myo9A протеинът с пълна дължина са намалени с w50 процента, което силно предполага, че мутацията води до Myo9A хаплонедостатъчност поради безсмислено медиирано разпадане на mRNA.42 Тъй като Myo9AR701X точковата мутация се локализира в екзон 14 от 42, Myo9A mRNA регулацията следва стандартни безсмислено-медиирани правила за разпадане на иРНК за съкращаване на мутации, разположени преди последния екзон.42,52 В съответствие с това, хидроцефалия и преждевременна смърт са наблюдавани при хомозиготни Myo9AR701X/R701X мутанти, имитиращи Myo9A нулеви мишки.14 Ние установихме, че w50 процентно намаление на експресията на Myo9A протеин в Myo9AR701X/þ мутантни бъбреци и първични подоцити, както и в Myo9AKD обезсмъртени подоцити намалява пропорционално взаимодействието между Myo9A, актин и калмодулин. Тези констатации подкрепят интерпретацията, че хаплонедостатъчността на Myo9A е основата за намаленото взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин, наблюдавано при Myo9AR701X/þ мутанти.

Критично откритие на тази работа е, че p.Arg701* Myo9A индуцира загуба на Rho-GAP функция, което води до повишен активен RhoA в Myo9AR701X цели бъбреци, изолирани гломерули и първични подоцити. Освен това, Myo9AR701X/þ мутантните подоцити демонстрират RhoA-зависима намалена привързаност и подвижност. Сигнализацията Myo9A-GAP намалява активния RhoA и има малък ефект върху Rac1 и Cdc42.9,53 Загубата на функция на Rho-GAP се увеличаваRho-GTPase активности води до увреждане на подоцитите, протеинурия и FSGS.3,18,20 По този начин, анормалното поведение на Myo9AR701X/þ мутантни подоцити може да допринесе за развитието на FPE и FSGS с течение на времето в Myo9AR701X/þ мишки. Нашите данни са в съответствие с докладвания ефект от дисрегулацията на RhoA върху функцията на подоцитите in vivo и in vitro. 54–56

Тъй като Myo9A кръстосано свързва актина и индуцира образуването на актинови снопове in vitro на редовни 36-nm интервали чрез взаимодействие с актин и калмодулин, стехиометрията на тяхното взаимодействие се смята за решаваща.16 Следователно хаплонедостатъчността на Myo9A е вероятна за намаляване на медиираните от Myo9A кръстосани връзки и снопове на актин, осигурявайки по-малко места по протежение на актинови филаменти, където се случва инактивиране на RhoA, като по този начин се променя динамиката на актина в непосредствена близост и поведението на подоцитите на клетъчно ниво. Свързаният с Rho киназен инхибитор Y27632 частично възстановява дефекта на прикрепване и миграция, индуциран от Myo9AR701X/þ, което предполага, че са включени допълнителни RhoA ефектори надолу по веригата, като mDia1. Алтернативно, намалените напречни връзки на актин в Myo9AR701X/þ могат директно да допринесат за нарушаване на прикрепването и миграцията на подоцитите. Хаплонедостатъчността на Myo9A може също да повлияе на механизмите за трафик. 7–9 Точните молекулярни механизми, чрез които Myo9A регулира динамиката на подоцитния актин, остават да бъдат изяснени. В обобщение, ние идентифицирахме Myo9A като нов компонент на подоцитния цитоскелетен апарат и безсмислена MYO9A мутация, която включва MYO9A като кандидат ген за човешки FSGS, чрез възпроизвеждане на човешката протеинурия/FSGS фенотип в Myo9AR701X/þ knock-in мишки и чрез автозомно доминираща косегрегация на фенотипа в малък род. Взети заедно, данните силно предполагат, че Myo9A хаплонедостатъчността е молекулярната основа за фенотипа, наблюдаван при възрастни Myo9AR701X/þ мишки. Ние демонстрирахме, че прикрепването и миграцията са нарушени в нокин мутантни Myo9AR701X/þ подоцити, включващи както повишена активност на RhoA, така и намалено взаимодействие Myo9A-актин-калмодулин. Като се има предвид, че Myo9A индуцира омрежване и групиране на актин при моларно съотношение 1:116 и нашето наблюдение, че Myo9AR701X/þ води до хаплонедостатъчност, изтриване на подоцити и FSGS извънредно време, ние спекулираме, че Myo9A може да бъде критичен за нормалната динамика на актина на подоцитите, подобно на други актин-свързващи протеини (ACTN4, INF2), за които е известно, че причиняват автозомно доминантен FSGS при възрастни, когато са мутирани. Допълнителни изследвания са оправдани, за да се изясни как Myo9A взаимодейства с подоцитния RhoA, цитоскелетните протеини и протеините на нарязаната диафрагма и дали медиираните от Myo9A дефекти в актиновата кръстосана връзка и образуването на снопове директно променят структурата на цитоскелета на подоцитите. Ограниченията на това изследване за установяване на причинно-следствената връзка включват невъзможността да се разшири родословието на генотипа на пробанд и липсата на допълнителни роднини със същата мутация. Необходими са допълнителни проучвания за валидиране на нашите WES констатации при допълнителни пациенти с фамилна или спорадична FSGS преди p.Arg701*MYO9A вариантможе да се счита за причиняващо заболяване и тази информация може да се използва за вземане на клинични решения.

РАЗКРИВАНЕ

Всички автори декларираха липса на конкуриращи се интереси.

БЛАГОДАРНОСТИ

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства на Националния институт по здравеопазване за AT (NIH-RO1DK109434) и Йейлския център за менделска геномика (NIH-U54-HG006504).

Благодарим на M. Saleem (Университет на Бристол, Обединеното кралство) за предоставянето на обезсмъртени човешки подоцити, G. Moeckel (Yale School of Medicine, Department of Pathology) за предоставяне на биопсични изображения, S. Ishibe Lab (Yale School of Medicine, Department of Medicine/ Нефрология) за съвет относно изолиране на подоцити и анализ на адхезия, Т. Ардито (Медицинско училище Йейл, Катедра по патология) и В. Какаде (Медицинско училище Йейл, Катедра по медицина/нефрология) за принос към IF

и конфокално изобразяване, SueAnn Mentone (Yale School of Medicine, Department of Cell and Molecular Physiology) за принос към изследванията на ЕМ,фокална сегментна гломерулосклерозапациенти и семейства и хранилището на Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания (FSGS-CT, NCT00135811) за предоставяне на ДНК проби.

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителен файл (PDF)

Допълнителни методи. WES и анализ на данни за биоинформатика, генериране на мишки Myo9AR701X, и други подробни методи.

Фигура S1. Immuno-EM локализира експресията на Myo9A към миши гломерулни подоцити и тубуларен епител.

Фигура S2. Myo9AR701X/R701X причинява неонатална прогресивна хидроцефалия.

Фигура S3. Постнатална бъбречна хистология при Myo9AR701X мутантни мишки.

Фигура S4. Тест за миграция на подоцити (тест за рани).

Таблица S1. Списък на всички варианти, споделяни от братя и сестри на пробанд.

Таблица S2. Списък на 64 FSGS-протеинурия-NS гени, разпитани в кохортата FSGS-CT. Допълнителни препратки.

ПРЕПРАТКИ

1. Уигинс RC. Спектърът на подоцитопатиите: обединяващ поглед върху гломерулните заболявания. Kidney Int. 2007; 71: 1205-1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. Едногенна причина в 29,5% от случаите на резистентен на стероиди нефротичен синдром. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. Мутациите на ARHGDIA причиняват нефротичен синдром чрез дефектно сигнализиране на RHO GTPase. J Clin Invest. 2013; 123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. Клониране и развитие на експресия на неконвенционален миозин IXA (MYO9A) ген в региона на синдрома на Bardet-Biedl (BBS4) в хромозома 15q22- q23. Геномика. 1999; 59: 150-160.

5. Bayram Y, Karaca E, Coban Akdemir Z, et al. Молекулярна етиология на артрогрипозата в множество семейства от предимно турски произход. J Clin Invest. 2016; 126: 762-778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS и др. Идентифициране на мутации в гена MYO9A при пациенти с вроден миастеничен синдром. мозък. 2016; 139: 2143-2153.

7. Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Миозини: организация на домейна, двигателни свойства, физиологични роли и клетъчни функции. Handb Exp Pharmacol. 2017; 235: 77-122.

8. Liu KC, Cheney RE. Миозини в клетъчните връзки. Биоархитектура. 2012; 2: 158-170.

9. Omelchenko T, Hall A. Myosin-IXA регулира колективната миграция на епителни клетки чрез насочване на активността на RhoGAP към кръстовища клетка-клетка. Curr Biol. 2012; 22: 278-288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. Пациенти със синдроми на Epstein-Fechtner, дължащи се на мутации на MYH9 R702, развиват прогресивно протеинурично бъбречно заболяване. Kidney Int. 2010; 78: 207-214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R, et al. MYO1E мутации и фамилна фокална сегментна гломерулосклероза в детството. N Engl J Med. 2011; 365: 295-306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T, et al. Разрушаването на миозин 1е насърчава увреждането на подоцитите. J Am Soc Nephrol. 2009; 20: 86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. Клетъчни функции на миозини от клас IX в епителните и имунните клетки. Biochem Soc Trans. 2011; 39: 1166-1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. Миозин IXa регулира епителната диференциация и неговият дефицит води до хидроцефалия. Mol Biol Cell. 2009; 20: 5074-5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarimboli G, et al. RhoGAPмиозин IXa е регулатор на функцията на бъбречните тубули. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 309: F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. Самоорганизиране на актинови мрежи от мономерен миозин. Proc Natl Acad Med US A. 2016; 113: E8387–E8395.

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C, et al. Synaptopodin организира актиновата организация и клетъчната подвижност чрез регулиране на RhoA сигнализиране. Nat Cell Biol. 2006; 8: 485-491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. Роля на Rho-GTPases и техните регулаторни протеини във функцията на гломерулните подоцити. Can J Physiol Pharmacol. 2013; 91: 773-782.

19. Браун EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ и др. Мутациите във формин гена INF2 причиняват фокална сегментна гломерулосклероза. Нат Генет. 2010; 42: 72-76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H, et al. Arhgap24 инактивира Rac1 в миши подоцити и мутантната форма е свързана с фамилна фокална сегментна гломерулосклероза. J Clin Invest. 2011; 121: 4127-4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, et al. Генетична диагностика чрез улавяне на целия екзом и масивно паралелно секвениране на ДНК. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106:19096–19101.

22. Choi M, Scholl UI, Yue P, et al. Мутации на Kþ канал в аденоми, продуциращи адренален алдостерон, и наследствена хипертония. Наука. 2011; 331: 768-772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D, et al. Центровете за менделска геномика: нова широкомащабна инициатива за идентифициране на гените, лежащи в основата на редките менделски състояния. Am J Med Gen. 2012; 158A: 1523–1525.

24. Li H, Durbin R. Бързо и точно подравняване на кратко четене с трансформация на Burrows-Wheeler. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. Инструментариумът за анализ на генома: рамка MapReduce за анализиране на данни за секвениране на ДНК от следващо поколение. Genome Res. 2010; 20: 1297-1303.

26. Yang H, Wang K. Анотация и приоритизиране на геномни варианти с ANNOVAR и wANNOVAR. Nat Protoc. 2015; 10: 1556–1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X, et al. Сравнение и интегриране на методи за прогнозиране на вредност за несинонимични SNV в проучвания за секвениране на цял екзом. Хум Мол Генет. 2015; 24: 2125–2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. SIFT уеб сървър: прогнозиране на ефектите от аминокиселинните замествания върху протеините. Nucleic Acids Res. 2012; 40: W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: прогнозиране на вредността на вариантите в целия човешки геном. Nucleic Acids Res. 2019; 47: D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. Генериране на генетично модифицирани мишки с помощта на CRISPR/Cas-медиирано геномно инженерство. Nat Protoc. 2014; 9: 1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. Свръхекспресията на васкуларен ендотелен растежен фактор на подоцитите (Vegf₁₆₄) причинява тежка нодуларна гломерулосклероза при миши модел на диабет тип 1. Диабетология. 2011; 54: 1227-1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. Индукцията на подоцитна свръхекспресия на VEGF164 в различни етапи на развитие причинява вродена нефроза или резистентен на стероиди нефротичен синдром. Am J Pathol. 2010; 177: 2225-2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T, et al. Свързване на рецептор-медиирана ендоцитоза и клетъчно сигнализиране: доказателства за регулирана интрамембранна протеолиза на мегалин в проксималния тубул. J Biol Chem. 2004; 279: 34302–34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. Рецепторът на васкуларен ендотелен растежен фактор 2 директно взаимодейства с нефрин, свързва VEGF-A сигнали с актин в бъбречните подоцити. J Biol Chem. 2011; 286: 39933–39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H, et al. Подоцит-специфичното усилване на функцията на VEGF-a индуцира нодуларна гломерулосклероза при нулеви мишки на eNOS. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 1814–1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ и др. Излишъкът на подоцитен семафорин-3A води до гломерулно заболяване, включващо взаимодействие на плексинA1-нефрин. Am J Pathol. 2013; 183: 1156–1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM и др. Свързаният с подоцит талин1 е критичен за поддържането на бариерата на гломерулната филтрация. J Clin Invest. 2014; 124: 1098-1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. Подоцитна култура: трикове на търговията. Нефрология (Карлтън). 2012; 17: 525-531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA. Регулиране на малкия GTP-свързващ протеин Rho чрез клетъчна адхезия и цитоскелета. EMBO J. 1999; 18: 578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E, et al. Протеазомното разграждане на Nck1, но не и на Nck2 регулира активирането на RhoA и динамиката на актина. Nat Commun. 2013;4:2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. Клинични характеристики и хистология на нефропатия, свързана с аполипопротеин l1-, в клиничното изпитване на FSGS. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1443–1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. Безсмислено медиирано разпадане на иРНК при хора с един поглед. J Cell Sci. 2016; 129: 461-467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. Насоки за изследване на причинно-следствената връзка на варианти на последователност при заболяване при хора. Природата. 2014; 508: 469-476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Стандарти и насоки за тълкуване на варианти на последователности: съвместна консенсусна препоръка на Американския колеж по медицинска генетика и геномика и Асоциацията за молекулярна патология. Genet Med. 2015; 17: 405-424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, et al. Принос на редки генни варианти към фамилни и спорадични FSGS. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1625-1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, et al. Спектърът на мутационните ограничения е определен количествено от вариации при 141 456 човека. Природата. 2020; 581: 434-443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Автозигома и високопроизводително потвърждение на кандидатурата на болестни гени. Genet Med. 2019; 21: 736-742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. Дефицитът на MYO9A в моторните неврони е свързан с намалена невромускулна секреция на агрин. Хум Мол Генет. 2018; 27: 1434–1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémánt N, et al. Метаболитният синдром влияе върху модела на експресия на сърдечен ген на ниво транскрипт при мъжки ZDF плъхове. Кардиоваск Диабетол. 2013;12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, et al. Клиничен и патологичен фенотип на генетични причини за фокална сегментна гломерулосклероза при възрастни. Clin Kidney J. 2018; 11: 179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. Рецептор-медиирана ендоцитоза в проксималния тубул. Annu Rev Physiol. 2017; 79: 425-448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC, et al. Фамилна хаплонедостатъчност на глюкокортикоидния рецептор чрез несмислено медиирано разпадане на иРНК, надбъбречна хиперплазия и явен минералкортикоиден излишък. PLoS One. 2010;5. e13563.

53. Yi F, Kong R, Ren J, et al. Неканоничният Myo9b-RhoGAP ускорява хидролизата на RhoA GTP чрез механизъм с двоен аргинин-пръст. J Mol Biol. 2016; 428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billing D, et al. Антагонистична регулация на динамиката на актина и клетъчната подвижност чрез TRPC5 и TRPC6 канали. Научен сигнал. 2010;26:3. ra77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA и др. Механизми на протеинурията, индуцирана от Rho GTPases. Kidney Int. 2012; 81: 1075-1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocyte GTPases регулират динамиката на бъбречния филтър. Kidney Int. 2012; 81: 1053-1055.

57. Cory G. Анализ на надраскване. Методи Mol Biol. 2011; 769: 25-30.

Kidney International (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

Авторско право ª 2021, Международно дружество по нефрология. Публикувано от Elsevier Inc. Това е статия с отворен достъп под лиценз CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Кореспонденция: Алда Туфро, Катедра по педиатрия/нефрология, Медицински факултет на Йейлския университет, 333 Cedar Street, Ню Хейвън, Кънектикът 06520, САЩ. E-mail: alda.tufro@yale.edu 6 Текуща принадлежност: Нефрология, Детска национална болница, Вашингтон, окръг Колумбия, САЩ. 7 Текуща принадлежност: Нефрология, Болница за болни деца, Университет на Торонто, Торонто, Онтарио, Канада. Получено на 21 май 2020 г.; ревизиран на 4 декември 2020 г.; приет на 10 декември 2020 г.; публикувано онлайн на 4 януари 2021 г