Госипитрин, естествено срещащ се флавоноид, отслабва индуцираното от желязо невронно и митохондриално увреждане, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Нарушаването на желязната хомеостаза е важен фактор за загубата на митохондриална функция в нервните клетки, което води до невродегенерация. Тук ние оценихме защитното действие на госипитрин (Gos), естествено срещащ се флавоноид, върху индуцирано от желязо увреждане на невронни клетки, използвайки миши хипокампални HT-22 клетки и митохондрии, изолирани от мозъци на плъхове. Gos успя да спаси клетките HT22 от увреждането, предизвикано от 100 uM Fe()-цитрат (EC50 8.6 uM). Тази защита е свързана с предотвратяването както на индуцираното от желязо разсейване на потенциала на митохондриалната мембрана, така и на изчерпването на АТФ. В изолирани митохондрии Gos (50uM) предизвиква почти пълна защита срещу индуцирано от желязо митохондриално подуване, загуба на митохондриален трансмембранен потенциал и изчерпване на АТФ. Gos също предотвратява индуцираната от Fe(Ⅱ)-цитрат митохондриална липидна пероксидация със стойност ICs0 （12,45 μM）, която е около девет пъти по-ниска от тази за индуцираната от терт-бутил хидропероксидокисление. Освен това, флавоноидът е ефективен при инхибиране на разграждането както на 15, така и на 1,5 mM 2-дезоксирибоза. Той също така намалява концентрацията на Fe(II) с времето, като същевременно увеличава скоростта на потребление на O2 и нарушава редуцирането на Fe(II) от аскорбат. Комплексите Gos-Fe(I) бяха открити чрез UV-VIS и IR спектроскопия, с очевидна стехиометрия на Gos-желязо 2:1. Резултатите предполагат, че Gos обикновено не действа като класически антиоксидант, но влияе директно на желязото, като го поддържа в неговата форма на желязо след стимулиране на Fe(II) окислението. Поради това металните йони не биха могли да участват в реакция тип Fenton и фазата на разпространение на липидната пероксидация. Следователно Gos може да се използва за лечение на невронни заболявания, свързани с индуциран от желязо оксидативен стрес и митохондриално увреждане.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи: госипитрин; желязо; HT-22 клетки; митохондриите;невродегенерация; невропротекция

1. Въведение

Желязото е основен кофактор в много важни биологични процеси като синтез и възстановяване на ДНК, транспорт на кислород, клетъчно дишане, ксенобиотичен метаболизъм и синтез на хормони [1. Въпреки това, при високи вътреклетъчни нива, той може да увеличи клетъчните реактивни кислородни видове с модификация на клетъчния редокс потенциал [2,3]. Желязната дисхомеостаза се наблюдава при почти всяко неврологично състояние като болестта на Паркинсон (PD), болестта на Алцхаймер (AD), болестта на Huntington (HD), множествена склероза, атаксия на Friedreich, епилепсия, синдром на неспокойните крака и инсулт [4,5]. По-специално, при интрацеребрален кръвоизлив, при който има разкъсване на микроваскулатурите и освободената кръв предизвиква излагане на неврални клетки на получено от кръвта желязо, основните механизми на невродегенерация са индуцирано от желязо и хем производство на ROS, възпаление и екситотоксичност [6 ,7]. In vitro и in vivo експериментални модели на мозъчен кръвоизлив показват наличието на фероптоза, зависима от желязото форма на регулирана некроза [8]. Освен това нарастващите доказателства сочат, че нарушаването на хомеостазата на желязото е от съществено значение за загубата на митохондриална функция в нервните клетки [9,10], което от своя страна може да доведе до невродегенерация [11-14. Наскоро беше съобщено за връзка между ранната форма на болестта на Паркинсон с нарушена регулация на метаболизма на желязото и митохондриалното увреждане [15]. Съвместното съществуване на относително високи количества както желязо, така и ROS в митохондриалните отделения прави този органел податлив на увреждане, медиирано от хидроксилни радикали. Следователно фармакологичните агенти, насочени към регулиране на желязото в мозъка и медиирано от желязо митохондриално увреждане, могат да бъдат терапевтично полезни срещу невродегенерация. Установено е, че няколко хелатиращи желязо агенти проявяват невропротективни действия в различни експериментални модели [16-19]. От друга страна, има много доклади за невропротективния потенциал на естествено срещащите се полифеноли, дължащи се на техните антиоксидантни действия, базирани на комбинация от хелатиране на желязото и дейности по улавяне на свободните радикали [20,21]. Нашата група забеляза, че катехол-съдържащи полифеноли като мангиферин, гутиферон-А и рапанон взаимодействат с желязото, както in vitro, така и in vivo, като по този начин анулират неговата каталитична роля в насърчаването на ROS [22-28]. Наскоро съобщихме и за мощните антиоксидантни ефекти на госипитрин (Gos), естествено срещащ се флавоноид (Фигура 1), което показва потенциалната му употреба като невропротективно средство [29]. Въпреки това, малко се знае за механизмите, включени в тези антиоксидантни ефекти. Наличието на планарна шестчленна циклична система с електронна делокализация, катехолна част и още три ароматни хидроксилни групи (две от тях съседни на карбонилна група), силно предполагат, че тази молекула може да действа като желязо-хелиращ агент, тъй като тези са структурни характеристики, които благоприятстват хелатирането на желязо от флавоноиди 30]. Следователно целта на това проучване е да се оцени способността на Gos да защитава HT-22невронни клеткии изолирани митохондрии на мозъка на плъх от медиирани от желязооксидативно увреждане. Бяха проведени други изследвания в системи без клетки/митохондрии, за да се характеризира допълнително природата на взаимодействието Gos-iron.

2. Резултати

2.1. Gos спасява HT-22 клетки от Fe(I)-индуцирана клетъчна смърт

Fe（II）（100 μM） намалява преживяемостта на клетките HT-22 до 17,4 процента след 24 часа експозиция, както е изчислено чрез MTT анализ. Gos предотвратява смъртта на хипокампалните клетки по дозозависим начин. EC50 беше 8,64± 1,58 μM（Фигура 2A, вмъкване）. Пълна клетъчна защита се наблюдава при 100 μM Gos е по-ефективен от Trolox（500 uM）, добре познатият водоразтворим антиоксидант, който предотвратява клетъчната смърт със 74 процента.

Излагането на HT-22 на желязо в продължение на 2 часа (преди екзекуцията на клетъчна смърт) предизвиква разсейване на потенциала на митохондриалната мембрана, както се оценява чрез задържането на родамин 123 в органелите (Фигура 2B) и изчерпване на АТФ (Фигура 2C ). Това предполага възможна връзка между медиираните от желязо ефекти върху митохондриите и жизнеспособността на клетките. Gos предотврати индуцираното от желязо дозозависимо увреждане на митохондриите, следвайки моделите на жизнеспособност на невроните, което показа, че може да предотврати индуцираната от желязо HT-22 клетъчна смърт чрез митохондриална защита.

Фигура 2. Защита на Gos срещу индуцирано от желязо увреждане на невронни клетки. Ефекти на Gos върху преживяемостта на HT-22 миши хипокампален неврон (A), потенциала на клетъчната митохондриална мембрана (B) и клетъчните нива на АТФ（C）. Gos（0-100 μM） или Trolox（500 μM） се инкубират съвместно за 24 часа ；жизнеспособност） или 2 часа （митохондриален мембранен потенциал и нива на АТФ） със 100 μM FeCl2/ 1 mM цитрат. Условията на анализа са описани в раздел 4. Повредените контролни клетки (без Gos) съдържат DMSO (0,001 процента) плюс сместа желязо-цитрат. Резултатите се изразяват като процент на клетъчна смърт по отношение на неувредената контрола (съдържаща DMSO 0,001 процента като носител). Стойностите са средните стойности ± SD от три различни експеримента. Различните символи показват статистически разлики на p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Cistanche може да подобри имунитета

2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μM） показва, че е по-ефективен за предотвратяване на липидна пероксидация, предизвикана от желязо, отколкото липидна пероксидация, предизвикана от пероксил, което предполага способността му да действа директно върху желязото (Фигура 3B).

Фигура 3. Gos инхибира образуването на малондиалдехид в митохондриите, индуцирано от 50 uM Fe()-цитрат（A） или 300 μM tert-бутил хидропероксид（B）. Митохондриите от мозъка на плъх (1 mg/mL) се инкубират в реакционна среда, съдържаща 125 mM захароза, 65 mM KCl, 10 mM HEPES буфер (pH 7,4), 2 mM сукцинат и 2,5 uM ротенон, със или без Gos(1-50 uM). Експериментите започнаха с добавянето на 50 μM Fe（II） или 300 μM tert-бутил хидропероксид, с изключение на неувредената контрола (сиви ленти). Инкубационният период е 20 минути при 28 градуса С. Стойностите са средните ±SD (n=6). Различните символи показват статистически разлики на p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3. Gos предотвратява медиираното от желязо разсейване на митохондриалното подуване и изчерпването на АТФ

Фигура 4A показва, че 50μM Fe（I）-цитратен комплекс предизвиква митохондриално подуване, изразено чрез намаляване на абсорбцията при 540nm (линия f спрямо линия a). Това беше свързано със спонтанна и пълна △Y деполяризация (Фигура 4B, линия f срещу линия a) и изчерпване на АТФ (Фигура 4C, колона Fe()/цитрат). Gos инхибира предизвикания от желязо процес на набъбване и разсейване на AY по начин, зависим от концентрацията (Фигура 4A, B линии be). Стойностите на абсорбцията (средно ± SD на 7 мин.) от Панел А бяха: 0.482±0.013 (линия a), 0.459± { {23}}.011 (ред b),0.445± 0.007 (ред c),0,435± 0,015( линия d), 0.360±0.011(линия e) и 0.338±0.012(линия f). Стойностите на флуоресценция от панел B (средно ± SD на 7 min) са 15,03±1,71 (линия a), 19,41±2,07 (линия b), 22,29±2,58 (линия c), 45,505±4,47 (линия d), 118,468±5,76 (линия e) и 146.201±5.83 (линия f). Намерени са статистически значими разлики между линия f и другите линии, при p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Фигура 4. (A) Индукция на прехода на митохондриалната пропускливост, (B) загуба на потенциал на митохондриалната мембрана (AH) и (C) намаляване на нивата на АТФ, предизвикано от 50 μM Fe (II) -цитрат. A беше оценено с помощта на флуоресцентна сонда сафранин (5 uM). Инхибиторните ефекти на Gos 50, 25, 10 и 1 μM са показани съответно в редове (b), (c), (d) и (e). Линии (a) и (f) представляват съответно неповредени контроли (без желязо) и повредени контроли (без Gos). Митохондриите на мозъка на плъх (RBM-0.5 mg/mL), Fe（II） и 1 μM CCCP бяха добавени, където е показано със стрелките. Различните символи в графиката（C）указват статистически разлики atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos предизвиква автоокисление на Fe(II)-цитрат и консумация на O,

Gos намалява концентрацията на Fe() (1-min преинкубация) в реакционна среда, съдържаща 2 mM цитрат (без митохондрии) по дозозависим начин (Фигура 5A, черни кръгове). A 5-min период на преинкубация (Фигура 5A, червени кутии) намалява още повече концентрацията на Fe(II). Gos също повишава скоростта на потребление на O2, вероятно поради окисление на Fe(ll) до Fe(ⅡII) (Фигура 5B,C). Тези резултати предполагат, че Gos може да премахва Fe(II) от цитратния комплекс и да го окислява до желязна форма в процес, който изисква O2 като акцептор на електрони. Съответно, Gos може да възпрепятства образуването на "OH радикали чрез инактивиране на Fe(Il), необходим за реакцията от типа на Fenton-Haber-Weiss, която може да инициира липидната пероксидация на митохондриалната мембрана.

Фигура 5. (A)Gos стимулира Fe(Ⅲl) автоокисление в отсъствието на митохондрии в мозъка на плъх в стандартна среда, допълнена с 1 mM цитрат и 5 mM1,10-фенантролин.1,10-фенантролинът е добавен 1 или 5 минути след инкубационния период на Gos-Fe(II) и абсорбцията се отчита при 510 nm. Стойностите са средните от три определяния. * статистическа разлика на стр<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Тази статия е извлечена от Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules