Госипитрин, естествено срещащ се флавоноид, отслабва индуцираното от желязо невронно и митохондриално увреждане, част 3

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

4. Материали и методи 4.1. Реактиви

Всички реагенти са получени от Sigma-Aldrich Corp. (Сейнт Луис, МО, САЩ). Основните разтвори на Gos се приготвят в DMSO и се добавят към клетъчните култури или митохондриалните препарати при разреждания 1/1000 (o/o).

Моля, щракнете тук, за да научите повече

4.2. Растителен материал

Растителни материали (цветя) от Talipariti elatum (Sw.) (Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) бяха събрани през март 2020 г. от околните райони на Центъра за изследване и биологична оценка, Институт по фармацевтични и хранителни науки, La Lisa , Хавана, Куба. Те бяха удостоверени от специалисти от хербариите на университета в Камагуей „Ignacio Agramonte Loynaz“, където бяха депозирани ваучерни образци: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche може да подобри имунитета

4.3. Екстракт и подготовка на пробите

Theетанолекстракти са приготвени от червените цветя на Telatum, както беше съобщено по-рано [29]. След ротационно изпаряване твърдите вещества се пречистват чрез процедури за повторна кристализация [29]. Изолираните съединения се характеризират с помощта на 1D 'Н (400 MHz) и 13C (100 MHz) NMR. Обработката на NMR данни беше извършена със софтуера MestReNova версия 6.1.0-6224 за Windows (допълнителни материали, фигури S1-S3). NMR данните, събрани от Gos, бяха сравнени с предишни резултати [56].

4.4. UV/Vis и IR спектроскопски изследвания

UV/Vis спектрите се извършват в кварцови кювети с дължина на оптичния път 10 mm и абсорбцията се записва в UV-VisспектрофотометърUltrospec 2100 Pro от Amersham BioSci (Little Chalfont, Обединеното кралство), свързан към компютър с Wave Scan Software (SWIFT I, 1.2) при стайна температура. Взаимодействието между Gos и йони на желязо се измерва чрез наблюдение на промените в UV/Vis спектъра. Методът на Джоб беше използван за определяне на стехиометричното съотношение между Gos и Fe(II) йона. Изходните разтвори на Gos и Fe(lI) се приготвят ежедневно в метанол и фосфатен буфер, съответно. IR спектрите бяха записани на спектрометър JASCO FI/IR-440 в диапазона от 4000-400 cm-I, като се използваха пелети от калиев бромид за приготвяне на пробите.

4.5. Клетъчни култури

МишкахипокампаленHT-22 клетки (ATCC) се култивират в среда DMEM, допълнена с 10 процента FCS, L-глутамин (1 mM) и пеницилин/стрептомицин (1 процент) и се поддържат при 37 градуса в овлажнен 5 процента CO2 инкубатор. Клетките (2 × 104 клетки/ямка) се посяват в 96-плаки с ямки（Nunc, Roskilde, Дания） в 200 μL културална среда за 24 часа при 37°C.

4.6. Индукция на клетъчно оксидативно увреждане и лечение с Gos

Невропротективното действие на Gos （0.001-100 μM） беше тествано върху HT-22 чрез съвместна инкубация за 24 часа с Gos или Trolox（500 μM）, FeCl2 （100 μM） и цитрат（1 mM）. След 24 часа клетъчният супернатант се отстранява и клетъчната жизнеспособност се измерва чрез [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиев бромид] (MTT) колориметричен анализ.

4.7. Анализ на клетъчната жизнеспособност

След третирането клетките (2 × 104) се инкубират с 10 uM МТТ в продължение на 3 часа при 37°С. След това оцветеното MTT производно се разтваря в 50 μL DMSO и абсорбцията се отчита при 570 nm на четец на микроплаки (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Германия). Клетъчната жизнеспособност се изразява като процент спрямо контрола на нетретирани клетки.

4.8. Анализ на потенциала на митохондриалната мембрана (△Y) в HT-22 клетки

Митохондриалнамембранният потенциал беше оценен въз основа на клетъчното задържане на флуоресцентната катионна проба родамин 123 [57,58]. След 2 часа увреждане с желязо/аскорбат в отсъствие （контрол） или присъствие на Gos （0.001-100 μM） или Trolox（500 μM）, невронните клетки （2 ×10*）се инкубират 10 минути с 1 μM родамин 123. След центрофугиране и ресуспендиране в 1 mL от 0,1 процента Triton X-100, концентрацията на пробата се определя в супернатанта с помощта на четец за микроплаки (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ортенберг, Германия) при двойката дължина на вълната възбуждане/излъчване 505/535 nm. Данните са изразени като проценти спрямо контрола на нетретирани клетки.

4.9. Анализ на ATP

Клетъчният АТФ се определя от системата за анализ на луциферин/луцифераза на светулка [59] при същите условия като AY. Биолуминесценцията се измерва с комплект за анализ на Sigma-Aldrich съгласно инструкциите на производителя, като се използва опцията за луминесценция на четеца на микроплаки (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Германия).

4.10.Животни

Мъжки плъхове Wistar (200 g) бяха получени от Центъра за производство на лабораторни животни (CENPALAB според неговия испански акроним, Хавана, Куба) и бяха настанени в съоръжението за грижи за животни за 1 седмица преди експериментите при температура- контролирана среда (22-24 градуса), с 12-h цикъл светло/тъмно и с достъп до храна и вода ad libitum.

4.11. Митохондриална изолация

Митохондриите на предния мозък на плъх се изолират чрез диференциално центрофугиране, както е описано по-рано [60]. Дигитонин 10 процента беше използван за разрушаване на синаптозомите и получаване на смес от несинаптозомни плюс синаптозомни митохондрии. Цялата процедура се проведе при 4 градуса. Съотношението на респираторния контрол (дихателна честота на състояние 3/състояние 4) винаги е било в диапазона от 4,5 до 6,0, измерено при използване на 5 тМ сукцинат като субстрат.

4.12. Митохондриални анализи за непрекъснато наблюдение

Потенциалът на митохондриалната мембрана се определя спектрофлуориметрично, като се използва 10 μM сафранин O като сонда 【58,61】 в четец на микроплаки （FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ортенберг, Германия) при 495/586 nm дължини на вълната на възбуждане/емисия; тези анализи бяха извършени в присъствието на 0.1 mM EGTA и 2 mM K, HPOA. Набъбването на митохондриите се оценява спектрофотометрично от намаляването на видимата абсорбция при 540 nm. За анализите митохондриите се енергизират с 5 mM калиев сукцинат (плюс 2,5 uM ротенон) в стандартна среда, състояща се от 125 mM захароза, 65 mM KC и 10 mM HEPES-KOH, рН 7,4, при 30 градуса.

4.13. Тестове за липидна пероксидация

Липидната пероксидация се оценява от генерирането на малондиалдехид (MDA) [28,62]. Митохондриите (1 mg/mL) бяха изложени на 4 mM tert-бутилхидропероксид или 50uM Fe(II) плюс 1 mM натриев цитрат при 37 градуса C. Концентрацията на MDA беше изчислена чрез използване на неговия коефициент на екстинкция (c =1). 56×105 M-1.cm-1).

4.14. Определяне на концентрацията на Fe(II).

Концентрацията на Fe(ⅡI) се определя в 10 mM фосфатен буфер рН 6,5 (2 mL) чрез образуването на червен комплекс с 1,10-фенантролин (5 mM), както е описано по-рано [24,28].

4.15. Мониторинг на консумацията на кислород

Консумацията на O, свързана с окислението на Fe(ⅡI), се измерва с електрод тип Clark (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) в стъклена камера от 1.{2}} ml, оборудвана с магнитна бъркалка, при 30 градуса. Скоростта на консумация на кислород (ROC) се изразява като nmol O2/mL за минута.

4.16.2-Анализ на окисление на дезоксирибоза

Образуването на хидроксилни ("OH) радикали беше оценено чрез проследяване на 2-разграждането на дезоксирибозата до MDA, което беше изчислено от нейния коефициент на екстинкция (e=1.56×10 градуса M-1· cm-), както беше съобщено по-рано [26,27].

4.17. Откриване на Gos-Fe(II) комплекси

Fe（ⅡI）（FeCl,0.4-1.6 μM） се добавя към 2 mL（10 mM）фосфатен буфер（pH 6,5）, съдържащ 2 mM цитрат и 1,6 μM Gos. Сканиране на дължина на вълната от 200-600 nm беше извършено в спектрофотометър Hitachi 2001 (Hitachi, Токио), при 28 градуса.

4.18. Статистически анализ

Използван е GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от posthoc тест на Student-Newman-Keuls за сравнения по двойки. Резултати с p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Допълнителни материали: Следните са достъпни онлайн. Фигура S1:1H-NMR (400 MHz) спектър на госипитрин в DMSO-do, Фигура S2:13C-NMR (101 MHz) спектър на госипитрин в DMSO-d, Фигура S3: HSQC спектър на госипитрин в DMSO-dg. Таблица S1: 'H (400 MHz) и 13C (100 MHz) данни за госипитрин спрямо предишния доклад.

Авторски принос:Концептуализация, G.LP.-A.; методология, MAB-V., RFD, YM-P.и GLP-A.; валидиране, MAB-V., JM-P., YM-P и RFD; формален анализ, YM-P, JM-P, RF-A. и GLP-A.; разследване, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFD и GLP-A.; Подреждане на данни, MAB-V.YM.-PJM-P.и RF-A.; писане—изготвяне на оригинална чернова, MAB-V.; писане—преглед и редакция, IM.-P, RF-A., YM-P и GLP-A.; визуализация, YM-P. и GLP-A.; надзор, GLP-A.; придобиване на финансиране, GLP-A. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Това изследване е финансирано от VLIR (Белгия); грант номер CU2018TEA457A103 и от Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Куба); номер на разрешение PN223LH010-035. APC е финансиран от VLIR (Белгия); номер на безвъзмездна помощ CU2018TEA457A103.

Изявление на институционалния съвет за преглед:Проучването е проведено в съответствие с насоките на Декларацията от Хелзинки и одобрено от Комитета по институционална етика от Института по фармацевтични и хранителни науки, Университет на Хавана, Куба (код на протокола IFAL-CEI 087-2019, октомври 2019 г.) .

Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо. Изявление за наличност на данни: Не е приложимо.

Благодарности:Тази работа беше частично подкрепена от проект CU2018TEA457A103 на Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Белгия/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Куба, който също покри таксите за обработка на статиите, и от проект PN223LH010-035 от „Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Куба), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Наличност на проби: Мостри от съединенията са налични от съответния автор.