Пиноцембрин облекчава постинфарктната сърдечна недостатъчност чрез активиране на Nrf2/HO-1 сигнален път, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Статистически анализ

променливите бяха представени като средна ± стандартна грешка, докато пропорционалните променливи бяха показани като процент. Сравненията във всички групи бяха извършени чрез използване на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), коригиран от Tukey post hoc тест, с изключение на тези в ехокардиографските данни, които бяха анализирани чрез двупосочен ANOVA, коригиран чрез теста за най-малка значима разлика на Fisher. Стойност p<0.5 was="" defined="" as="" statistical="">

Резултати Pino облекчи индуцираното от HF влошаване на сърдечните функции Първоначално внедрихме ехокардиография, за да определим установяването на фенотипа на HF, индуцирано от LAD лигиране и ефектите, упражнявани от Pino върху сърдечните функции. Представителни двуизмерни ехокардиограми в М-режим във всички групи бяха илюстрирани на Фиг. 2A.6-едноседмичното хранене без изхвърляне след LAD лигиране доведе до значителни HF прояви, доказани от намаляване на LVEF и FS и увеличаване на LVIDs, LVIDd, LVESV, LVEDV съответно на 6-та и 8-ма седмица спрямо фиктивната група, в допълнение към повишената серумна концентрация на BNP и сърдечно тегло/дължина на пищяла на 8-ма седмица, което демонстрира сърдечна дисфункция и хипертрофия (Фигура 2B, C), със специфичните параметри , са илюстрирани в таблица 1). Въпреки това, всички прояви бяха частично обърнати чрез прилагане на Pino спрямо HF група на 8-та седмица, което предполага благоприятната роля на Pino върху сърдечните функции

след PIHF. Освен това беше забележимо, че въпреки че Pino промени базовите сърдечни функции на 6-та седмица в посока на подобрение, промените не достигнаха значимост. Поради това беше изложено предположение, че дали дългосрочното приложение на Pino е в състояние да доведе до забележими подобрения, което се нуждае от допълнителни изследвания.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Pino отслабва ремоделирането на PIHF Като се има предвид, че регенеративният капацитет на кардиомиоцитите е оскъден или липсва, подобренията на сърдечните функции се приписват повече на подобряването на живите кардиомиоцити и тъкани от Pino, отколкото на регенерацията на кардиомиоцитите. По този начин ние допълнително оценихме 3 ключови фактора в ремоделирането на PIHF: фиброза, неоваскуларизация и апоптоза, както беше предложено по-рано (Wang et al 2010). Pino драстично намалява отлагането на колагенови влакна в граничната зона на MI с приблизително 2 пъти (Фигура 3A). Освен това, за да се избегне изкуственото отклонение в преценката на граничната зона на инфаркта, ние създадохме идентичен модел като положителна контрола, в която Пино беше заменен от еналаприл, инхибитор на ангиотензин-конвертиращия ензим (ACEI), известен с обратното ремоделиране на СН. Наблюдавахме степента на фиброза при HF и ACEI групите.

достигна приблизителен процент спрямо предварително установени модели. Ние също маркирахме инфарктната област, където огромен депозиран колаген замести миокарда (Допълнителен файл 1: Фигура S1). Освен това, Pino компенсира хронично индуцирано от HF разреждане на разпределението и експресията на VEGFR2 (Фигура 3B). Предишни проучвания разкриха, че протеинът p53, който може да активира разнообразие от проапоптотични гени, играе ключова роля в антиангиогенезата чрез инхибиране на индуцируемия от хипоксия фактор-1 (HIF-la) (Gogirajuet al.2019; Guo et al. .2015). След това наблюдавахме свръхекспресия на p53 протеин в HF групата, която беше противодействана от Pino (фиг. 3C), отчасти отчитайки промяната на VEGFR2. Проведохме и Western blot експеримент, при който прилагането на Pino повишава експресията на антиапоптотичния протеин BCL-2 и, за разлика от това, регулира надолу проапоптозните протеини, включително p53, Bax и разцепената каспаза-3, заедно с повишено съотношение bcl-2/bax спрямо HF групата, което показва активиране на процедурата на апоптоза, което също беше потвърдено от теста TUNEL, където Pino демонстрира обратен ефект върху скоростта на апоптоза (фиг. 3D). В заключение Pino се подобри ремоделирането след МИ чрез неговите добре известни ефекти, включително антифиброза, ангиогенеза и антиапоптоза.

Cistanche може да подобри имунитета

Pino облекчава OS чрез модулиране на пътищата Nrf2/HO -1 Въпреки това, механизмите, чрез които Pino води до такива промени, остават недефинирани. Натрупващите се проучвания показват, че OS, която модифицира голямо разнообразие от молекули и задейства неблагоприятни сигнални пътища за ремоделиране, е в състояние да доведе до апоптоза и фиброза в HF модели (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Wang et al.2010 ; Chen et al.2020b), по този начин предположихме, че Pino е подобрил PIHF чрез смекчаване на OS. Първо изследвахме генерирането на ROS в сърдечните тъкани, както и SOD и MDA в серума чрез флуоресцентни и биохимични тестове, съответно, за да определим антиоксидантните роли на Pino при HF. В очакване Pino частично изчисти ROS, генерирани от хронични

HF, проявяващо се чрез намаляване на интензитета на флуоресценция на DHE (фиг. 4A, B). Нещо повече, антиоксидантният ензим, SOD, беше регулиран нагоре чрез прилагане на Pino, докато MDA, предполагащ липидна пероксидация, беше намален (Фигура 4B). Горните данни свидетелстват за антиоксидантната роля на Pino в модел на PIHF при гризачи.

Въпреки че ефектът на пречистване на ROS на Pino беше сигурен, механизмите, които стоят в основата на усилването на антиоксидантната защита, все още изискваха изясняване. Nrf2 е доминиращ компонент на ендогенната антиоксидантна защита, който се дисоциира със своя инхибитор Kelch-lick ECH-асоцииран протеин 1 (Keapl) при стрес/стимули и се премества в ядрото, за да се свърже с промоторната област на елемента на антиоксидантен отговор (ARE), улеснявайки експресията на множество антиоксидантни гени и ензими, сред които HO-1 е представителният ензим и има жизненоважна роля (Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019; Velusamy et al. 2020 ; Tian et al.2019). HO-1, кодиран от HMOX1, катализира хема за разграждане до 3 антиоксидантни молекули, включително биливердин, билирубин и въглероден оксид (CO) (Wang et al.2010; Kishimoto et al.2019). Предишни проучвания показват, че специфичното активиране или свръхекспресия на Nrf2 или HO-1 подобрява PIHF (Ma et al.2019; Bubb et al.2017; Wang et al.2010), а от друга страна, Pino може да се съсредоточи върху пътят на Nrf2/ARE за упражняване на защитни ефекти върху депресия (Wang et al. 2020), невротоксичност (Jin et al. 2015) и т.н., като взаимодействието не е дефинирано в PIHF модел. Допълнително изследвахме това взаимодействие чрез Western blot. PIHF допринесе за намаляването на експресията на цялостния Nrf2 и HO-1 спрямо фиктивната група. И Pino значително обърна този пагубен ефект чрез регулиране нагоре на Nrf2 в допълнение към капацитета за увеличаване на експресията на HO-1 при силно предразположение, въпреки че разликата не достигна значимост (p=0.0845; Фиг.4C ). Резултатите показват ролята на Pino в активирането на пътя Nrf2/HO-1, отговорен за подобряването на сърдечните функции и ремоделирането при PIHF.

In vitro блокадата на Nrf2 елиминира ефектите на Pino в H9c2 кардиомиоцитите

За по-нататъшно доказване, че ефектите на Pino са зависими от пътя на Nrf2/HO-1, а не от интегрално подобрение на патологичния статус на СН, ние култивирахме H9c2 кардиомиоцити според описаните по-рано методи и използвахме специфичен инхибитор на Nrf2, ML385 in vitro. Pino отслабва индуцираното от ISO натрупване на ROS заедно с увеличаване на SOD и намаляване на MDA в средата в подобен модел на отговор като тези in vivo (фиг. 5). Въпреки това, всички ефекти бяха почти отменени от прилагането на ML385, което предполага, че антиоксидантният ефект на Pino е представен предимно чрез активиране на Nrf2. Освен това този път на Nrf2/HO-1 зависи

ефектът беше допълнително определен поради намаляването на експресията на Nrf2 и HO-1 в групата ISO плюс Pino плюс ML385 (Фигура 6). Също така беше забележимо, че способността на ROS почистване на Pino намаля, тъй като ефикасността на Nrf2 беше представена главно от оксидантна защита. Възможно обяснение за това явление е, че дисбалансът на редокс хомеостазата генерира прекомерни ROS извън максималната способност за почистване от 25 uM Pino.

Впоследствие направихме H9c2 кардиомиоцитен Western blot, за да изследваме дисбаланса на редокс

хомеостазата в резултат на ML385 е отговорна за увеличената чувствителност към ремоделиране. Прилагането на Pino показва паралелни ефекти при антифиброза, антиапоптоза, доказани от намаляване на колаген I, p53, Bax, разцепена каспаза-3, както и повишаване на BCL-2 (фиг.6A). , B). Освен това, CCK-8 предполага инхибиране на активността на CMFs от Pino, с намаляване на секрецията на колаген, което се наблюдава чрез Western blot на CMFs. В допълнение, обръщането на всички тези презентации от ML385 in vitro допълнително демонстрира, че Nrf2/HO-1 е основната цел на Pino при подобряването на PIHE.

Дискусия

В настоящото проучване установихме, че лечението с Pino е полезно за PIHF чрез антиоксидантните ефекти. Pino подобрява сърдечните функции и ремоделирането в резултат на PIHF чрез изчистване на ROS и активиране на пътя на Nrf2/HO-1, което допълнително отслабва ключовите фактори на вентрикуларното ремоделиране, включително отлагане на колагенови влакна и апоптоза, и улеснява неоваскуларизацията при понижаване на регулацията на протеин p53- зависим начин.

Антиоксиданти И HF

Представен е консенсус, че ОС влошава дисфункцията и ремоделирането при HF (Galli and Lombardi 2016; Dubois-Deruy et al. 2020; Velusamy et al, 2020; Tian et al. 2019; Kishimoto et al. 2019), има също редица на експерименти и изпитания, изпълнени за ефектите на антиоксидантите, с които са открити и изследвани все повече и повече молекулярни цели и нови лекарства. Въпреки това, в допълнение към няколко антиоксиданта, тествани в клинични проучвания, които предразполагат да покажат невалидност или дори повишен риск от HF (Lee et al. 2005; Made et al. 2015; Olesen et al. 2014; Lonn et al. 2005), многобройни молекулярни мишени, като кинази, микроРНК (Tian et al.2020; Vagnozziet al.2013; Pfister et al. 2014) и т.н., имат много трудности при прехвърлянето на пръстена от основни експерименти към изпитания и дори клинично приложение поради за производството и безопасността.

За разлика от това, Pino има следните предимства, обещаващи да бъдат спомагателен антиоксидант в терапията на HF: (i) значителна антиоксидантна ефикасност, която е доказана в предишни проучвания и настоящите ни изследвания; (ii) Pino може да бъде извлечен от редица естествени растения, мед и прополис или да бъдат изкуствено синтезирани, което осигурява достатъчно за производство и относително евтина цена; (ii) богатството на Pino в мед и прополис показва диетично усвояване за удобство. Всъщност е проведено скорошно клинично изпитване от фаза I за осигуряване на Pino за здрави индивиди, където Pino показва добра поносимост и безопасност (Cao et al. 2015). В допълнение, Pino е одобрен за терапия на исхемичен инсулт от Китайската администрация по храните и лекарствата с прилагане на клинично изпитване фаза II (Shen et al. 2019). Този постигнат напредък ни кара да очакваме по-нататъшно приложение на Pinon при все повече заболявания с участието на PIHF.

Ролите за Пино на HF

Доколкото ни е известно, това настоящото проучване е първото изследване за изследване на ролите на Pino върху модел на гризачи на PIHF. Въпреки че ефектите на Pino са широко изследвани в множество модели, само няколко проучвания поставят акцент върху връзката между Pino и сърдечно-съдови заболявания, включително инфаркт на миокарда, исхемично/реперфузионно увреждане и аритмии (Ye et al. 2019; Zheng et al. 2020), което ограничи разбирането ни за защитата на сърцето, предоставена от Пино. В допълнение, както беше демонстрирано по-рано, Pino показа анти-фиброза, -апоптоза, -възпаление и антиоксидантна ефикасност, които също бяха жизненоважни цели на терапията при PIHF. Тъй като един от пътищата на възпалението, пътят на ядрения фактор-капа B/туморен некрозисфактор- (NF-KB/TNF-) е изследван в нашата група (Ye et al.2019), следователно в това проучване ние се фокусирахме върху няколко фактора, които влошиха сърдечните функции и ремоделирането, съставено от апоптоза, оксидативен стрес, фиброза и разреждане на неоваскуларизацията. Както се очакваше, посткондиционирането на Пино, което беше от голямо значение, смекчи апоптозата и фиброзата по начин, зависим от антиоксидантите. Ние също наблюдавахме VEGFR2-зависима ангиогенеза, която осигурява кислород и хранителни вещества за кардиомиоцитите, за да улесни оцеляването, аналогична на тази, предизвикана от Pino в модел на болестта на Алцхаймер (Liu et al. 2014). Въпреки това остава спор, че Pino е удостоверен за потискане на свързването на VEGFR2, миграцията на капилярите и покълването (Cuevas et al.2015; Tian et al.2014), чрез което Pino може да се използва за възпрепятстване на разпространението на рак като латентно ново лекарство. Следователно, неоваскуларизацията в граничната зона на инфаркта вероятно се дължи на възстановяването на други фактори, а не на прякото въздействие на Pino. Протеинът P53, регулиран нагоре в PIHF, може отчасти да обясни промяната. Дали Pino повлиява някои други фактори, които биха могли да модулират ангиогенезата, като протеин киназа B (AKT), също не беше известно. По този начин основните механизми на неоваскуларизацията, дадени от Pino в PIHF, се нуждаят от допълнителни изследвания, за да бъдат изяснени.

Pino преобладаващо модулиран Nrf2/HO-1 път в PIHF

Пътят на Nrf2/HO-1 беше доминиращ механизъм за издържане на щетите, причинени от ОС. Добре установено е, че Pino може да подобри OS чрез насърчаване на цялостната експресия на Nrf2 и HO -1 и транслокацията на Nrf2 от плазмата към ядрото, което също беше причината да изберем този път като кандидат. Въпреки това, ефектът, упражнен от Pino върху пътя на Nrf2/HO-1, се дължи на директно активиране или индиректна модулация, след като подобряването на цялостното състояние остава недефинирано. Следователно, в това изследване ние определихме Nrf като основна цел на Pino чрез инхибиране на Nrf2 от ML385, което почти обърна благотворните ефекти на Pino върху фиброза, апоптоза и ангиогенеза. Независимо от това, тази асоциация, извършена in vitro, се нуждаеше от допълнителни изследвания, при които Nrf2 инхибитор или siRNA или вирус, трансфектиран за мълчание на гени, беше необходимо да се приложи in vivo. Освен това, ние също така наблюдавахме, че почистването на ROS е потиснато от ML385, за което изложихме предположение, че небалансираната редокс хомеостаза предизвиква прекомерно генериране на ROS извън капацитета на Pino при концентрация от 25 μM. За да се потвърди това предположение, беше предложено да се организира концентрационен градиент, за да се открие дали достатъчно Pino е в състояние да противодейства на производството на ROS, причинено от блокадата на пътя Nrf2/HO-1. Тъй като генерирането на ROS обикновено се приписва на електронно изтичане от митохондриална, активирана никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксигеназа, разединяване на синтазата на азотен оксид и натрупване на напреднали продукти на гликозилиране, могат да се извършат по-задълбочени проучвания за изследване на подробните механизми, чрез които Pino възпрепятства ROS генериране и елиминира натрупването на ROS.

Ограничения на изследването

Настоящото изследване има няколко ограничения. Трябва да признаем, че има субективно пристрастие към дефиницията на граничната зона на инфаркта, което може силно да повлияе на точността на резултатите. За да се разреши това ограничение, патологичните секции бяха избрани от 3 души, които обаче не можаха напълно да се откажат от пристрастията. Освен това, няколко Western blot изображения показват множество ленти, приписани на поликлоналните първични антитела, които имат отрицателно въздействие върху качеството на фигурите. Също така беше забележимо, че използвахме Nrf2 инхибитор, ML385, вместо Nrf2 siRNA или аденовирусна трансфекция, което води до по-малко убеждаване. Не на последно място, антиоксидантните механизми на Pino са сложни, което налага повече изследвания за по-нататъшно изясняване.

Заключение

В заключение, прилагането на Pino облекчава предизвиканата от миокарден инфаркт сърдечна недостатъчност, доказано чрез подобрение на сърдечните функции и структурно ремоделиране, включително фиброза, апоптоза и неоваскуларизация, частично чрез отслабване на OS, в Nrf2/HO-1 пътя- зависим начин.

Тази статия е извлечена от Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7