Ефекти за избелване на кожата и против бръчки на биоактивни съединения, изолирани от черупки на фъстъци чрез екстракция с помощта на ултразвук

Контакт:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 и Jin Woo Kim 1,2,3,*

Резюме:Методологията на повърхността на отговор беше използвана за оптимизиране на условията за екстракция с помощта на ултразвук (UAE) за едновременно оптимизиране на зависими променливи, включително DPPHрадикална активност (RSA), инхибиране на тирозиназната активност (TAI) и инхибиране на колагеназната активност (CAI) на екстракти от черупки на фъстъци. Ефектите на основните променливи, включително време на екстракция (5.0~55.0 мин, X1), температура на екстракция (26.0~94.0 ◦C , X2) и концентрацията на етанол (0.0 процента ~99,5 процента , X3) бяха оптимизирани. Въз основа на експериментални стойности от всяко условие бяха получени модели на квадратична регресия за прогнозиране на оптимални условия. Коефициентът на определяне (R2) на независимата променлива беше в диапазона 0.89~0.96, което показва, че регресионните модели са подходящи за прогнозата. При прогнозиране на оптималните условия на ОАЕ въз основа на метода на наслагване, бяха идентифицирани време за екстракция от 31,2 минути, температура на екстракция от 36,6 ◦C и концентрация на етанол от 93,2 процента. При тези условия бяха прогнозирани RSA от 74,9 процента, TAI от 50,6 процента и CAI от 86.8 процента, което показва добро съответствие с експерименталните стойности. Полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция показва, че екстрактът от черупки на фъстъци намалява нивата на иРНК натирозиназа-свързани гени на протеин-1 и матриксна металопротеиназа-3 в B16-F0 клетки. Затова идентифицирахмеизбелване на кожатаи ефектите против бръчки на екстрактите от фъстъчени черупки при нива на протеини и генна експресия, а резултатите показват, че фъстъчените черупки са ефективен козметичен материал заизбелване на кожатаи ефекти против бръчки. Въз основа на това проучване черупките от фъстъци, които се считат за страничен продукт, могат да бъдат използвани за разработването на здравословни храни, лекарства и козметика.

Ключови думи:черупка от фъстъци; оптимизация;избелване на кожата; против бръчки; антиоксидант;тирозиназа; колагеназа; протеин, свързан с човешка тирозиназа-1 (TRP-1); матрична металопротеиназа (ММР)

Щракнете за органичноCistanche избелващи продукти за грижа за кожата.

1. Въведение

Меланинът е кафяв или черен полимерен пигмент, който се синтезира от меланозоми на меланоцити в епидермиса. Основната му функция е да блокира ултравиолетовите (UV) лъчи, за да защити кожата. Алтернативно, прекомерното му производство може да причини потъмняване на пигмента, като мелазма, бенки и възрастови петна [1–3]. Тирозиназата е основен ензим, който катализира реакциите на автоокисление и полимеризация, чрез които тирозинът се превръща в допахинон чрез дихидроксифенилаланин и произвежда меланин чрез допахром по време на биосинтеза на меланин [4]. По този начин той се използва широко за намаляване или отслабване на производството на меланин чрез инхибиране натирозиназаактивност с цел засилване на избелващия ефект на козметиката [5]. Бързата индустриализация и увеличеното използване на хлорофлуоровъглеводороди сериозно увредиха защитния озонов слой на земята, което доведе до по-голямо количество ултравиолетови лъчи, достигащи до земята и излагащи кожата. Това увеличение на UV радиацията следователно предизвиква активно генериране на реактивни кислородни видове (ROS) в човешкото тяло, като супероксидни аниони, водородни пероксиди и хидроксилни радикали. Такива видове са насърчили непрекъснатото окисление на тирозин, което води до повишено производство на меланин. В тази връзка активно се провеждат изследвания върху инхибирането натирозиназадейност, както и премахването на РОС с цел развизбелване на кожатаагенти [6]. Колагенът е основна извънклетъчна матрица, която се състои от 90 процента от дермата. Колагенът защитава и придава еластичност на кожата и участва в механичната твърдост на кожата, устойчивостта, свързването на съединителните тъкани и пролиферацията и диференциацията на клетките [7]. Протеините, които изграждат извънклетъчния матрикс, като колаген, се разграждат от колагеназа, като матриксна металопротеиназа (ММР), причинявайки бръчки, намалена еластичност и отпускане на кожата [8]. Различни видове MMP, които се експресират от ROS, хидролизират колагеновата верига, съединителната тъкан на кожата и генерират нейното необичайно кръстосано свързване, за да увеличат разграждането на колагена и да ускорят образуването на бръчки [9]. Поради тази причина инхибирането на производството на меланин и разграждането на колаген чрез намаляване на генерирането на ROS е основният фокус за избелване на кожата и предотвратяване на бръчки [10]. Арбутин, коджикова киселина и линоленова киселина като избелващи козметични средства и ретинол, галат и аденозин като анти -козметика против бръчки, се използва широко през последните години. Използването на тези материали обаче е ограничено, като се има предвид тяхната нестабилност в присъствието на светлина и топлина, както и нежелани реакции, включително дразнене на кожата и контактен дерматит [11]. С нарастващия интерес към естествените антиоксиданти за преодоляване на недостатъците на конвенционалните съставки за избелване и против бръчки, извлечените от растения екстракти се използват активно за разработване на биоактивни съединения за щадящи кожата и безопасниизбелванеи козметика против бръчки [12,13].

Съществуват различни методи за екстракция, които в момента се използват за извличане на биоактивни съединения от растения. Въпреки това, екстракцията на биоактивни съединения от природни източници, особено растения, се извършва главно чрез методи за екстракция с разтворител, гореща вода и Soxhlet, които показват различни недостатъци, включително ниска ефективност на екстракция, разлагане на съставките, ниска стабилност и висока цена на работа [14]. Така наскоро бяха тествани методи за екстракция, включително екстракция с помощта на ултразвук, с помощта на микровълни и суперкритична екстракция [15]. По-специално, ултразвукът е звукова вълна с честота приблизително 20 kHz или повече, което води до компресия, кавитация и разреждане на течността, като по този начин се максимизира молекулярното движение за кратко време, за да се постигне висока ефективност на екстракция [16]. Освен това ултразвукът има предимство, тъй като краткото му време за екстракция минимизира разлагането на биоактивни съединения и се оценява като ефективен метод за извличане на естествени съставки с антиоксидант,избелване, и свойства против бръчки от много растения и билки [17]. Оптимизирането на условията на екстракция е от съществено значение за повишаване на ефективността на екстракцията с помощта на ултразвук (UAE) и процесът на оптимизиране може да се извърши или чрез експериментални, или чрез статистически методи. Традиционният метод един фактор в даден момент, като всички променливи остават постоянни и се променят само един фактор в даден момент, има ограничения при определяне на интерактивните ефекти, ако това е многовариантен експеримент. От друга страна, RSM предоставя статистическа информация за корелацията между променливите в многовариантни експерименти, заедно с ефективни експерименти, използващи минимален брой проби, както и важни математически и статистически техники за оценка на ефективността и пригодността на регресионния модел. За статистическа оптимизация, различни дизайни на RSM, като пълен факторен дизайн, дизайн на Box-Behnken и централен композитен дизайн (CCD), са широко използвани. Сред тях CCD е много ефективен и по този начин предоставя много информация за променливите ефекти на експеримента и цялостната експериментална грешка, с минимален брой необходими серии [18]. Следователно в много съществуващи проучвания CCD е широко използван за разработване, подобряване и оптимизиране на процеса условия за извличане на различни антиоксиданти и други метаболити от природни продукти.

Фъстъкът (Arachis hypogaea) е едногодишно растение от семейство Бобови. Отглежда се в повече от 50 страни по света, включително Южна Корея, Индия, Китай и Съединените щати [19]. Фъстъците са богати източници на протеини (25 процента), липиди (47 процента) и въглехидрати (16 процента), както и минерали, витамини, ниацин, ненаситени мастни киселини, анолеинови киселини [20]. Те се консумират като непреработени или преработени продукти, включително ядки, масло и олио за готвене. Изчислено е, че световното годишно производство на фъстъци възлиза на общо 4,1 милиона тона и че черупката на фъстъците представлява 35% ~ 40% от общото тегло на фъстъците [21]. Изчислено е, че повече от 1,5 милиона тона черупки от фъстъци се изхвърлят годишно като странични продукти. Въпреки това, като се има предвид, че само част от фъстъчените черупки се използват като храна за животни и че повечето от тях се изгарят или депонират, причинявайки разходи за обезвреждане и екологични проблеми, е необходимо да се произвеждат материали с висока добавена стойност, използвайки фъстъчени черупки, за да се преодолее проблемът със страничните продукти [22]. ]. Предишни проучвания върху антиоксидантите показват, че са докладвани противовъзпалителни и анти-затлъстяващи действия на екстракти от фъстъчена кожа [23,24]. Въпреки това, досега няма изследвания за производството на функционални козметични материали за подобряванеизбелванеи ефекти против бръчки с помощта на биоактивни съединения от фъстъчени черупки. Следователно, това проучване извлича биоактивни съединения от черупка на фъстък чрез използване на ултразвукова асистирана екстракция (UAE), за да потвърди техните антиоксидантни, избелващи и против бръчки ефекти и допълнително представя оптимално UAE състояние, използвайки метода на повърхността на отговор (RSM) и повишава функционалността на екстрактите за да се потвърди възможността за употребата му като хранителни, козметични и медицински съставки.

2. Резултати и дискусия

2.1. Монтиране на моделите RSM

В тази работа температурата на екстракция, времето за екстракция и концентрацията на етанол бяха избрани като основни променливи на CCD с помощта на предварителния експеримент с един фактор за определяне на значимите променливи, засягащи UAE (Таблица 1).

След това бяха конструирани 17 експериментални серии, включително 3 реплики в централната точка с помощта на 3-променливи и 5 нива CCD. Експерименталните грешки бяха сведени до минимум чрез произволно подреждане на експерименталния ред, за да се сведе до минимум въздействието на необяснима променливост. Експерименталните и прогнозираните резултати за DPPH радикална активност (RSA),тирозиназаинхибиране на активността (TAI) и инхибиране на активността на колагеназата (CAI) са показани в таблица 2.

За да се определи корелацията между 17-те експериментални серии на CCD експериментални условия и експерименталните резултати, бяха предложени множество регресионни модели за прогнозиране на оптималните нива на тези 3 променливи. Чрез прилагане на множествен регресионен анализ към експерименталните данни, зависимите променливи (Y) и тестваните променливи бяха свързани със следните уравнения на квадратна регресия (Таблица 3).

Дисперсионният анализ (ANOVA) е статистически тест за анализиране на експериментални данни. Той подразделя общата вариация в набор от данни на съставни части, които са свързани със специфични източници на вариация, за да се тества хипотеза върху променливите на модела или да се оценят компонентите на дисперсията [25]. Анализът на повърхността на реакцията и ANOVA бяха използвани за определяне на коефициентите, оценка на статистическата значимост на условията на модела и напасване на математическите модели на експерименталните данни, които имаха за цел да оптимизират цялостната област за променливите на реакцията [26]. Както е установено от модела, коефициентите на корелация (R2), използвани за определяне на връзката между експерименталните и прогнозираните реакции чрез регресионни модели, са в диапазона от 0.8862~0.9622. Това предполага, че анализираните променливи на процеса обясняват повече от 88,6 процента от независимите променливи. Софтуерът Design-Expert беше използван за изчисляване на коефициентите на уравненията на квадратната регресия и пригодността на модела беше тествана чрез ANOVA. Съгласно стойността на мономиалния коефициент на уравненията на квадратната регресия са изброени в таблица 4 и редът на приоритет сред главния ефект на независимите променливи е концентрация на етанол (X3) > температура на екстракция (X2) > време на екстракция (X1).

2.2. Ефект на условията за екстракция върху RSA

Таблица 2 показва експерименталните данни за RSA според различни условия на ОАЕ. RSA на екстракт от черупки на фъстъци се определя в диапазона от 7,6 процента ~89,9 процента. Най-високият RSA беше идентифициран при следните условия на екстракция: време на екстракция 55.0 min, температура на екстракция 60.{{10}} ◦C и концентрация на етанол 5 0.0 процента (Изпълнение №10). Най-ниската RSA от 7,6 процента, при време на екстракция от 30.0 минути, температура на екстракция от 60,0 ◦C и концентрация на етанол от 0,0 процента, беше идентифицирана като експериментална стойност (Изпълнение #13) . Чрез прилагане на множествен регресионен анализ, експерименталните данни и отговорите бяха свързани с уравнения на квадратна регресия (Таблица 3). Статистическият анализ разкрива, че R2 на регресионния модел е 0,9308 (p=0.0027), което показва, че това уравнение може да обясни 93,0 процента от резултатите от експерименталните условия, което означава, че моделът е много значим и може да се използва за точно прогнозиране функцията за реакция.

Ефектът на индивидуална променлива на UAE при фиксирани нива на други променливи върху RSA, предсказан и показан на фигура 1а. RSA има тенденция да се увеличава и след това да намалява, когато всички UAE променливи се увеличават. Концентрацията на етанол има най-голям ефект върху RSA сред трите UAE променливи, докато времето за екстракция и температурата на екстракция имат най-малък ефект върху RSA. Този резултат е в съответствие с резултатите от ANOVA, при които концентрациите на етанол показват по-значим ефект (p=0.0002) върху RSA, както е показано в таблица 4. Ефектът на взаимодействие между независими променливи върху RSA се визуализира с помощта на 3D повърхностни криви на реакция. Температурата на екстракцията и времето за екстракция се променят едновременно при фиксираното ниво на концентрация на етанол (Фигура 2А). Тъй като двете променливи (температура на екстракция и време) се увеличават, RSA се повишава до максимално ниво и след това отново намалява. Най-високата RSA е получена при температура на екстракция от 56,1 ◦C, което следователно предполага, че екстракцията на биоактивни съединения с антиоксидантен потенциал, като полифеноли, се увеличава с разрушаването на компонентите на растителната стена, като лигнин, при температури до 56,1 ◦C; въпреки това, при по-високи температури, RSA е намален поради разлагането или полимеризацията на антиоксидантните съставки. Фигури 2B, C показват, че RSA не се повлиява значително от времето или температурата на екстракция, докато RSA се повлиява значително от концентрацията на етанол, която е най-висока при концентрация на етанол от 61,0 процента и която също отново намалява. Този резултат е в съответствие с този от експеримента за екстракция с гореща вода на Lespedeza cuneata от Kim et al. при които RSA беше по-повлиян от концентрацията на етанол, отколкото от температурата на екстракция, а RSA беше максимумът в диапазона на концентрация на етанол от 60% ~70% [27]. Тези резултати показват, че ефективността на екстракцията на бинарния разтворител (вода и етанол) е по-ефективна за екстракция с един разтворител в ОАЕ на черупки от фъстъци.

2.3. Ефект на условията на екстракция върху TAI

Тирозиназае ензим, който насърчава производството на меланин чрез окисляване на тирозин в основния слой на епидермиса и инхибирането на този ензим е от съществено значение за подобряването наизбелване на кожата [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >температура на екстракция (p < {{0}}.0598) > време на екстракция (p < 0,4329), което потвърждава, че ефектът от концентрацията на етанол е най-значимият при TAI.

За да се сравни ефектът от условията на ОАЕ върху TAI, диаграмата на смущението беше използвана за оценка на ефекта на отделните променливи върху TAI чрез фиксиране на две променливи в централната точка. Както е показано на Фигура 1b, TAI показа различен модел в сравнение с предишния RSA експеримент; той се увеличава с увеличаване на концентрацията на етанол, докато времето за екстракция не повлиява значително TAI. Значителното пропорционално увеличение на TAI с концентрацията на етанол може да се обясни с резултатите от ANOVA. TAI беше значително повлиян от първичния член на концентрацията на етанол (X3) и (p < 0.05)="" квадратичният="" член="" не="" е="" статистически="" значим,="" като="" по="" този="" начин="" показва="" силна="" пропорционална="" връзка="" между="" tai="" и="" концентрацията="" на="" етанол.="" 3d="" повърхностната="" крива="" на="" отговор="" е="" графичното="" представяне="" на="" уравнението="" на="" квадратичната="" регресия="" и="" резултатите="" от="" tai,="" повлияни="" от="" температурата="" на="" екстракция="" (x1),="" времето="" на="" екстракция="" (x2)="" и="" концентрацията="" на="" етанол="" (x3).="" фигура="" 3a="" визуализира="" ефекта="" на="" взаимодействието="" на="" времето="" за="" екстракция="" и="" концентрацията="" на="" етанол="" върху="" tai.="" резултатът="" потвърди,="" че="" времето="" за="" екстракция="" не="" показва="" значителен="" ефект="" върху="" tai,="" докато="" концентрацията="" на="" етанол="" има="" силна="" пропорционална="" връзка="" с="" tai.="" по="" подобен="" начин,="" както="" е="" показано="" на="" фигура="" 3в,="" tai="" беше="" по-зависим="" от="" концентрацията="" на="" етанол,="" отколкото="" от="" температурата="" на="" екстракция="" и="" най-високият="" tai="" беше="" постигнат,="" когато="" концентрацията="" на="" етанол="" се="" увеличи="" до="" 99,5="" процента.="" при="" изследване="" на="" условията="" на="" оае="" за="" максимален="" tai,="" максималните="" стойности="" на="" условията="" на="" tai="" бяха="" прогнозирани="" да="" бъдат="" 3{{20}}.0="" минути,="" 26,3="" ◦c="" и="" 99,5="" процента.="" този="" резултат="" е="" подобен="" на="" докладвания="" от="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" в="" проучване="" на="" биологичната="" активност="" на="" листата="" на="" цитрона,="" когато="" 20,0%="" ~80,0%="" етанол="" се="" използва="" като="" екстракционен="" разтворител,="" tai="" се="" увеличава="" пропорционално="" в="" отговор="" на="" увеличаването="" на="" концентрацията="" на="" етанол="" и="" показва="" максимална="" стойност="" при="" екстракция="" с="" 80%="" етанол.="" това="" предполага,="" че="" използването="" на="" по-висока="" концентрация="" на="" етанол="" е="" полезно="" при="" извличане="" на="" биоактивни="" съединения="">избелване на кожатаефект от фъстъчени черупки или други растения.

2.4. Ефект на условията на екстракция върху CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >концентрация на етанол (p=0.0240) > време на екстракция (p=0.8505), което показва, че ефектът от температурата на екстракцията и концентрацията на етанол са значими върху CAI.

Фигура 1в показва диаграма на смущения, в която две променливи са фиксирани и визуализира ефекта на една променлива върху CAI. Показано е, че ефектите на всичките три променливи върху CAI са сходни и трите променливи показват значителни ефекти и увеличават и впоследствие намаляват CAI, тъй като всяка независима променлива се увеличава. В нашето изследване бяха разработени 3D криви на реакция на повърхността, за да се визуализира взаимодействието на две независими променливи в CAI с помощта на уравнения на квадратна регресия (Фигура 4). Когато концентрацията на етанол беше фиксирана в централната точка, ефектът от времето на екстракция и температурата върху CAI беше оценен на Фигура 4А. Тъй като двете променливи се промениха едновременно, CAI се увеличи до 33,4 минути и 76,8 ◦C и отново намаля след максимална CAI от 92,8 процента. Както е показано на Фигура 4B, C, CAI има най-висока стойност при концентрация на етанол от 64,3 процента, показвайки тенденция към постепенно намаляване след това, което предполага, че бинарен разтворител, състоящ се от 64,3 процента етанол, е по-подходящ като екстракционен разтворител. Този резултат е в съответствие с предишни изследвания, които съобщават, че бинарен разтворител от вода и етанол показва по-висок CAI от водата при екстракцията на биоактивни съединения от Orostachys japonica, което предполага, че 50 процента етанол би бил по-изгоден при екстракциятаизбелване на кожатасъставки [34]. Максималният CAI на екстракта от фъстъчена черупка, предсказан от модела на квадратична регресия, е 94,5 процента, което е получено при условия на време на екстракция от 45,1 минути, температура на екстракция от 93,6 ◦C и концентрация на етанол от 42,3 процента. CAI, получен в нашето проучване, беше 94,5 процента, което е повече от два пъти ефекта от 39,4 процента и 40,3 процента от CAI стойностите на екстрактите от зелен чай, докладвани от Oh et al. [35].

2.5. Оптимални условия за екстракция

антиоксидант,избелване на кожатаи ефектите против бръчки са важни функции за козметиката и е необходимо да се изведат условия, които могат да увеличат максимално тези три функции едновременно за оптимизиране на условията на ОАЕ. Фигура 5 показва процедура за оптимизиране, която може едновременно да максимизира RSA (Y1), TAI (Y2) и CAI (Y3) чрез припокриване на всяко оптимално състояние на контурна графика, получена чрез уравнение на квадратна регресия. Диапазоните на независими променливи за оптимизиране на три променливи бяха ограничени до времето за екстракция от 5.0~55.0 минути, температура на екстракция от 26.{{10}}~94 .0 ◦C и концентрация на етанол 0.0 процента ~99,5 процента (Таблица 5). Според индивидуалните оптимални условия на екстракция, оптималните условия на UAE бяха 31,2 минути време на екстракция, 36,6 ◦C температура на екстракция, 93,2 процента концентрация на етанол и, при горните условия, RSA от 74,9 процента, TAI от 50,6 процента и CAI от 86.8 процента бяха предвидени. Когато предвидените стойности на RSA, TAI и CAI бяха сравнени с тези, получени от експеримента за валидиране, стойностите от теста за валидиране бяха подобни на тези на прогнозираните стойности, където стойностите бяха съответно 78,2 процента, 52,3 процента и 87,7 процента.

2.6. Сравнение на SE и UAE

За да потвърдим ефективността на екстракцията на UAE, ние сравняваме RSA, TAI и CAI на екстракт от фъстъчени черупки, произведен с помощта на техники за екстракция на UAE и Soxhlet (SE). Когато SE беше проведено при общи условия на SE, като се използва 99,5 процента етанол при 70 ◦C за 4 часа време на екстракция, беше установено, че RSA, TAI и CAI са 75,5 процента, 60,2 процента и 74,4 процента, които не са много различни от резултатите, получени при оптимални условия на ОАЕ. Въпреки това, когато условията на SE бяха определени равни на оптималните условия на ОАЕ от 31,2 минути и 93,2 процента етанол, RSA, TAI и CAI намаляха съответно с 62,0, 28,3 и 45,6 процента, в сравнение с ОАЕ при оптимални условия. Предимството на ултразвука при производството на полезни материали от фъстъчени черупки беше оценено като процес, подходящ за висока производителност и индустриализация поради ниската консумация на разтворители и краткото време за екстракция.

2.7. mRNA експресия на MMP-3 и TRP-1

В меланоцитите на бозайници, меланогенезата и хидролизата на колаген се контролират съответно от TRP и MMP гени, а TRP{{0}} и MMP-3 са известни като главните гени за регулиране на меланогенезата и хидролизата на колаген; следователно беше извършен RT-PCR анализ на цели клетъчни лизати на B16-F0 клетки и ефектът на екстракт от фъстъчена черупка, произведен от UAE при оптимални условия (31,2 минути, 36,6 градуса, 93,2 процента) върху mRNA експресията на MMP-3 и TRP-1 е изследвана. Както е показано на Фигура 6, екстрактът от черупки на фъстъци значително понижава експресията на MMP-3 и TRP-1 в B16-F0 клетки, когато експериментите за генна експресия са извършени с фъстъци диапазон на концентрация на екстракт от черупки 0~1 mg/mL. Екстрактът от фъстъчена черупка значително намалява експресията на MMP-3 и TRP-1 съответно 61-пъти и 8.7-пъти при 1.0 mg /mL. Тези резултати предполагат, че екстрактът от черупки на фъстъци инхибира разграждането на колаген в клетки B16F0 чрез инактивиране на MMP 3 до инактивиране на MMP-1 и пречи на сътрудничеството на MMP-9 [36]. Съществуващи проучвания показват, че лечението с растителни екстракти инхибира експресията на свързания с микрофталмия транскрипционен фактор (MITF) чрез фосфорилиране на извънклетъчна сигнално-регулирана протеин киназа (ERK). По този начин, инхибиторният ефект на производството на меланин от екстракт от черупки на фъстъци се дължи на инхибирането натирозиназаактивност чрез инхибиране на експресията на ERK и MITF [37]. По този начин екстрактите от фъстъчени черупки намаляват нивата на експресия на иРНК на TRP-1 и MMP-3, което показва, че екстрактът от фъстъчени черупки притежава силна инхибиторна активност върху колагенолизата и меланогенезата, което го прави отличен козметичен материал сизбелване на кожатаи ефекти против бръчки.

3. Материали и методи

3.1. Материали и реактиви

Фъстъчените черупки бяха закупени от Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Корея) през март 2019 и черупките бяха изсушени при 60 ◦C в суха пещ (FC 49, Lab House, Сеул, Корея) в продължение на 24 часа до сухото тегло остава постоянно. Изсушените черупки от фъстъци се пулверизират с помощта на кухненски робот (Hanil HMF-3800, Сеул, Корея) и след това се прекарват през 600 µm сито. Етанолът е закупен от Samchun chemical (95,0 процента v/v, Сеул, Корея). Реагент Folin-Ciocalteu, галова киселина (97 процента) и кверцетин са закупени от Merck (Кенилуърт, Ню Джърси, САЩ). 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH), аскорбинова киселина и 3,4-дихидрокси-L-фенилаланин (L-DOPA) са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Всички други химикали, използвани в този експеримент, са с аналитичен клас и са закупени от Sigma-Aldrich. Всички изходни разтвори бяха приготвени с пречистена дейонизирана вода, използвайки система за пречистване Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, САЩ).

3.2. Екстракция с помощта на ултразвук и екстракция по Сокслет

Прахообразна фъстъчена черупка (1 g) се поставя в съд за екстракция, всеки с 10 mL разтворител и се смесва с помощта на вортекс миксер (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея) за 1 минута. Екстракцията се извършва чрез циркулация на вода в ултразвуковия екстрактор (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея), като се използва външна хладилна циркулационна помпа (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея ) с цифров таймер и регулатор на температурата. Екстракцията се извършва с ултразвуково устройство, оборудвано с цифров таймер и температурен контролер. Пробата беше обработена с ултразвук за различни експериментални продължителности и температури при работна честота от 40 kHz. След това екстрактът се центрофугира при 10,000 rpm за 10 минути (236R, Labogene, Сеул, Корея). След центрофугиране, обемите на пробата се довеждат до 5 mL и се филтруват през 0.2 µmmembrane филтър преди анализа. За екстракцията на Soxhlet, прахообразната фъстъчена черупка (5 g) се екстрахира непрекъснато със 100 mL, като се използва 99,5 процента етанол в продължение на 4 часа (8 цикъла) при максимална температура от 70 ◦C в апарат на Soxhlet. Доказано е, че техниката на екстракция с помощта на ултразвук е много ефективна при извличането на масло от гроздови семки. Предимството на ултразвука, в сравнение с конвенционалните методи за екстракция както за масло, така и за полифеноли, е подобно, тъй като добивът на масло/полифеноли се получава с по-ниска консумация на разтворител и по-кратък време за извличане.

3.3. Експериментален дизайн

Експерименталният дизайн беше извършен с помощта на CCD, вид RSM за минимизиране на броя на експерименталните серии и изследване на взаимодействието между факторите. Софтуерът Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) беше използван за проектиране на експерименти, анализ на данни и оптимизиране на условията за екстракция за максимизиране на екстракцията на биоактивни съединения, притежаващи антиоксидант,избелване на кожата, и ефектите против бръчки от черупките на фъстъците. Експериментите са проектирани в съответствие с CCD, стойностите на обхвата и централната точка на представените три независими променливи се основават на резултатите от предварителните експерименти (Таблица 1). CCD беше приложен за прогнозиране на оптималните условия на ОАЕ за максимизиране на отговорите, включително RSA, TAI и CAI от фъстъчени черупки. Като независими променливи, трите избрани променливи са времето на екстракция (X1), температурата на екстракция (X2) и концентрацията на етанол (X3). Бяха генерирани общо 17 експериментални серии с три репликации в централните точки, за да се оцени възпроизводимостта. Моделът на квадратичната регресия беше използван за напасване на експерименталните данни и приложен за прогнозиране на променливите на отговора, както е показано в уравнение (1):

Y= 0 плюс 1X1 плюс 2X2 плюс 3X3 плюс 11X12 плюс 22X22 плюс 33X32 плюс 12X1X2 плюс 13X1X3 плюс 23X2X3 (1)

където Y е прогнозираният отговор; 0 е константата (отсечка); 1, 2 и 3 са регресионните коефициенти за членовете на линейния ефект; 11, 22 и 33 са членовете на квадратичния ефект; и 12, 13 и 23 са съответно членовете на ефекта на взаимодействие. Анализът на повърхността на реакцията и ANOVA бяха използвани за определяне на регресионните коефициенти и статистическата значимост на условията на модела и за напасване на математическите модели на експеримента [38].

3.4. DPPH радикална активност (RSA)

RSA на екстракта от черупки на фъстъци е както е описано от Pereira-Caro et al. [39]. Беше приготвен разтвор на 0.01 mM DPPH в метанол (95 процента) и 1,25 mL бяха добавени към 0,25 mL разреден екстракт. Беше определено, че RSA измерва абсорбцията при 517 nm с помощта на UV-Виспетрофотометър (UV1650PC, Shimadzu, Киото, Япония) след 20 минути инкубация. Празната проба се приготвя с помощта на дестилирана вода и RSA се изчислява съгласно по-долу. (Уравнение (2)):

RSA (проценти)={1 −Abs (проба) /Abs (контрола) } × 100 (2)

3.5. Инхибиране на тирозиназната активност (TAI)

TAI се извършва съгласно модифицирания метод с използване на L-DOPA като субстрат от Jo et al. [40]. Пробите се смесват с 200 µL L-DOPA и 200 µL калиев фосфатен буфер (рН 6,8) и 200 µL оттирозиназа(125 U/mL) се добавя в епруветката и се инкубира при 37 ◦C за 20 минути. Абсорбцията на пробата се измерва при 475 nm с помощта на UV-Vis спектрофотометър и резултатите се сравняват с контролата. За всяка концентрация, ензимната активност се изчислява като процент в сравнение с тази на анализа, като се използва буфер без никакъв инхибитор, и TAI се изчислява въз основа на следната формула. (Уравнение (3)):

TAI (проценти)={1 −Abs (контрола) − Abs (проба) /Abs (контрола)} × 100 (3)

където Abs (контрола) е абсорбцията на буфер плюс колагеназа; Abs (проба) е абсорбцията на буфер плюс колагеназа плюс проба/стандарт.

3.6. Инхибиране на активността на колагеназата (CAI)

Измерването на CAI на екстракти беше извършено чрез модифициране на методите на Wünsch и Heindrich [41]. Субстратът, 4-фенилазобезилоксилкарбонил-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), се разтваря в 10 mL буфер до 1,2 mg/mL и след това се добавят 125 µL разтвор и се инкубират за 60 минути при 37 ◦C. Колагеназата се разтваря в буфера до 0,4 mg/mL и към буферния разтвор се добавят 75 uL ензимен разтвор. Сместа ензим-субстрат се инкубира във водна баня при 37 ◦C за 30 минути и реакцията се спира чрез добавяне на 75 µL 20 процента лимонена киселина (w/v). След добавяне на 1.5 mL етилацетат, етилацетатният слой се отделя и абсорбцията се измерва при 320 nm. Процентът на инхибиране се изчислява съгласно следната формула.

CAI (проценти)={1 − [Abs (контрола) − Abs (проба)] /Abs (контрола)} × 100 (4)

където Abs (контрола) е абсорбцията на буфер плюс колагеназа; Abs (проба) е абсорбцията на буфер плюс колагеназа плюс проба/стандарт.

3.7. Поддържане и култивиране на клетъчни линии

Произвеждаща меланин B16-F0 меланомна клетка е получена от Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) и е култивирана в модифицирана среда на Dulbecco на Eagle (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), допълнен с фетален говежди серум (FBS, 10 процента, Welgene, Gyeongsan, Корея) и антибиотичен разтвор на пеницилин-стрептомицин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Трипсин-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) се използва за трипсинизиране на клетки. Всички използвани материали са от клас клетъчна култура.

3.8. Полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR)

RT-PCR беше извършена за измерване на промените в нивата на експресия на гени MMP-3 и TRP-1, свързани сизбелванеи ефекти против бръчки, B16-F0 клетки се култивират в 24-плака с ямки, третирани с различни концентрации на екстракт от фъстъчена черупка в DMEM без серум, и се инкубират за 24 часа. Нетретираната клетъчна контрола се поддържа при същите условия като тестваната група по време на експеримента. Изолирането на РНК от клетките се провежда с помощта на AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea). Допълнителна ДНК се синтезира с помощта на AmfiRiert Platinum cDNA synthesis MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). RT-PCR анализът беше извършен с помощта на CFX 96 touch PCR система (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ) за определяне на нивата на иРНК. Използваните праймери са както следва: MMP-3 сенс, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 и антисенс, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; и TRP-1 смисъл, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 и антисенс, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Подходящ набор от праймери, споменати по-горе, бяха използвани за амплифициране на съответните гени, като се използват следните циклични условия: 94 ◦C за 5 минути, последвани от 25 цикъла при 95 ◦C за 5 s, 60 ◦C за 30 s (за MMP-3) и 60 ◦C за 30 s (за TRP-1) и 72 ◦C за 30 s удължаване. PCR продуктите бяха подложени на електрофореза върху 1% агарозен гел, оцветени с етидиев бромид и визуализирани чрез използване на Gel Doc TM XR плюс System и Quantity One софтуер 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Поддържащ протеин, -актин, беше използван като контрола на натоварването с предположението, че нивата на експресия на тези протеини остават постоянни.

4. Изводи

В това проучване е използван допълнителен подход за възстановяване и използване на биоактивни вещества от селскостопански вторични продукти от черупки на фъстъци, за да се разработят съставки с добавена стойност с множество приложения. На първо място, ние се опитахме да увеличим ефективността на извличане на биоактивни съединения с антиоксидантни, избелващи кожата и против бръчки ефекти чрез оптимизиране на процеса на UAE. Следователно това проучване използва ОАЕ за ефективно производство на биоактивни съединения сизбелване на кожатаи ефекти против бръчки от фъстъчени черупки и приложена статистическа оптимизация за максимизиране на RSA, TAI и CAI едновременно. Условията в ОАЕ бяха оптимизирани с помощта на CCD и беше потвърдено, че изборът на разтворител и концентрация трябва да се вземат предвид при екстракцията на биоактивни съединения от фъстъчени черупки. Чрез припокриване на повърхностите на отговор, кривите на три зависими променливи, време за екстракция от 31,2 минути, температура на екстракция от 36,6 ◦C и концентрация на етанол от 93,2 процента бяха определени като оптимални условия на UAE. Потвърдено е, че RSA на екстракти от черупки на фъстъци е много висока и може да се очаква да се повиши в TAI и CAI, които са показатели заизбелване на кожатаи съответно ефект против бръчки. Оптимизирането на условията в ОАЕ потвърди увеличаването на производството на биоактивни вещества във фъстъчените черупки и избелващите и антибръчковите активности на екстракта от фъстъчени черупки чрезтирозиназаи понижаване на активността на колагеназата. Въз основа на това, ефектът от фъстъчените черупки върху нивата на експресия на MMP и TRP беше оценен, за да се прецени дали те имат избелващ ефект и ефект против бръчки на ниво генна експресия. Избелващите и антибръчковите ефекти на екстрактите от фъстъчени черупки бяха потвърдени чрез понижаване на регулацията на mRNA експресии, както и инхибирането на протеинови експресии на MMP-3 и TRP-1. Ето защо е доказано, че екстрактът от черупки на фъстъци е ефективенизбелванеи подобряване на бръчките на нивата на протеинова експресия и гени. Екстрактът от фъстъчена черупка, използван от UAE, има висока антиоксидантна активност и отлични ефекти за избелване на кожата и против бръчки, което дава на черупката от фъстъци голям потенциал като естествена козметична и хранителна съставка. Освен това се смята, че производството на биоактивни съединения с помощта на UAE може да се приложи към процеса на комерсиализация за производството на козметика, храни и фармацевтични материали, като се има предвид по-високият производствен добив и намалените разходи за обработка в сравнение с конвенционалните процеси.