Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Щракнете тук за информация относно Част I (Въведение, материали и методи) на тази статия.

Как китайските лекарства, които тонизират бъбреците, инхибират апоптозата на допаминергичните неврони?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 и Jing Cai, MD, Ph.D.2

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Дизайн

In vitro сравнително наблюдение на серумната фармакология.

Време и настройка

Експериментите са проведени в Лабораторията по цитобиология, Университета по традиционна китайска медицина Фуджиан, Китай от 2010 до 2011 г.

Материали

Животни

Общо 60 мъжки плъха Wistar, на възраст 8 седмици, с тегло 200–220 g, бяха закупени от SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Шанхай, Китай (лиценз № SCXK (Hu) {{4} }). Те бяха настанени в Центъра за лабораторни животни към Университета по традиционна китайска медицина Фуджиан в Китай при 20-22 градуса с влажност 40-60 процента и осветеност от 7:00 сутринта до 19:00 ч. Храната беше осигурена от Центърът за лабораторни животни към Университета по традиционна китайска медицина Фудзиен. Всички експериментални процедури бяха в съответствие с Насоките за грижа и използване на лабораторни животни, формулирани от Министерството на науката и технологиите на Китай [33].

Cistanche за подобряване на бъбречната функция

лекарства

Herba Epimedii, надземната част на Epimedium sagittatum Maxim е от провинция Съчуан, Китай; Semen Cuscutae, сухото зряло семе на Cuscuta Chinensis Lam., е от провинция Шандонг, Китай; и Herba Cistanches, хилокаулата на люспестия лист на Cistanche deserticola YCMa, е от Синдзян-Уйгурския автономен регион. Всички лекарства са предоставени от Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., провинция Fujian, Китай. Herba Epimedii, Semen Cuscutae и Herba Cistanches, по 97,2 g всяка, се потапят в съд за отвара, съдържащ 1 500 mL дестилирана вода, бързо се загрява, кипва, поддържа се на 100 градуса до оставят активните компоненти на лекарствата да се разтворят и кондензират до 540 mL. Суровото количество лекарство в лекарствения разтвор е 0.180 g/mL. Разтворът се филтрува, поставя се в бутилка, запечатва се, стерилизира се и се съхранява при 4 градуса. Селегилин, 5 mg × 10 таблетки на комплект, е закупен от Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (провинция Jiangsu, Китай). Селегилин, 21,6 mg, се разтваря в двойно дестилирана вода, за да се получи 540 ml воден разтвор. Концентрацията на лекарствения разтвор е 0,04 mg/mL. Лекарственият разтвор се поставя в бутилка, запечатва се, стерилизира се и се съхранява при 4 градуса.

Методи

Приготвяне на лекарствено-съдържащ серум

Групите Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches и селегилин бяха интрагастрално перфузирани със серум, съдържащ лекарство, съдържащ 0.180 g/mL Herba Epimedii, Semen Cuscutae или Herba Cistanches, или {{ 5}}.04 mg/mL селегилин, два пъти на ден, в доза 0.1 mL/kg, в продължение на 14 последователни дни. На групата с празен серум се прилага равен обем дестилирана вода. Животните бяха лишени от храна и вода за 12 часа след последното приложение. Плъховете се анестезират чрез интраперитонеална инжекция с 0.3 mL/100 g кетамин хидрохлорид. Кръвта се събира от коремната аорта и се центрофугира при 1 000 r/min за 15 минути. Супернатантата се събира, деактивира се във водна баня при 56 градуса за 30 минути, филтрира се през 0,22 μm микропореста мембрана и се съхранява при –20 градуса.

Приготвяне на 50 × разтвор на Сато

Смес от 60 mL DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 15 mg говежди инсулин (Sigma, St. Louis, MO, USA), 15 mg трансферин (Sigma), 145,8 mg натриев пируват (Biosharp, Корея), 12 mg путресцин (Solarbio, Пекин, Китай), 25 μL натриев селенит (1 mg/mL, 100 mg/100 mL H2O; Sigma) и 100 μL прогестерон (0,315 mg /mL, 15,75 mg/50 mL; Biosharp) се подлага на ултразвук в ледена баня за 1,5 часа, филтрува се през 0,22 μm филтър, разделя се на аликвотни части и се съхранява при –20 градуса.

Cistanche за лечение на бъбречна функция

Клетъчна култура

Клетките се посяват в DMEM/F12, допълнен с 5 процента (v/v) фетален волски серум (Gibco), 1 процент (v/v) глутамин (Sigma), 2 процента (v/v) 50×Sato's разтвор и 2 процента (v/v) пеницилин/стрептомицин. След това клетките се инкубират в 5 процента (v/v) CO2 и се поддържат при наситена влажност при 37 градуса. Клетките се трипсинизират с 0,25 процента (w/v) трипсин и се пасират. Клетките в логаритмичната фаза бяха събрани за последващи експерименти.

Ефект на H2O2 върху растежа на MES23.5 клетки

Клетките се посяват в 96-плаки за култура с ямки (5 × 105 клетки/ямка), инкубирани с 50, 100, 150, 200, 300 и 400 μmol/L H2O2 културален разтвор (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd ., Шанхай, Китай) след 24 часа за 1, 3, 6, 9, 12, 24 часа, последвано от MTT (Sigma) за 4 часа. Разтворът в ямките се изхвърля и се добавят 150 μL диметилсулфоксид (Sigma). Културалната плака се разклаща в продължение на 10 минути и абсорбцията на пробите при 570 nm се определя с помощта на автоматичен четец на микроплаки (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA). Прясно приготвен DMEM/F12 културален разтвор се използва като отрицателна контрола. Две паралелни ямки бяха поставени във всяка времева точка. Експериментите са проведени в три екземпляра.

Влияние на лекарствено-съдържащ серум при различни концентрации върху растежа на H2O2-третирани MES23.5 клетки

Клетките се посяват и се излагат на лекарствено-съдържащ серум, съдържащ 5, 10, 15, 20, 25 и 30 процента (v/v) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches и селегилин или празен серум за 24 часа. Клетките бяха допълнително култивирани с културален разтвор, съдържащ 100 μmol/L H2O2 за 3 часа, последвано от МТТ за 4 часа. Във всяка група бяха поставени три успоредни ямки. Прясно приготвен DMEM/F12 културален разтвор се използва като отрицателна контрола. Клетки, култивирани в културален разтвор, съдържащ 100 μmol/L H2O2 и празен серум, служат като моделна група, а клетките, култивирани само в празен серум, служат като празна серумна група. Експериментите са проведени в три екземпляра. Средната стойност на абсорбцията на всяка група беше изчислена като процент на оцеляване на клетките.

Поточна цитометрия за експресия на FasL, Fas, каспаза-3 и Bcl-2 в клетки MES23.5

Клетките се посяват и третират както преди. Клетките, култивирани само в 100 μmol/L H2O2, се разглеждат като моделна група. Белязаното с фикоеритрин FasL антитяло и FasL изотипна контрола (5 μL всяка) се добавят в две епруветки (BD, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), смесват се равномерно с клетки, съхраняват се при стайна температура на тъмно за 15 минути, центрофугират се при 1 000 r/min за 5 минути след добавяне на 2 mL PBS. Супернатантата се изхвърля и клетките се ресуспендират с помощта на 500 μL PBS. Дължината на вълната на лазерното устройство за поточна цитометрия (Facscalibur; BD) е 488 nm. Скоростта на експресия на FasL-позитивни клетки се анализира и изчислява от софтуера Cell Quest (BD). Степента на експресия на Fas-, каспаза-3- и Bcl-2-положителни клетки беше открита с помощта на същия метод.

ELISA за съдържанието на нервен растежен фактор, невротрофичен фактор, получен от мозъка, и невротрофичен фактор, получен от глиална клетъчна линия, в клетките

Клетките се посяват и третират, както е описано по-горе. Супернатантът се събира и се измерва съдържанието на нервен растежен фактор, невротрофичен фактор, получен от мозъка, и съдържанието на невротрофичен фактор, получен от глиална клетъчна линия, съгласно инструкциите на производителя (BD). Абсорбцията се измерва при 450 nm с помощта на автоматичен четец на микроплаки (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA).

Статистически анализ

Резултатите бяха изразени като средна стойност ± SD. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер SPSS 18.0 (SPSS, Чикаго, Илинойс, САЩ). Беше проведен еднопосочен анализ на дисперсията, последван от тестове за множество сравнения с най-малко значима разлика. Стойност P < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

Цистанче за бъбречната функция

Благодарности

Благодарим на Chen B, Лабораторията по невробиология, Столичен медицински университет, за любезното предоставяне на MES23.5допаминергиченнервни клетки.

Бележки под линия

Финансиране: Това проучване е подкрепено от Фонда за развитие на Chen Keji Integrative Medicine, № CKJ2010025 и Ключовата основа за развитие на обществото в провинция Фуджиан, № 2013Y0059.

Конфликти на интереси: Няма декларирани.

Етично одобрение: Това проучване получи разрешение от Комитета по етика на животните към Фуджианския университет по традиционна китайска медицина, Китай.

(Прегледано от Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(Редактиран от Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

ПРЕПРАТКИ

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, et al. Болест на Паркинсон в Китай: разпространение в Пекин, Сиан и Шанхай. Ланцет. 2005;365(9459):595–597. [PubMed] [Google Scholar]

[2] He JC, Wang WW. Ефект на Tianma Gauteng Yin върхуапоптозанадопаминергиченневрони в модел на плъхове с болест на Паркинсон. Zhongyi Zazhi. 2010; 51 (11): 1024–1027. [Google Наука]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Митохондрии и програмирана клетъчна смърт при болестта на Паркинсон:апоптозаи отвъд. Антиоксиден редокс сигнал. 2012; 16 (9): 883–895. [PubMed] [Google Scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Етиопатогенеза и лечение на болестта на Паркинсон. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google Scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA, et al. Терапия с невротрофичен фактор за болестта на Паркинсон. Prog Brain Res. 2010; 184: 237-264. [PubMed] [Google Scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Мозъчен невротрофичен фактор при невродегенеративни заболявания. Nat Rev Neurol. 2009; 5 (6): 311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Ефект на рецептата от храсти yangban върху функцията на нигростриата при паркинсонови моделни плъхове след дългосрочно лечение с леводопа. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002; 22 (1): 43–46. [PubMed] [Google Scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Ефект на отвара от Bushen Huoxue върху орфан рецептора и тирозин хидроксилазата в мозъка на плъхове с болестта на Паркинсон. Chin J Integr Med. 2011; 17 (1): 43–47. [PubMed] [Google Scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Ефекти на храстите Huo Xue yin върху мозъчното съдържание на NF-kB и NO в моделна мишка на болестта на Паркинсон. J Tradit Chin Med. 2012; 32 (1): 67–70. [PubMed] [Google Scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ, et al. Защитни ефекти на китайското подхранванебъбрекбилки върху неврони на стриатални неврони в модел на мишка с болест на Паркинсон. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011; 31 (3): 440–443. [Google Наука]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL, et al. Идентификация и анализ на активността на тирозин хидроксилазата в MES23.5 клетки. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004; 20 (1): 95–100. [Google Наука]

[12] Wang XR. Пекин: Народно медицинско издателство; 2007. Токсикологични експериментални методи и технология. [Google Наука]

[13] Lv SJ. Пекин: China Medical Science Press; 2010. Клиничен имунологичен тест. [Google Наука]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Молекулярна патогенеза на болестта на Паркинсон. Arch Neurol. 2005;62(3):353–357. [PubMed] [Google Scholar]

[15] Кристен Ю. Оксидативен стрес и болестта на Алцхаймер. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S–629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R, et al. Невропротективен ефект на разагилин при модел на болестта на Паркинсон при гризачи. Exp Neurol. 2004; 187 (2): 455–459. [PubMed] [Google Scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ и др. Защитен ефект на икариина върхуапоптозана първично култивирани неврони на плъх, индуцирани от Aâ{0}} пептид. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixue Ban. 2007;36(3):224–228. [PubMed] [Google Scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Невропротективен ефект на екстракти от Cuscuta Chinensis Lam върху невронално диференцирани PC12 клетки увреждане, предизвикано от реактивни кислородни видове. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005; 27: 69-72. [Google Наука]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Инхибиране на екстракти от Dodder на сърдечния миоцитапоптозапри стареещи мишки. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011; 31: 642-644. [Google Наука]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K, et al. Връзки структура-активност на фенилетаноидни гликозиди в растения от Cistanche salsa върху антиоксидантната активност. Zhong Yao Cai. 2009;32(7):1067–1069. [PubMed] [Google Scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T, et al. Защитни ефекти на ехинакозид върху индуцирана от въглероден тетрахлорид хепатотоксичност при плъхове. Токсикология. 2007;232(1-2):50–56. [PubMed] [Google Scholar]

[22] Cheng SD. Пекин: Народно медицинско издателство; 2006. Болест на Паркинсон. [Google Наука]

[23] Янг Т. Пекин: Народно медицинско издателство; 2010. Клетъчна биология. [Google Наука]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M, et al. Реципрочни промени в експресията на Bcl-2 и Bax в хипоглосното ядро ​​след аксотомия при възрастни плъхове: възможно участие в индуцирането на невронна клетъчна смърт. Brain Res. 1999;827(1-2):122–129. [PubMed] [Google Scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Мозъчен невротрофичен фактор при невродегенеративни заболявания. Nat Rev Neurol. 2009; 5 (6): 311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta индуцира GDNF реакция в невроните чрез набиране на GFRalpha1 към плазмената мембрана. J Cell Biol. 2002; 159 (1): 157–167. [PMC безплатна статия] [PubMed] [Google Scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. GDNF терапия за болестта на Паркинсон. Експерт Rev Neurother. 2008; 8 (7): 1125–1139. [PubMed] [Google Scholar]

[28] Chaturvedi RK, Shukla S, Seth K, et al. Факторът на растеж на нервите увеличава преживяемостта надопаминергиченприсадка, спасява нигрални допаминергични неврони и възстановява функционални дефицити в плъх модел на болестта на Паркинсон. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44–49. [PubMed] [Google Scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR, et al. Функционалност на NGF-защитени PC12 клетки след излагане на 6-хидроксидопамин. Biochem Biophys Res Commun. 2006; 351 (4): 890–895. [PubMed] [Google Scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Невротрофичният фактор, получен от мозъка, е необходим за установяване на правилния бройдопаминергиченневрони в substantia nigra pars compacta. J Neurosci. 2005; 25 (26): 6251–6259. [PMC безплатна статия] [PubMed] [Google Scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Механизмът на действие на хемоксигеназата-1 участва в усилването на експресията на невротрофичния фактор. Неврофармакология. 2010; 58 (2): 321–329. [PubMed] [Google Scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM, et al. Невропротекция от GDNF в исхемичния мозък. Фактори на растежа. 2012; 30 (4): 242–257. [PubMed] [Google Scholar]

[33] Министерството на науката и технологиите на Китайската народна република. Предложения за ръководство за грижа и използване на лабораторни животни. 2006 30 септември; [Google Наука]