HPLC пръстови отпечатъци и връзка спектър-антитуморен ефект за разграничаване между Mylabris Phalerata Pallas и Mylabris Cichorii Linnaeus

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Факултет по фармация, Zunyi Medical University, Zunyi, Китай,

2 Ключова лаборатория по фундаментална фармакология на Министерството на образованието и Съвместна международна изследователска лаборатория по етномедицина на Министерството на образованието, Медицински университет Zunyi, Zunyi, Гуейджоу, Китай.

3 Училище по основни медицински науки, Медицински университет Zunyi, Zunyi, Китай, 4 Базирана в колежа на провинция Гуейджоу Ключова лаборатория за превенция и лечение на тумори с отличителни лекарства, Медицински университет Zunyi, Zunyi, Китай.

Щракнете тук, за да получите повече информация за Cistanche anti-tumor

Акценти

Това проучване предоставя приложим, надежден и по-ефективен HPLC метод за разграничаване на два вида Mylabris. И HPLC пръстови отпечатъци и спектър-противотуморни ефектибяха интегрирани и трите важни диференциални маркера бяха открити за нов маркер на Mylabris.

Резюме

Цел: Оценка на разграничаването между два вида Mylabris въз основа на HPLC пръстови отпечатъци и спектър-противотуморен ефектвръзка. Методи: В това изследване прост и ефикасен метод за високоефективна течна хроматография (HPLC), интегриращ се с хемометричен анализ и спектър-противотуморен ефекте разработена връзка за разграничаване между два вида Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) и Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Резултати: При анализа на пръстови отпечатъци бяха избрани 14 характерни пика, за да се оценят разликите между MP и MC, използвайки анализа на сходството и разпознаването на образи, използвайки PCA и OPLS-DA. HPLC хроматограмите на проби от 10 региона на Китай показват разлики между MP и MC и са открити 7 характерни химични маркера. В спектъра-противотуморен ефектанализ на взаимовръзката, 4 маркера за активност изиграха жизненоважна роля за намаляване на IC50 и може да са антитуморните компоненти на Mylabris чрез релационен анализ на Грей и многовариантен линеен регресионен анализ. Хемометричният анализ в комбинация с резултатите от връзката спектър-ефект показва, че пикове 2 (цитозин), 4 (неизвестен) и 14 (неизвестен) са важни диференциални маркери за разграничаване на двата вида Mylabris.

Заключение: Методът е приложим, надежден и по-ефективен за разграничаване на MP и MC и ще предложи нов начин за улесняване на контрола на качеството на лекарствата за насекоми.

Ключови думи: HPLC, пръстови отпечатъци, спектър-противотуморен ефект, Mylabris, Дискриминация

Заден план

Mylabris, наричан ban mao в Китай, се използва като традиционна китайска медицина (TCM) за лечение на циреи, дълбоко вкоренени язви, коремна маса и е важенпротивотуморенагент. В допълнение, той се използва широко в Европа като народна медицина [1]. Основната активна съставка на Mylabris е кантаридин, който е ефективенпротивотуморнисъединение [2]. Съвременните фармакологични проучвания показват, че Mylabris притежава многобройни действия и е високо ценен за лечение на тумори поради двойната сипротивораковисвойства и способността да увеличават броя на левкоцитите [3-4]. Понастоящем Mylabris се използва широко в някои клинични антикарциномни TCM предписания в Китай, като инжектиране на Aidi и капсула Compound ban mao.

Според Фармакопеята на Китайската народна република (версия от 2015 г.) Mylabris се определя като изсушено тяло на Mylabris phalerata Pallas (MP) и Mylabris cichorii Linnaeus (MC), които се различават по своите ботанически характеристики, динамика на популацията и екология [ 5-6]. Mylabris също е силно токсично лекарство. Тъй като лекарствата, налични в Китай, обикновено са смес от MP и MC, е необходимо да се идентифицират химичните разлики и разликите в активността между двата вида.

Тъй като TCM съдържат множество известни и неизвестни съставки, анализът на количествения профил на техните химични съставки представлява значително предизвикателство. Снемането на пръстови отпечатъци с високоефективна течна хроматография (HPLC) играе важна роля в контрола на качеството (QC) на TCM поради общите характеристики на профила на повечето съединения в сложна система. Освен това анализът на пръстови отпечатъци на TCM има добра възпроизводимост и стабилност за автентификация на видовете и оценка на качеството и е приет от Световната здравна организация, Държавната администрация по храните и лекарствата на Китай (SFDA) и Европейската агенция за оценка на лекарствата (EMEA). Наскоро беше разработен хемометричен анализ, комбиниращ HPLC пръстови отпечатъци за QC и разграничаване на различни сложни природни източници [7]. Въпреки това е неефективно да се разграничат разликите в TCM, тъй като не може да отразява разликите в активните съставни части, което е по-важно за клиничната употреба. Досега спектърът-противотуморен ефектподходи за връзка са използвани за успешно идентифициране на биоактивните съставки на ТКМ [8]. HPLC пръстови отпечатъци, комбинирани с хемометричен анализ и връзката спектър-антитуморен ефект, ще изяснят по-добре разликата между множество източници на TCM.

Наскоро бяха докладвани някои методи за определяне на съдържанието на кантаридин, които могат да се използват за определяне на качеството на Mylabris [9]. Някои хроматографски пръстови отпечатъци също бяха приложени за QC [10-11]. Само едно проучване използва метод, включващ градиентно елуиране на водоразтворимите съединения на Mylabris въз основа на HPLC. Междувременно бяха използвани само десет проби и никакви MC проби [12]. Доколкото ни е известно, разграничаването на MP и MC въз основа на химичен състав и активност не е проучвано преди.

Това проучване имаше за цел да разработи прост и ефикасен метод за разграничаване на два вида Mylabris, използвайки HPLC пръстови отпечатъци, комбинирани с хемометричен анализ и спектрален анализ.противотуморенефектвръзка, която ще осигури основа за QC на Mylabris. Този метод може да се приложи и за идентифициране на QC маркера на други TCM.

Материали и методи

Общо 20 партиди Mylabris phalerata Pallas (MP) и Mylabris cichorii Linnaeus (MC) бяха събрани от различни провинции на Китай (Таблица 1) и идентифицирани от нашия проф. Xiao-Fei Li. Екземплярите от ваучера бяха депозирани в нашите лаборатории.

Референтният стандарт цитозин, уридин, гуанозин и аденозин са закупени от ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Китай). Ацетонитрил и метанол с качество HPLC бяха закупени от Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). По време на изследването е използвана чиста вода на Watson. Други химикали и разтворители са с аналитичен клас и са получени от Aladdin Reagent (Шанхай, Китай), Chengdu Kelong Reagent (Чънду, Китай) и Sinopharm Chemical Reagent (Пекин, Китай)

Апаратура и хроматографски условия

HPLC анализът беше проведен с помощта на Agilent 1260 Infinity HPLC система при 30 градуса върху Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) за пръстови отпечатъци. Елуиране с линеен градиент с елуенти А (вода/ледена оцетна киселина, 100:1, обем/обем) и В (метанол) се използва за разделяне. Програмата за градиент е разработена, както следва: 0-1 min, 3.0-4.6 процента B; 1-9 min, 4.6-6.8 процента B; 9-25 min, 6.8-51.0 процента B; 25-30 мин., 51.0-100 процента . Скоростта на потока на подвижната фаза е 1.0 mL/min. Хроматограмата се наблюдава при 254 nm. След 15-минутен период на уравновесяване, 10 μL проби бяха използвани за инжектиране.

приготвяне на пробата

Изсушените проби се натрошават на прах и 2,5 g от всяка прахообразна проба се екстрахират два пъти с 50 mL 75 процента етанол чрез обратен хладник за 1,5 часа всеки път. Екстрахираната проба се смесва и се концентрира при понижено налягане до 20 mL. След това сместа се утаява с 80 mL вода за 24 часа при 4 градуса. Впоследствие екстрактът се центрофугира при 3000 g min -1 за 10 min, за да се отдели супернатантата. Супернатантата се концентрира при понижено налягане до 25 mL. Накрая, супернатантата се филтрува през 0.22 μm Millipore филм преди HPLC анализ.

Валидиране на методологията

Методът HPLC е валидиран за прецизност, възпроизводимост и стабилност (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Валидирането беше оценено въз основа на времето на задържане (RT) и площта на пика (PA). Накрая бяха установени химически отпечатъци на 20 партиди Mylabris, за да се идентифицират интегрираните химични характеристики на множество съединения. Някои хемометрични техники бяха въведени върху химическия пръстов отпечатък за анализ.

Анализ на разпознаване на образи

Разликите между два вида на пиковите площи бяха оценени за статистическа значимост, като се използва несдвоен t-тест на Student. P-стойност по-малка от 0.05 се счита за статистически значима. Като класически неконтролиран метод, анализът на главните компоненти (PCA) се прилага широко за анализ на статистически данни. Вместо да използва много променливи, PCA взема малък брой персонални компютри, без да губи много информация, а графиките на резултата след това се визуализират за свободно разделяне на наблюденията. В това проучване PCA беше проведено върху нормализираните пикови площи на всеки компонент в HPLC пръстови отпечатъци, като се използва софтуерът SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Швеция), за да се установи разликата между двата вида Mylabris.

За по-предпочитана дискриминация между двата вида Mylabris беше приложен контролиран метод на ортогонален частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (OPLS-DA), за да се анализират разликите в нормализираните пикови площи на всеки компонент в HPLC пръстови отпечатъци. VIP стойността е претеглена сума от квадрати на OPLS теглата, отразяващи относителния принос на всяка X променлива към модела. Променливите с VIP > 1, заедно със S-графика, се считат за влиятелни за разделянето на пробите в графиките с резултат, генерирани от OPLS-DA анализ. След това бяха получени характерните химични маркери за дискриминация.

Анализ на връзката спектър-антитуморен ефект

За да изследватепротивотуморнипикова площ на ефекта за проби от Mylabris, интегрирани с данни за пръстови отпечатъци, и сравнете разликите между двата вида, корелацията между пика на пръстовия отпечатък ианти-туморса изследвани ефектите. Два метода, комбиниращи сив релационен анализ и многовариантен линеен регресионен анализ (MLRA), бяха приложени от SPSS19.0 (IBM, САЩ) и GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Китай). Theанти-туморбеше проведен тест по нашите публикувани методи [12], клетките на човешка хепатоцелуларен карцином HepG2 се поддържаха в среда RPMI1640, допълнена с 10 процента фетален волски серум. Клетките се отглеждат във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2 при 37 C. Методът SRB беше използван за оценка на разпространението наанти-тумордейности, след това се изчислява IC50 на HepG2 клетките, накрая IC50 и нормализираните пикови площи се използват за хемометричен анализ. След това бяха получени характерните маркери за активност на Mylabris.

Резултати и дискусия

Оптимизиране на условията за извличане

За достатъчна екстракция на разтворени във вода съединения от Mylabris, системата за екстракция е оптимизирана. Ултразвукът и кипенето показаха, че тези съединения могат да бъдат оптимално извлечени чрез кипене.

Оптимизиране на метода HPLC

За да се получат максимални хроматографски пикове, за да се опише общата характеристика на билката, бяха изследвани съставът на хроматографската колона, подвижната фаза и дължините на вълните на откриване (200, 254, 265 и 278 nm). Резултатите показват, че колона Phenimenex Synergy Polar-RP80, вода (съдържаща 1 процент ледена оцетна киселина) и метанол, и 254 nm са най-добрите условия за Mylabris HPLC анализ (Фигура 1), структурата на 4 стандартни вещества е показана на Фигура 2 .

Валидиране на метода

В това изследване 14 пика са добре разделени и използвани като "общи пикове". Прецизността, повторяемостта и стабилността се основават на времето на задържане (RT) и площта на пика (PA). RSD стойностите на RT и PA за прецизност (n=6) не превишават 0.2 и 4 процента, съответно; RSD стойностите на RA и PA за повторяемост (n=6) бяха под 0.2 и 4 процента, съответно, а RSD стойностите за стабилност (0-24 h) бяха по-малки от { {10}}.4 и 5 процента, съответно, което показва, че пробите са стабилни в рамките на 24 часа. Тези резултати показват, че качеството на изследваните проби и HPLC метода са стабилни и добре контролирани.

Оценка на сходството на пръстови отпечатъци

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 с изключение на MC проби (от Guizhou2 и Guizhou4), чиито прилики бяха съответно 0.888 и 0.887. Тези данни показват, че качеството на Mylabris в рамките на един вид е стабилно. Въпреки това, приликите само на три MP проби в сравнение с референтния HPLC отпечатък са > 0.930; и приликите само на две MC проби в сравнение с референтния HPLC отпечатък са > 0,921. Тези резултати показват, че двата вида Mylabris имат значителни вариации в някои пикови области.

Дискриминация на MP и MC чрез анализ на разпознаване на образи

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, пикове 1, 2, 4, 7, 9, 12 и 14 може да са най-значимите променливи при разграничаването на двата вида (Фигура 6). Пиковата група (1, 2, 4, 7, 9, 12 и 14) може да играе жизненоважна роля в разграничаването на MP и MC като характерни химични маркери.

Връзка спектър-ефект чрез сив релационен анализ

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Връзка спектър-ефект от MLRA

MLRA моделът е най-разпространеният метод за моделиране за извеждане на сложността на връзката между две или повече променливи и отговор, който е изграден по следната формула

Където Y е прогнозната стойност и представлява реакцията; Xn е независима променлива, b{{0}} е пресечната точка и bn е регресионният коефициент за Xn. В това проучване MLRA беше приложено за установяване на връзката пръстов отпечатък-ефикасност между стойностите на пиковите площи в HPLC пръстови отпечатъци и IC50 на анти-HepG2 и след това да се намерят възможните антитуморни компоненти. Свързването на данни е установено чрез общ MLRA модел, който е неподходящ за изследване на корелацията между Y (IC50) и X (PA). Модел PCA MLRA беше използван за изследване на връзката пръстови отпечатъци-ефект и първите шест компютъра с кумулативен процент на принос на вариация: 91,068 процента бяха избрани за анализ. Накрая беше създадено следното уравнение според изхода на SPSS и компютрите: IC50=1.115864 плюс （ 1.87268PA1- 699.722PA2 плюс 25.7138PA3 - 24.1528PA4 плюс 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 плюс 2.95283PA7- 15.5305PA8 плюс 13.0297PA9 плюс 22.5683PA10 - 10.3462PA11 плюс 123.762PA12 плюс 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R беше 0,682, P <>

Интегриращ анализ на два вида Mylabris

Експериментът показа, че HPLC отпечатъкът може да се използва за отразяване на химичните характеристики на Mylabris. Алгоритмите за сходство, PCA и OPLS-DA бяха приложени, за да се намери разликата между MC и MP. Пиковата група (1, 2, 4, 7, 9, 12 и 14) се определя като характерни химични маркери.

В допълнение, както GRA, така и MLRA се оказаха задоволителни методи за по-нататъшно разграничаване. Интегрирайки резултатите от анализа на GRA и MLRA, пикове 2, 4 и 14 като маркери за активност на Mylabris трябва да са отговорни за антитуморния ефект, който може да бъде фармакодинамичната материална основа на Mylabris.

Важните диференциални маркери бяха дефинирани за пика с характерни химични свойства и маркери за активност. И така, между MC и MP върху HPLC пръстови отпечатъци след анализ на връзката спектър-ефект, пиковете 2 (цитозин), 4 (неизвестен) и 14 (неизвестен) бяха важни диференциални маркери за разликите между MP и MC, както е показано на фигура 7.

Заключение

В заключение, в настоящото изследване беше предложен HPLC метод за химически пръстови отпечатъци на MP и MC. Чрез комбиниране на HPLC пръстови отпечатъци, PCA и анализ на връзката спектър-ефект като GAS и MLRA, химичните и фармакологични свойства на два близки вида Mylabris могат да бъдат дискриминирани. Това показва, че съединения от пикове 2 (цитозин), 4 (неизвестен) и 14 (неизвестен) като важни диференциални маркери играят доминираща роля в разграничаването между MP и MC. Структурата на пикове 4 и 14 трябва да бъде идентифицирана чрез друга технология. Методът на HPLC пръстови отпечатъци, комбиниран със статистически, хемометричен анализ и анализ на връзката спектър-ефект, беше демонстриран като ефективен при откриване на маркерни компоненти или за насърчаване на QC набилкови лекарства.

Препратки

1 Wang GS. Медицински употреби на Mylabris в древен Китай и скорошни проучвания. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP и др. Определяне на съдържанието на кантаридин и неговия инхибиторен ефект върху човешки хепатомни HepG2 клетки. Biomed Res-Индия 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ и др. Acyl-CoA: инхибиторни активности на холестерол ацилтрансфераза на амиди на мастни киселини, изолирани от Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Кантаридинови мехури: техника за изследване на трафика на левкоцити и производството на цитокини в местата на възпаление при хора. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Проучване на предпочитаната храна на възрастни Mylabris phalerata в различни географски популации. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Биологична характеристика на Meloidae и изкуственото им хранене. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Количествен анализ в комбинация с технология за пръстови отпечатъци и хемометричен анализ, приложен за оценка на шест вида диви парижи с помощта на UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G и др. Мониторинг и оценка на качествената консистенция на таблетките Compound Bismuth Aluminate чрез прост метод за пръстови отпечатъци с количествено съотношение, комбиниран с едновременно определяне на пет съединения и корелиран с антиоксидантни активности. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Анализ на кантаридин в фалшиви мехурчета (Coleoptera: Oedemeridae) чрез микроекстракция в твърда фаза и газова хроматография-масспектрометрия. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Проучване на GC пръстови отпечатъци на Mylabris phalerata. Китайски вестник за болнична фармация (Чин) 2010 г.; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX и Shi XF. Дигитализирани пръстови отпечатъци на Mylabris от HPCE. Централна южна аптека (Чин) 2008 г.; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX и Wang, Z. Проучване на дигитализирани HPLC пръстови отпечатъци на Mylabris. Китайски вестник за фармацевтичен анализ (Chin) 2008; 28 (7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Анти-човешки хепатоцелуларен карцином HepG 2 клетъчна активност на кантаридин, получен от провинция Гуейджоу и околните региони. Вестник за модерна медицина и здраве (Chin) 2016; 32(5): 648-650.