Водородният сулфид отслабва индуцираното от бъбреците I/R активиране на възпалителния отговор и апоптоза чрез регулиране на Nrf2-медиирано инхибиране на NLRP3 сигналния път
Mar 14, 2022
Резюме. Увреждането на бъбречната исхемия/реперфузия (I/R) може да доведе до острабъбречна недостатъчност, забавена функция на присадката и отхвърляне на присадката. Нуклеотид-свързващият домен на олигомеризация NOD-подобен рецептор, съдържащ пиринов домен 3 (NLRP3), медиирано възпаление участва в развитието набъбречнанараняване. Nrf2 ускорява активирането на сигналния път на NLRP3 и допълнително регулира възпалителния отговор. В допълнение, сероводородът играе защитна роля вбъбречно увреждане; обаче подробният основен механизъм остава слабо разбран. Настоящото проучване изследва дали пътищата на Nrf2 и NLRP3 участват в регулирането на сероводородбъбречнаI/R-индуцирано активиране на възпалителния отговор и апоптоза. Мишки от див тип и Nrf2-нокаут (KO) претърпяха операция за индуциранебъбречнаI/R чрез затягане на двустранниябъбречнадръжки. Общо 20 mg/kg MCC950 (инхибитор на NLRP3) се инжектира интраперитонеално дневно в продължение на 14 дни преди операцията.Бъбречнатъкан и кръв бяха събрани от I/R моделни мишки, за да се анализират нивата на експресия на NLRP3 и Nrf2 mRNA, нивата на експресия на NLRP3, PYD и CARD домен, каспаза-1, IL-1, Nrf2 и хемоксигеназа 1 протеинови нива, клетъчна апоптоза, секрецията на тумор некрозисфактор-, IL-1 и IL-6 цитокини ибъбречнахистопатология и функция.БъбречнаI/R активира NLRP3 и Nrf2 сигналните пътища. Обратно, лечението с MCC950 инхибира активирането на сигналния път на NLRP3 и предотвратява I/R-индуцираниябъбречно увреждане, освобождаването на цитокини и апоптозата вбъбречнаI/R модел мишки. Натриевият хидросулфид (NaHS) не само облекчава регулирането на нивата на експресия на NLRP3 протеин, но също така облекчавабъбречно увреждане,освобождаването на цитокини и клетъчна апоптоза, индуцирана от бъбречен I/R при мишки от див тип, но не и при мишки Nrf2-KO. NaHS облекчи NLRP3 възпалителната активация,бъбречно увреждане,възпалителен отговор и клетъчна апоптоза чрез Nrf2 сигнален път при бъбречни I/R моделни мишки.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ
Въведение
Бъбречната исхемия/реперфузия (I/R) е водеща причина за остраувреждане на бъбреците(AKI), което обикновено се случва по време набъбречнахирургия и предразполага индивидите към тежка дисфункция на множество органни системи. I/R-индуцирана клетъчна смърт и възпаление вътребъбречнатъкан се свързва със сложни патофизиологични процеси и насърчава намаляването набъбречна функция,като по този начин води до натрупване на метаболитни отпадъчни продукти (1). В допълнение към предизвиканата от исхемиябъбречнаувреждане на тъканите, установено е също, че реперфузията задейства сложна патофизиологична каскада, която включва прекомерното освобождаване на свободни радикали и натрупването на възпалителни клетки, впоследствие насърчавайки възпалението и допълнително влошавайки локалната исхемия и клетъчното увреждане (2).
Подсемействата на нуклеотид-свързващия домен и богатото на левцин семейство, съдържащо повторения, играят ключова роля в развитието на възпалителния отговор (3). Семейството NLR пиринов домейн съдържа 3 (NLRP3) инфламазома (известен преди като NACHT, LRR и PYD домейни, съдържащи протеин 3 и криопирин) е най-характеризираната инфламазома до момента. Все по-голям брой проучвания съобщават за връзка между NLRP3 иренаl I/R. В AKI, NLRP3 участва вбъбречнаI/R нараняване (4,5). Например нокдаунът на NLRP3 и неговия адаптер PYD и CARD домейн-съдържащ (ASC) облекчава I/R-индуцираниябъбречнадисфункция и прекомерен приток на неутрофили вбъбречна тъкан(6). В допълнение, нокдаунът на NLRP3 и/или каспаза-1 предпазва мишките от AKI, индуцирана от сепсис или липополизахарид (7,8). Тези открития предполагат, че инфламазомата NLPR3 може да играе ключова роля в патогенезата набъбречно увреждане.
Nrf2 е ендогенен антиоксидантен ген, разположен в цитозола, който се комбинира с Kelch-подобен ECH-асоцииран протеин 1 (Keap). Веднъж активиран, Nrf2 се освобождава от Keep и се премества в ядрото, където впоследствие се свързва с елементи на антиоксидантен отговор, за да инициира транскрипцията на своите низходящи антиоксидантни и цитопротективни целеви гени, като супероксид дисмутаза, каталаза, глутатион пероксидаза, глутатион-S-трансфераза изозими, каталитични и модифициращи субединици на ‑глутамил цистеин лигаза и NADP(H): хинон оксидоредуктаза (9). По-рано беше съобщено, че Nrf2 е свързан с AKI, индуциран от екологична обида, исхемия или ксенобиотици (10). Освен докладваната му защитна роля при увреждане на тъканите, предишни проучвания също показаха, че свръхекспресията на Nrf2 потиска активността на възпалението на NLRP3 и облекчава увреждането на тъканите (11-13). Въпреки това, основният механизъм на сигналния път на Nrf2 и неговия ефект върху активирането на инфламазома на NLRP3 вбъбречнаI/R остава неизвестен.Сероводородът (H2S) получи признание за способността си да регулира хомеостазата на бозайниците и основните клетъчни процеси, като автофагия (14). Редица проучвания съобщават, че H2S играе защитна роля срещу апоптоза, оксидативен стрес и възпаление вбъбречно увреждане(15-20). Независимо от това, основният защитен механизъм на H2S вбъбречно уврежданеиндуциран от I/R остава неизвестен. Следователно, настоящото проучване изследва нивата на експресия на NLRP3 и неговия адаптер, ASC, в мишки с бъбречен I/R модел и впоследствие определя ефекта на Nrf2 върху експресията на NLRP3. Настоящото проучване също има за цел да определи дали H2S защитавабъбречна тъкансрещубъбречно увреждане,възпаление и апоптоза чрез Nrf2-медиирано NLRP3 инхибиране.
Ключови думи:бъбречна исхемия/реперфузионно увреждане, Nrf2, сероводород, апоптоза, бъбречно увреждане; бъбречна недостатъчност
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Материали и методи
Създаване на бъбречен I/R модел и групи за лечение.Общо 24 мъжки мишки от див тип (тегло, 20-25 g; възраст, 6-8 седмици) бяха получени от Центъра за лабораторни животни на Академията на военномедицинските науки (Пекин, Китай). В допълнение, девет Nrf2-нокаутирани (KO) мъжки мишки (тегло, 20-25 g; възраст, 6-8 седмици) бяха получени от Junke Biological Co., Ltd. Всички протоколи за животни бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на животните на Обща болница на Медицинския университет в Тиендзин (одобрение № IRB2020‑DW‑04; Тиендзин, Китай) и бяха положени всички усилия за минимизиране на страданието на животните и броя на използваните животни. Мишките бяха аклиматизирани към околната среда в продължение на 3 дни преди експеримента при 22˚C с 40-60 процента влажност, 12-часов цикъл светлина/тъмнина и свободен достъп до вода и храна за гризачи. След като мишките бяха анестезирани с интраперитонеално (ip) 50 mg/kg натриев пентобарбитал, двустранниятбъбречнапедикулите бяха лигирани за 30 минути с помощта на скоби за микроаневризми. Впоследствие скобите за микроаневризма бяха отстранени. В контролната група операцията е извършена по същия метод; въпреки това,бъбречнадръжките не са лигирани. След операция 0.9 процента разтвор на натриев хлорид е използван, за да помогне на мишките да се възстановят. След това мишките бяха умъртвени след реперфузия за 24 часа. Общо 24 мишки от див тип бяха разделени на случаен принцип в следните шест групи: i) Контролна (Con) група (n=9); ii) I/R група (n=9); iii) I/R плюс MCC950 група (n=3); и iv) I/R плюс NaHS група (n=3). Общо девет Nrf2-KO мишки бяха разделени на случаен принцип в следните три групи: i) Con група (n=3); ii) I/R група (n=3); и iii) I/R плюс NaHS група (n=3).
Според предишни изследвания и предварителни експерименти (21, 22), 20 mg/kg MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) се инжектира (ip) дневно в продължение на 14 дни преди операцията в I/R плюс MCC950 група. Общо 50 µmol/kg натриев хидросулфид [NaHS; ip; разреден в нормален (0,9 процента) физиологичен разтвор; Сигма-Олдрич; Merck KGaA] беше инжектиран преди операцията в I/R плюс NaHS групата. След като всички експериментални процедури бяха завършени, мишките бяха умъртвени чрез цервикална дислокация и тъкан и кръв бяха събрани за последващ анализ.
Western blotting. Бъбречна тъканбеше събран от I/R моделни мишки след 24 h реперфузия, за да се анализират нивата на протеинова експресия. Накратко, общият и нуклеиновият протеин се екстрахират с помощта на RIPA буфер (Thermo Fisher Scientific, Inc.) и концентрацията на протеин се определя с помощта на комплект BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Общо 40 µg протеин на лента се отделят чрез 10 процента SDS-PAGE и се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден дифлуорид, след което се блокират с 5 процента мляко за 2 часа при стайна температура. След това мембраните се инкубират със следните първични антитела за една нощ при 4˚C: Anti-NLRP3 (1:500; кат. № ab214185; Abcam), анти-ASC (1:200; кат. № sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-каспаза-1 (1:200; кат. № sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-IL-1 (1:1,000; кат. . № ab200478; Abcam), анти-Nrf2 (1:1, 000; кат. № ab137550; Abcam), анти-хем оксигеназа (HO)-1 (1:2, 000 ; кат. № ab68477; Abcam), анти-актин (1:2,000; кат. № ab8227; Abcam) и анти-хистон H3 (1:2,000; кат. № ab176842; Abcam). След първична инкубация на антитела, мембраните се инкубират със съответните HRP-конюгирани вторични антитела (1:5, 000; кат. номера ab6721 и ab6728; и двете Abcam) за 1 час при стайна температура. Протеиновите ленти се визуализират чрез усъвършенстван комплект за хемилуминесценция (Thermo Fisher Scientific, Inc.) с помощта на система Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и полу-количествено определени с помощта на софтуер Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories , Inc.). Нивата на експресия на протеин се нормализират до -актин за цитоплазмен протеин или хистон за нуклеинов протеин.
Количествена обратна транскрипция(RT-q)PCR.Бъбречна тъканбеше събран от I/R моделни мишки след 24 h реперфузия, за да се анализират нивата на експресия на иРНК. Накратко, общата РНК се екстрахира от тъкан с помощта на TRIzol® реагент (кат. № 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Общата РНК се транскрибира обратно в сДНК, като се използва RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (кат. № K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) съгласно протокола на производителя. Впоследствие qPCR беше извършен с помощта на SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) на 7500 PCR система в реално време (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Условията на термоциклиране са както следва: Денатурация при 95°С за 5 минути; 40 цикъла при 95˚C за 15 секунди; и удължаване при 60˚C за 20 сек. Ген-специфичните праймерни последователности са изброени в Таблица I. Относителните нива на експресия на целевите гени бяха изчислени с помощта на метода 2-ΔΔCq (23) и нормализирани към нивата на експресия на GAPDH.
Имунохистохимия (IHC). Бъбречна тъканбеше събран от I/R моделни мишки след 24 h реперфузия, за да се определят нивата на експресия на NLRP3 и Nrf2. накраткобъбректъканта се фиксира при стайна температура в продължение на 48 часа в 10 процента формалин, вградена в парафин и нарязана на 5 µm секции. След това срезовете се блокират с 5 процента мляко при 37°C за 30 минути и се инкубират с анти-NLRP3 (1:100; кат. № ab214185; Abcam) или анти-Nrf2 (1:200; кат. № ab137550; Abcam) първични антитела за една нощ. След първична инкубация на антитела, срезовете се инкубират с HRP-белязано анти-заешко вторично антитяло (1:200; кат. № ab214880; Abcam) при 37˚C за 30 минути, проявено с помощта на разтвор на диаминобензидин за<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Анализ на бъбречната функция. Общо 2-3 ml кръв бяха събрани след центрофугиране при 3,000 xg за 10 минути при 4˚C от I/R моделни мишки след 24-часова реперфузия. Беше получен серум за анализбъбречна функциячрез ELISA за определяне на нивата на креатинин (кат. № C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) и уреен азот в кръвта (BUN; кат. № C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), съгласно инструкциите на производителя.Травма на бъбрецитеНивата на молекула-1 (KIM-1) в серума бяха измерени чрез ELISA (кат. № EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) съгласно инструкциите на производителя.
Оцветяване с хематоксилин и еозин.Бъбречна тъканбеше събран от I/R моделни мишки след 24 h реперфузия за оценкабъбречнахистопатологични промени. Тъканта се фиксира при стайна температура в продължение на 48 часа в 10% формалин и след това се поставя в парафин. Покрити с парафин срезове се нарязват на срезове с дебелина 5 µm и се оцветяват с 0.5 процента хематоксилин за 5 минути и еозин за 3 минути при стайна температура (25˚C). Наличието на кръвоизлив, тубулна клетъчна некроза, тубулна дилатация и образуване на цитоплазмена вакуола в тъканта се оценява както следва: 0, нормалнобъбрек;1, минимални щети; 2, умерени щети; и 3, тежки щети (24).Бъбречно уврежданерезултатите бяха изчислени по заслепен начин от двама изследователи под светлинен микроскоп (увеличение, x200; Biorevo BZ‑9000; Keyence Corporation).
ELISA анализ на нивата на TNF‑, IL‑1 и IL‑6. Събира се кръв (1 ml) от I/R модел мишки след 24 h реперфузия. Серумът се получава чрез центрофугиране при 3,000 xg за 10 минути при 4˚C. Серумните нива на TNF- (кат. № MTA00b), IL-1 (кат. № MLB00C) и IL-6 (кат. № M6000B) са анализирани с помощта на търговски комплекти ELISA (R&D Systems, Inc.), съгласно протокола на производителя върху четец на микроплаки (кат. № CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
TUNEL оцветяване.Бъбречна тъканбеше събран от I/R моделни мишки след 24 h реперфузия за оценка на клетъчната апоптоза, използвайки оцветяване с TUNEL. Накратко, тъканта се фиксира при стайна температура в продължение на 48 часа в 10 процента формалин, вградена в парафин и нарязана на срезове с дебелина 5 µm. Срезовете се инкубират с реагент TUNEL във влажна камера при 37˚C за 60 минути на тъмно (Roche Diagnostics) и се оцветяват с DAPI за 5 минути при стайна температура. След това 10 полета на микроскоп с висока мощност бяха избрани на случаен принцип и наблюдавани във всяка секция с флуоресцентен микроскоп (увеличение, x10).Статистически анализ. Данните са представени като средно ± SD от три експеримента и са анализирани от GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Статистическите разлики между две групи бяха анализирани с помощта на сдвоен t-тест на Student. Статистическите разлики между повече от три групи бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Tukey за множество сравнения. Всички данни бяха нормално разпределени и имаха еднаква вариация. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Резултати
Лечението с MCC950 предотвратява I/R-индуцираното NLRP3 сигнализиране след товабъбречно уврежданепри мишки. Възпалителният път на NLRP3 се активира и играе решаваща роля вувреждане на бъбреците(25,26). Предишно проучване също съобщава, че NLRP3 сигнализирането се активира в бъбречната тъкан на мишки на 24-ия час след реперфузия (4). Следователно 24 часа след реперфузия беше избрана като моментна времева точка за оценка. Нивата на експресия на NLRP3 протеин бяха регулирани нагоре от бъбречно I/R увреждане в I/R групата в сравнение с контролната (Con) група (Фиг. 1A и B). Подобна тенденция се наблюдава при нивата на експресия на NLRP3 mRNA (фиг. 1C). Освен това, броят на NLRP3-позитивните клетки се увеличава в I/R групата в сравнение с Con групата, както е определено чрез IHC оцветяване (фиг. 1D и E).
За да се определи основният механизъм на активиране на инфламазома на NLRP3 и ефектът върху сигналния път надолу по веригата след бъбречно I/R увреждане, мишките бяха третирани с инхибитора на NLRP3 MCC950. Резултатите от Western blotting показват, че I/R повишава нивата на протеинова експресия на NLRP3 и неговия адаптер ASC и насърчава съзряването от pro-caspase-1 до caspase-1 и pro-IL-1 до IL-1 в I/R групата в сравнение с Кон група (фиг. 2A-E). Тези резултати показват, че бъбречният I/R може да индуцира активиране на пътя на възпаление на NLRP3 и лечението с MCC950 може да понижи нивата на експресия на NLRP3, ASC, каспаза-1 и IL-1 след увреждане на бъбречния I/R.
Ефект на инфламазомата NLRP3 върхубъбречно увреждане, възпаление и апоптоза при мишки с бъбречен I/R модел. За да
за определяне на ефекта на NLRP3 върху бъбречно увреждане, I/R моделни мишки бяха третирани с инхибитора на NLRP3 MCC950. Бъбречни I/R моделни мишки показват значително повишени нива на BUN, серумен креатинин и KIM-1, който е биомаркер за бъбречно увреждане (фиг. 3A-C), което показва успешно индуциране на бъбречно I/R увреждане. Хистологичното изследване на бъбречна тъкан от мишки с I/R модел разкрива повишен хистологичен резултат, което се доказва от силно подуване на тубуларен епител, тубулна дилатация и интерстициален оток, вакуолна дегенерация и загуба на границата на четката, което предполага, че бъбречният I/R може да насърчи значително увреждане на бъбречната тъкан и увеличен хистологичен резултат (фиг. 3D и E). Инхибирането на NLRP3 чрез лечение с MCC950 значително намалява I/R-индуцираните повишения в нивата на BUN, креатинина и KIM-1 и намалява хистологичния резултат, като бъбречната тъкан показва по-малко тежко увредени тубули (фиг. 3A-E).
В допълнение, нивата на възпалителни фактори и апоптотични клетки след прилагане на MCC950 бяха анализирани в мишки с бъбречен I/R модел. Индикаторите за възпаление, включително TNF-, IL-1 и IL-6, са значително повишени в I/R групата в сравнение с Con групата (фиг. 3F-H). Освен това, в сравнение с Con групата, процентът на апоптотичните клетки беше значително увеличен на 24-ия час след реперфузия в I/R групата (фиг. 3I и J). В сравнение с I/R групата, секреторните нива на цитокини, TNF‑, IL-1 и IL-6 и процентът на апоптотичните клетки бяха намалени чрез лечение с MCC950 в I/R плюс MCC950 групата (Фиг. 3F-J ). Тези резултати показват, че инхибирането на NLRP3 инфламазомата може да предотврати освобождаването на възпалителни фактори и апоптоза на бъбречна тъкан, индуцирана от I/R.
Nrf2 е от съществено значение за индуцираната от бъбреците I/R регулация на възпалителната активност на NLRP3.Предишно проучване разкри, че Nrf2 се активира и нивата на експресия на Nrf2 целевите гени се регулират нагоре вбъбречна тъканслед бъбречно I/R увреждане (27). Подобни констатации бяха получени в настоящото изследване. Нивата на експресия на нуклеинов, общ протеин и иРНК на Nrf2 бяха анализирани на 24-ия час след бъбречно I/R увреждане. Резултатите показват, че в сравнение с групата Con, нивата на експресия на нуклеиновия, общия протеин и иРНК на Nrf2 са регулирани нагоре в I/R групата (фиг. 4A-D). В допълнение, IHC анализът установи, че нивата на експресия на Nrf2 в бъбречната тъкан са повишени, което се демонстрира от увеличения брой Nrf2-положителни
клетки, наблюдавани в групата I/R (фиг. 4E и F). Тези данни предполагат, че активирането на Nrf2 сигналния път може да инициира защитен отговор при мишки с бъбречен I/R модел. За да се провери ефектът на Nrf2 върху възпалителния път на NLRP3 при бъбречен I/R, Nrf2-KO мишки бяха използвани в последващи експерименти. Нивата на протеинова експресия на Nrf2 и неговия целеви ген, HO-1, бяха значително понижени след бъбречна I/R при KO мишки в сравнение с мишки от див тип (фиг. 5A-C). Обратно, в сравнение с I/R групата от див тип, нивата на експресия на NLRP3 и неговия адаптер, ASC, каспаза-1 и IL-1 бяха регулирани нагоре в I/R KO групата (фиг. 5A и D-G). Тези данни показват, че бъбречният I/R може да индуцира активиране на NLRP3 инфламазома в Nrf2-KO мишки.
NaHS облекчава индуцираната от I/R регулация на нивата на експресия на NLRP3 протеин при мишки от див тип, но не и при Nrf2-KO. Доказано е, че NaHS оказва влияние върху експресията на Nrf2 и активирането на инфламазома на NLRP3 при различни модели на заболяване (28-30). Настоящото проучване изследва дали ефектът на NaHS върху активирането на пътя на NLRP3 се осъществява чрез сигналния път на Nrf2 чрез анализиране на нивата на експресияна Nrf2 и NLRP3 свързани с инфламазома протеини в див тип и KO мишки.При мишки от див тип, в сравнение с Con групата, нивата на експресия на Nrf2, NLRP3, каспаза-1 и IL-1 бяха повишени от бъбречно I/R увреждане. В допълнение, лечението с NaHS допълнително повишава експресията на Nrf2 и понижава нивата на експресия на NLRP3, каспаза-1 и IL-1 в групата I/R плюс NaHS в сравнение с групата I/R (фиг. 6A-E). При мишки Nrf2-KO не са наблюдавани статистически значими разлики в нивата на експресия на Nrf2, NLRP3, каспаза-1 и IL-1 между групите I/R и I/R плюс NaHS (фиг. 6A-E). В групата I/R плюс NaHS нивата на експресия на Nrf2 бяха значително понижени, докато нивата на експресия на NLRP3, каспаза-1 и IL-1 бяха значително повишени при мишки Nrf2-KO в сравнение с мишки от див тип. Тези резултати предполагат, че NaHS може да намали активирането на NLRP3 инфламазома чрез Nrf2 сигналния път при бъбречно I/R увреждане
NaHS облекчава бъбречно увреждане, възпаление и апоптоза чрез Nrf2 сигналния път при бъбречни I/R моделни мишки. NaHS играе важна роля при бъбречно увреждане при AKI, I/R и други модели на заболяване (31). NaHS облекчава индуцираното от бъбречна I/R хистопатологично увреждане, което се демонстрира чрез намалено подуване на тубуларния епител, тубулна дилатация и интерстициален оток ибъбрекхистологични резултати в групата I/R плюс NaHS в сравнение с групата I/R при мишки от див тип (фиг. 7A и B). Индикаторите за бъбречна функция, включително креатинин, BUN и KIM-1, също бяха намалени от лечението с NaHS в I/R плюс NaHS групата в сравнение с I/R групата при див тип
мишки (фиг. 7C-E). Въпреки това, при мишки Nrf2-KO, NaHS не успя да намали повишенотобъбрекхистологичен резултат и нива на индикатори за бъбречна функция, индуцирани от бъбречен I/R. Освен това, процентът на апоптотичните клетки и освобождаването на цитокини, TNF-, IL-1 и IL-6, са намалени след лечение с NaHS в I/R плюс NaHSгрупата в сравнение с I/R групата при мишки от див тип (фиг. 7F-J). Въпреки това, NaHS не успя да упражни защитен ефект срещу апоптоза и прекомерно освобождаване на възпалителни фактори след реперфузия на бъбречна тъкан в I/R плюс NaHS групата на Nrf2-KO мишки в сравнение с I/R плюс NaHS мишки от див тип (фиг. 7F-J). Тези резултати предполагат, че NaHS може да облекчи бъбречно увреждане, възпаление и апоптоза при бъбречни I/R мишки от див тип, но не и при Nrf2-KO мишки.
Дискусия
Възпалението е ключов патогенен процес на AKI, индуциран от I/R (4). Инфламазомата NLRP3 и сигналният път на Nrf2 участват в регулирането на възпалението вувреждане на бъбреците(32). Настоящото проучване установи, че AKI, индуцирана от I/R, активира инфламазомата NLRP3 и нейния адаптер, ASC, насърчава съзряването на pro-caspase-1 и pro-IL-1 и ускорява прекомерното освобождаване на цитокини и апоптоза, което кулминира в тежка бъбречна дисфункция. Инхибирането на инфламазомата NLRP3 чрез лечение с MCC950 подобрява бъбречната функция, нивата на възпаление и апоптоза в бъбречната тъкан. В допълнение към активирането на NLRP3, бъбречният I/R също активира Nrf2 сигналния път. Въпреки това, отсъствието на Nrf2 в Nrf2-KO мишки доведе до по-нататъшно повишаване на регулацията на NLRP3 инфламазомата и нейния адаптер. Установено е, че лечението с NaHS облекчава възпалителната активност на NLRP3 чрез сигналния път на Nrf2. Освен това, бъбречно увреждане, възпаление и апоптоза бяха намалени чрез лечение с NaHS чрез Nrf2-медиирано инхибиране на NLRP3 възпалителна активация.
Бъбречното I/R увреждане е важен клиничен проблем и основна причина за AKI, което води до повишен риск от развитие на хроничназаболяване на бъбреците(33). Възпалението е важна патологична характеристика на исхемичното увреждане и възниква като следствие от активирането на имунните клетки чрез разпознаване на свързаните с патогена и увреждането молекулярни модели (34). Освен това, по-рано беше съобщено, че инфламазомата NLRP3 играе роля в редицабъбречни заболяваниячрез регулиране на възпаление, пироптоза, апоптоза и фиброза (35). Инфламазомата NLRP3 е протеинов комплекс, включващ NLRP3, неговия адапторен протеин, ASC и каспаза-1. Каспаза-1 разцепва pro-IL-1 и pro-IL-18 в зрели, активирани секреторни форми. Бъбречно увреждане, предизвикано от различни патологии, включително исхемия (33), активира инфламазомния комплекс, повишава експресията на NLRP3 и насърчава последващото съзряване на pro-IL-1 (36). NLRP3 KO, използвайки малка интерферираща РНК в мишки или бъбречни тубулни епителни клетки, упражнява защитен ефект срещу увреждане на бъбречната тъкан, предизвикано от исхемия или клетъчно увреждане в отсъствието на глюкоза (37). Настоящите резултати показват, че бъбречният I/R индуцира активиране на NLRP3 инфламазома, докато инхибирането на NLRP3 с помощта на MCC950 значително намалява нивата на експресия на NLRP3 и ASC и узряването на pro-caspase-1 и pro-IL-1 в бъбречния I/R модел на нараняване. В допълнение, инхибирането на NLRP3 от MCC950 облекчава бъбречната дисфункция и намалява хистопатологичното увреждане и резултата, прекомерното освобождаване на цитокини и броя на апоптотичните клетки. Тези данни предполагат, че активирането на NLRP3 може да играе ключова роля при бъбречно увреждане и инхибирането на NLRP3 може да упражни защитен ефект срещу тъканно увреждане и дисфункция, предизвикани от бъбречен I/R.
Предишни проучвания съобщават, че Nrf2 участва във възпалителния отговор (10-12). В допълнение, Nrf2 играе ключова противовъзпалителна, антиоксидантна или антиапоптотична роля при исхемични състояния. Активирането на сигналния път на елемента на Nrf2/антиоксидантния отговор отслабва възпалението и апоптозата в бъбречната тъкан на индуцирани от циклофосфамид мишки (38). Друго проучване демонстрира, че активирането на Nrf2 от сулфорафан инхибира активността на NF-κB сигналния път, като по този начин облекчава възпалението в дистрофичната мускулна тъкан (39). Освен това, нокдаунът на Nrf2 насърчава активирането на инфламазома на NLRP3 и води до активиране на IL-1 в модел на исхемия (11). Настоящите данни подкрепят констатациите, че бъбречният I/R може да индуцира Nrf2 сигналния път и експресията на неговите целеви гени надолу по веригата, като HO-1. Nrf2-KO мишките допълнително насърчават активирането на NLRP3 инфламазомата, което показва, че нивата на експресия на NLRP3, ASC, каспаза-1 и IL-1 са повишени в бъбречния I/R модел. Тези резултати предполагат, че Nrf2 упражнява инхибиторен ефект върху активирането на NLRP3 инфламазома при бъбречно I/R увреждане.
Предишни изследвания съобщават, чебъбрекпроизвежда H2S (40). Освен това, H2S увеличава бъбречния кръвен поток и насърчава клирънсовата функция набъбрек, както се демонстрира от повишена скорост на гломерулна филтрация (41). Освен това H2S не само облекчава възпалението и оксидативния стрес, но също така играе решаваща роля в регулирането на ендотелната дисфункция и хипертонията (28). H2S участва в регулирането на заболявания, свързани с бъбреците, като I/R увреждане и обструктивна и диабетна нефропатия (42), но основните механизми остават слабо разбрани. NHS е използван като екзогенен донор на H2S в изследвания (43). В настоящото изследване доставянето на H2S беше под формата на NaHS. Настоящите резултати показват, че NaHS облекчава увреждането на тъканите,бъбрекдисфункция, прекомерно освобождаване на цитокини и апоптоза, предизвикана от бъбречна I/R. По-рано беше съобщено, че NaHS предотвратява микроглиалното активиране и възпалението, предизвикано от увреждане на нервите, чрез регулиране на Nrf2 сигналния път (44). В съответствие с хипотезата, че NaHS регулира възпалението чрез сигналния път на Nrf2, настоящите резултати показват, че NaHS повишава нивата на експресия на Nrf2 и инхибира нивата на експресия на NLRP3 в мишки с бъбречен I/R модел. Освен това, Nrf2 KO премахна регулаторните ефекти на NaHS върху Nrf2 и инфламазомата NLRP3. Настоящото проучване също изследва ролята на Nrf2 върху бъбречното увреждане и функция след лечение с NaHS; инхибирането на Nrf2 не само частично обръща защитния ефект на NaHS върхуувреждане на бъбрецитеи дисфункция, но също така обръща инхибиторния ефект на NaHS върху възпалителния отговор и апоптозата след бъбречна I/R. Тези резултати предполагат, че Nrf2 може да е необходим за защитния ефект на NaHS върху AKI, индуциран от I/R, и NaHS може да упражнява своята защитна роля срещу увреждане на тъканите чрез Nrf2-медиирано инхибиране на NLPR3 инфламазома. В заключение, I/R-индуцираното бъбречно увреждане активира NLRP3 инфламазомата и Nrf2 сигналния път, а инхибирането на NLRP3 инфламазомата предпазва от бъбречно увреждане. Nrf2 регулира негативно NLRP3 възпалителна активация и облекчава NaHSувреждане на бъбрецитеи дисфункция, апоптоза и възпалителна реакция чрез Nrf2-медиирано инхибиране на инфламазома на NLRP3. Тези резултати предоставят нова представа за потенциална бъдеща цел за лечение на бъбречно исхемично увреждане.
