Експресия на имунни гени и функционални мрежи в отделни класове на лупусен нефрит Ⅰ

РЕЗЮМЕ

Цел Да се ​​проучи полезността на платформата NanoString визясняващ бъбрекимунни транскрипти за клас III, IV и V лупусен нефрит (LN), използвайки ретроспективна кохорта отфиксирани с формалин, вградени в парафин(FFPE) тъкан от бъбречна биопсия.

Методи: Анализът на имунния генен транскрипт беше извършен с помощта на платформата NanoString nCounter върху РНК от LN (n=55), болест на тънката базална мембрана (TBM) (n=14) и мембранозна нефропатия (MN) (n{ {2}}) FFPEбъбречна биопсиятъкан. LN пробите се състоят от единични биопсии от клас III (n=11), IV (n=23) и V (n=21) без смесени лезии. Диференциалната генна експресия беше извършена с NanoString nSolver, с визуализации на вулканични графики и топлинни карти, генерирани в R. Значителни транскрипти бяха разпитани, за да се идентифицират функционални мрежи, използвайки термини на STRING и генна онтогенеза.

НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ БИЛКОВА ФОРМУЛА НА ЦИСТАНША ЗА БЪБРЕЦИ

Резултати В сравнение с TBM, идентифицирахме 52 значително диференциално експресирани гена, общи за всичките три класа LN. Анализът на пътя показа обогатяване за сигнализиране на интерферон тип I (IFN), комплемент и пътища на MHC II, като повечето показват най-висока експресия в клас IV LN. Нашите LN биопсии от клас IV също показаха значителна регулация на NF-κB сигнализиране и имунологично обогатяване в сравнение с биопсии от клас V LN. Транскрипти от пътя на IFN тип I разграничават клас V LN от MN.

Заключение Нашият транскриптомичен анализ на целия бъбречен участък даде представа за молекулярния профил на клас III, IV и V LN. Данните подчертаха важни пътища, общи за трите класа и пътища, обогатени в нашите LN биопсии от клас IV. Способността за разкриване на молекулярни пътища в LN с помощта на FFPE цели биопсични срезове може да има клинична полза при избора на лечение за LN.

ВЪВЕДЕНИЕ

Лупусен нефрит(LN) е важна проява на системнолупус еритематозус(SLE) и се развива при приблизително 40% от пациентите.1 Разпространението му се влияе от възрастта (по-висока при SLE в детска възраст) и етническа принадлежност (по-висока при пациенти, които не са от бялата раса) и е обратно пропорционална на социално-икономическия статус.2бъбречна биопсияе важна част от управлението на LN3 4 и са положени значителни усилия за свързване на промените, наблюдавани в биопсията, с патогенезата, избора на лечение и прогнозата.1 От решаващо значение за това е разработването на система за класификация на LN, която включва стандартизирани дефиниции на биопсични лезии, за да се намали променливостта между докладите.

Консенсусната класификация на LN5 от Международното дружество по нефрология/Бъбречна патология (ISN/RPS) от 2003 г. описва шест класа: минимален мезангиален LN (клас I); мезангиален пролиферативен LN (клас II); фокален LN (клас III); дифузна LN, която може допълнително да бъде разделена на дифузна сегментна (клас IV-S) и дифузна глобална (клас IV-G) пролиферативна LN; мембранен LN (клас V) и напреднал склерозиращ LN (клас VI). Активни (А, напр. ендокапилярна хиперцелуларност, фибриноидна некроза, клетъчни и микроклетъчни полумесеци) и хронични (С, напр. гломерулна склероза, фиброзни полумесеци) гломерулни лезии също са дефинирани и обозначени, когато се описват класове III и IV. Например, клас IV-G (A) описва дифузен глобален пролиферативен LN с активни лезии. Предложена е актуализация на тази класификация.6 Препоръките включват премахване на подразделенията на клас IV-S и IV-G, тъй като те не влияят на резултата. В мета-анализ, появата на едно от дветекраен стадий на бъбречно заболяванеилиудвояване на серумния креатининне се различава между класове IV-S и IV-G.7 Беше също така предложено да се заменят активните и хроничните дескриптори с индекси на активност и хроничност, получени от NIH за активност на лупус и точкова система,8 като по този начин се даде възможност за количествена оценка на активността (a резултат от 0 до 24) и хроничност (резултат от 0 до 12).

Класът LN е критичен за информиране на ръководството.3 Имуносупресията се препоръчва при активен LN клас III и IV, но не и при LN клас II. Решението за започване на имуносупресия при LN от клас V се влияе от степента на протеинурията и нейния отговор на ренин-ангиотензин-алдостероновата блокада. Неуспешното контролиране на протеинурията 12 месеца след лечението е свързано с прогресиране до хронично бъбречно заболяване9-11, така че целта на управлението е да се намали протеинурията с цел постигане на пълен клиничен отговор (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Само класът LN е по-малко стабилен при информиране на резултатите, защоторискови фактори за развитие на хронично бъбречно заболяваневключватклинични характеристикии тъй като те включват хистологични характеристики, които не са обхванати от дефинициите на клас LN. Те включват степента на интерстициална фиброза и тубулна атрофия (IFTA) и специфични гломерулни лезии като фибриноидна некроза и фиброзни полумесеци.12 Количественото определяне на избрани и добре дефинирани индивидуални бъбречни лезии може да даде информация за прогнозата. Това е очевидно при IgA нефропатия, при която оценката на мезангиалната клетъчност, ендокапилярната хиперцелуларност, сегментарната склероза, тубулната атрофия, интерстициалната фиброза и полумесеците за формиране на резултата MEST-C е показала, че подпомага прогнозирането на риска.13–15 Предложените ревизии на ISN /RPS 2003 консенсусна класификация на LN може да се справи с тези недостатъци6, но все още се основава на използването на морфология. Следователно е необходимо да се проучат молекулярните пътища в биопсиите на LN и да се разбере как те се отнасят към класовете LN16 17 и резултатите от лечението.18 19 По отношение на клиничната полезност, транскриптомичният анализ на биопсии на бъбреците е най-голям напреднали в диагностицирането на медиирано от антитяло отхвърляне на бъбреците, при което увеличаването на експресията на генни транскрипти в биопсична тъкан, в очакване на валидиране, е добавено към валидирани морфологични критерии.20 За да се определи ползата от използване на транскриптомични данни за подобряване на клиничната полезност на бъбрека биопсия при SLE, използвахме технологията NanoString, за да изследваме експресията на 750 имунни и свързани с възпаление транскрипта във фиксирани във формалин парафинови срезове (FFPE) от 55 LN биопсии, 14 биопсии с болест на тънката базална мембрана (TBM) и 9 биопсии с мембранозна нефропатия (МН).

МЕТОДИ

Проби: Бъбречна биопсична тъкан FFPE беше получена от архивирани LN, TBM и MN проби, излишни за клинична употреба и където имаше подходяща тъкан за анализ. Лупусни биопсии със смесени лезии или значителни белези бяха изключени. TBM се използва като контрол на заболяването поради липсата на нормални бъбречни биопсии. Клиничните параметри бяха събрани от здравните досиета ретроспективно. Резултатната матрица за интерферон (IFN) беше получена, както беше съобщено по-рано.21 Пълният отговор беше определен като съотношение протеин/креатинин в урината (uPCR) на<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% до 1 година след биопсия. Частичният отговор се определя като uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

Екстракция на РНК

Шест цели тъканни срези с дебелина 10 μm бяха получени чрез микротом от всеки FFPE блок, след отстраняването на два 4 μm среза. За да се предотврати кръстосано замърсяване, оборудването беше почистено с RNase Away между пробите и за всяка проба беше използвано ново острие. Изолирането на цялата тъканна РНК беше извършено същия ден с помощта на RNeasy FFPE Kit (Qiagen, #73504) и концентрацията на РНК беше оценена чрез NanoDrop ND1000 спектрофотометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; онлайн допълнителни данни S1).

Транскриптомен анализ

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >двойно (средно+2 SD) на сонди за отрицателна контрола. Преброяването беше нормализирано до средното геометрично на 10 домакински гена (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB и ZC3H14), избрани, тъй като бяха експресирани във всички типове проби. Нормализираният брой за всички проби е изброен в онлайн допълнителни данни S2.

Статистически анализ

Диференциалната генна експресия (DGE) беше извършена с помощта на алгоритъм за бърз/приблизителен анализ на решаващия усъвършенстван анализ (V.4), който използва опростения отрицателен биномен модел за всички проби, освен когато алгоритъмът не се сближава и се използва методът на линейна регресия. LN, MN или LN клас (III, IV и V) бяха използвани като независими променливи и TBM като наша референтна група. Праговият брой беше зададен на 100, а честотата на наблюдение в рамките на пробите беше зададена на 8%; P стойността беше коригирана с помощта на метода на Benjamini-Hochberg с праг на фалшиво откриване за зададен на 0.05. Графиките на вулкани са произведени с помощта на пакета Enhanced Volcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) в R.22 Функционалната визуализация на мрежата за асоцииране на протеини е извършена с помощта на базата данни STRING (https:// string-db.org/) , използвайки пълната мрежа STRING. Ръбовете на мрежата бяха определени чрез увереност и взаимодействията бяха настроени на най-високия резултат за взаимодействие с доверие (по-голямо или равно на 0,9). Прекъснатите възли в мрежите не бяха показани. Значителни диференциално експресирани гени бяха оценени за обогатяване на термините на генната онтология (GO) (биологични процеси, молекулярни функции, клетъчен компонент), реактомни пътища и STRING локални мрежови клъстери. Мрежите за визуално взаимодействие бяха генерирани с функционални обогатявания в GO термини (биологични процеси) и STRING анализ. Диаграмата на Venn с пропорционална площ на припокриващи се диференциално експресирани гени между LN подкласове беше генерирана с BioVenn (www.biovenn. nl).23 Данните от софтуера за решаване на усъвършенствани анализи бяха прочетени в R статистическата среда и визуализацията на данните беше извършена с помощта на boxplots, анализ на главните компоненти, графики и топлинни карти на вулкани. Топлинните карти бяха генерирани с помощта на Z резултати от нормализирани преброявания и pheatmap в R. Клъстерите бяха анализирани с помощта на точния тест на Fisher. Анализът на дисперсията с теста за множество сравнения на Sidak беше използван за сравнение на множество групи. Данните бяха анализирани с помощта на GraphPad Prism (V.8.0).

Декларация за участие на пациента и обществеността (PPI).

Това проучване беше част от консорциума MASTERPLANS и сътрудниците на пациентите участваха във всяко работно направление, включително това проучване. Речник на термините беше изготвен от PPI, за да позволи по-нататъшно ангажиране с по-широката пациентска общност, а резултатите от изследванията бяха включени в дните за непрофесионален преглед. Неспециализирани рецензии на публикации се споделят на уебсайта на MASTERPLANS (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ЗА БЪБРЕЦИ