In Silico Дизайн на безразборна химерна мулти-епитопна ваксина срещу Mycobacterium Tuberculosis Част 1

Резюме

Туберкулозата (ТБ) е глобална заплаха за здравето, която убива приблизително 1,5 милиона души всяка година. Ерадикацията на Mycobacterium tuberculosis, основният причинител на туберкулозата, е все по-голямо предизвикателство поради появата на обширни резистентни към лекарства щамове. Ваксинацията се счита за ефективен начин за защита на гостоприемника от патогени, но единствената клинично одобрена ваксина срещу туберкулоза, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), има ограничена защита при възрастни. Установено е, че мулти-епитопните ваксини повишават имунитета към болести чрез селективно комбиниране на епитопи от няколко кандидат-протеина.

Туберкулозата е инфекциозно заболяване, причинено от бактерията Mycobacterium tuberculosis, което засяга главно белите дробове, но може да засегне и други органи. Имунитетът играе важна роля в развитието и лечението на туберкулозата.

В случай на недостатъчен имунитет Mycobacterium tuberculosis може лесно да нахлуе в човешкото тяло и да се развие в туберкулоза. Например компрометирана имунна система от определени заболявания или медицински лечения увеличава риска от туберкулозна инфекция. Освен това фактори като недохранване, лошо качество на живот и прекомерен стрес също могат да отслабят имунитета, което води до развитие на туберкулоза.

Следователно поддържането на добро здраве и укрепването на имунитета е много важно за предотвратяване на туберкулозата. Имунитетът може да бъде подсилен чрез здравословна диета, редовен начин на живот, подходящи упражнения и достатъчно сън, което може ефективно да намали риска от заразяване с различни заболявания, включително туберкулоза.

Имунитетът също е важен за лечението и възстановяването, когато туберкулозата вече е възникнала. Колкото по-силна е имунната система, толкова по-ефективно тялото може да се защити срещу атаката на туберкулозния бацил и да произведе достатъчно антитела за борба с болестта. Следователно поддържането на адекватно хранене, правилните упражнения и положителното отношение могат да подобрят имунитета и да насърчат възстановяването.

В заключение, съществува силна връзка между имунитета и туберкулозата. Поддържането на добро здраве и повишаването на имунитета е един от важните начини за профилактика и лечение на туберкулозата. Нека гледаме позитивно на живота, поддържаме здравословен начин на живот и стоим далеч от болестите. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като пепелта от месо съдържа различни биологично активни компоненти, като полизахариди, две гъби, Huang Li и др. Тези компоненти могат да стимулират имунната система Различни видове клетки в системата, повишават имунната си активност.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Това проучване имаше за цел да създаде многоепитопна ваксина срещу туберкулоза, използвайки имуноинформатичен подход. Чрез функционално обогатяване ние идентифицирахме осем протеина, секретирани от M. tuberculosis, които са или необходими за патогенезата, секретирани в извънклетъчното пространство, или и двете. След това анализирахме епитопите на тези протеини и избрахме 16 хелперни Т лимфоцитни епитопа с интерферон-индуцираща активност, 15 цитотоксични Т лимфоцитни епитопа и 10 линейни Bклетъчни епитопа и ги конюгирахме с адювант и Pan HLA DR-свързващ епитоп (PADRE), използвайки подходящо линкери.

Нещо повече, ние предвидихме третичната структура на тази ваксина, нейното потенциално взаимодействие с Toll-Like Receptor-4 (TLR4) и имунния отговор, който може да предизвика. Резултатите показват, че тази ваксина има силен афинитет към TLR4, което може значително да стимулира CD4 плюс и CD8 плюс клетките да секретират имунни фактори и В лимфоцитите да секретират имуноглобулини, за да се получи добър хуморален и клетъчен имунитет. Като цяло, този мулти-епитопен протеин се прогнозира като стабилен, безопасен, силно антигенен и силно имуногенен, който има потенциала да служи като глобална ваксина срещу туберкулоза.

1. Въведение

Туберкулозата (ТБ), силно заразна болест, причинена от Mycobacterium tuberculosis, е класирана от Световната здравна организация (СЗО) като водеща причина за смърт от един инфекциозен агент [1–3]. През 2021 г. прогнозният брой на смъртните случаи и новите случаи на туберкулоза достигна съответно 1,6 милиона и 10,6 милиона [4]. Понастоящем клиничното лечение на туберкулоза е сравнително оскъдно и се използва главно комбинацията от множество антимикробни лекарства.
Този химиотерапевтичен цикъл е много дълъг, обикновено отнема девет до дванадесет месеца или дори повече [5], което увеличава риска от резистентни към лекарства мутации в M. tuberculosis [6,7]. През последните години химиотерапията стана по-малко ефективна поради появата и нарастващия дял на многолекарствени и екстензивно резистентни на лекарства M. tuberculosis [6]. Предотвратяването на развитието на туберкулоза може да бъде по-ефективно от лечението. Добре известно е, че ваксинацията е ефективен начин за защита на гостоприемника от патогенни бактерии [8].

Понастоящем Bacillus Calmette-Guérin (BCG), разработена преди повече от 100 години, е единствената клинично одобрена ваксина срещу туберкулоза [9]. За съжаление, BCG предпазва само новородени и кърмачета и е до голяма степен неефективен срещу юноши и възрастни [2,10], въпреки че СЗО съобщава, че 89 процента от случаите на туберкулоза през 2021 г. са били възрастни [4]. Следователно има спешна необходимост от разработване на нова и ефективна противотуберкулозна ваксина, особено за юноши и възрастни.

Разработването на ваксина срещу туберкулоза се усложнява от множество характеристики на микобактериите, като латентна инфекция, персистиране и избягване на имунитета [11–13]. Идеалната ваксина срещу туберкулоза трябва да бъде проектирана така, че да се насочва към протеините/пътищата, отговорни за тези свойства в M. tuberculosis и да може ефективно да индуцира CD4 плюс и CD8 плюс Т-клетъчно-медиирани имунни отговори [14].

Нещо повече, една ефективна ваксина трябва да е насочена и към главните комплекси за хистосъвместимост (MHC) на гостоприемника, които са силно полиморфни [15]. Тези характеристики поставят много високи изисквания към универсалността на ваксината, които очевидно не могат да бъдат постигнати с един естествен протеин. Мултиепитопната ваксина, рекомбинантен протеин, състоящ се от серия от припокриващи се епитопи (пептиди) [16], е нов тип кандидат за ваксина, който може да се справи с горните проблеми.

През последните години многоепитопните ваксини привлякоха голямо внимание поради своите предимства на по-висок имунитет и по-ниска алергенност в сравнение с конвенционалните ваксини [17,18]. Понастоящем са създадени мулти-епитопни ваксини срещу много патогенни микроорганизми, включително Shigella spp. [19], вирус на шап [20], Helicobacter pylori [21,22], вирус на хепатит В [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], вирус Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] и вирус на левкоза [29].

По-специално, появата на пандемията от COVID{0}} засили приложението на тази технология [16,30–32]. Що се отнася до туберкулозата, няколко мулти-епитопни ваксини са предназначени да се насочат към присъщо активна туберкулоза [33–39] и латентна туберкулоза [40,41]. Сред тях три кандидати за ваксина са проектирани под формата на ДНК [34,36,40] и два от тях са включили епитопи в протеиновите гръбнаци за генериране на рекомбинантни ваксини [34,36].

Трябва да се отбележи, че кандидат протеините за някои от горните многоепитопни ваксини са избрани на случаен принцип и покритието на популацията на тези ваксини изисква допълнителни проучвания.

Освен това бяха проектирани две мулти-епитопни кандидати за ваксина срещу туберкулоза с широко покритие на популацията, единият епитоп беше избран от имуногенни екзозомни везикулни протеини с патогенни свойства [39], а другият не се фокусира върху кандидат протеини, а директно избира силно запазени и експериментално валидирани епитопи от базата данни за имунни епитопи (IEDB) [38]. Въпреки това, тези кандидат протеини нямат функционално обогатяване и способността на кандидатите за ваксина да индуцират секреция на интерферон- (IFN-) остава да бъде подобрена.

Предишно проучване заключава, че рационалното оптимизиране на епитопите може да бъде постигнато чрез комбинация от капацитет на свързване на МНС и способността на епитопа да реагира с Т-клетъчните рецептори [42]. Освен това те прогнозираха, че ваксини с цитотоксични Т лимфоцити (CTL) A1, A2, A3, A24 и B7 свързващи епитопи ще имат покритие от почти 100 процента в основните етнически групи (чернокожи, азиатци, испанци и кавказци).

Досега обаче не е имало подобен подход за проектиране на ваксина срещу туберкулоза. В това проучване, ние проектирахме изключително безразборна мулти-епитопна ваксина срещу туберкулоза, използвайки различни антигенни характеристики на осем функционално обогатени протеини. Кандидатът за химерна ваксина притежава 15 CTL епитопа, 16 хелперни Т лимфоцитни (HTL) епитопа с IFN- -индуциращи свойства и 10 линейни В-клетъчни епитопа. Имуноинформационният анализ показа, че този кандидат за ваксина е „всеобхватен“, което го прави потенциален крайъгълен камък за постигане на „Стратегията за край на туберкулозата“.

2. Материали и метод

2.1. Селекция на протеин и извличане на последователност

За да конструираме мулти-епитопна ваксина срещу туберкулоза, първо избрахме протеини от комплекса M. tuberculosis, които са депозирани в базата данни IEDB [43] и са валидирани като MHC клас I и II свързващи епитопи. Аминокиселинните последователности (първична структура) на протеини от щам M. tuberculosis H37Rv са получени от базата данни UniProt [44]. Независими от подравняването прогнози на проспективни антигени, базирани на физикохимични свойства, бяха получени от сървъра VaxiJen 2.0 [45], който претърпя автоматична и кръстосана ковариантна (ACC) трансформация на протеинови последователности в единен вектор на основна аминокиселина свойства, като прагът на антигенност е определен на 0.4 за всеки бактериален протеин [45,46].

Функционалната анотация на протеини беше оценена с помощта на база данни за анотация, визуализация и интегрирано откриване (DAVID) 6.8 [47]. Секретираните протеини бяха допълнително обогатени с помощта на две категории: извънклетъчно пространство и патогенеза чрез базите данни DAVID и BioCyc [48], съответно. Протеомът на Homo sapiens GRCh38.p13 беше изтеглен във формат FASTA от базата данни на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) [49]. BLASTp се използва за прогнозиране на хомология (E-стойност =1e-5) между секретирани протеини и протеини на H. sapiens.

2.2. Предсказване на Т-клетъчен епитоп

Прогнозирането и изборът на епитопи са решаващи стъпки в конструирането на мулти-епитопни ваксини. MHC I молекулите свързват къси пептиди (9-11 аминокиселини), тъй като пептид-свързващата цепнатина на MHC I молекулите, състояща се от една верига, е затворена [50]. Свободно достъпният NetMHCpan-4.1 [51] беше използван за предсказване на CTL епитопи, който използва NNAlign_MA за генериране на процентни рангове (процентен ранг) въз основа на комбинация от MHC I афинитети на свързване и елуирани лиганди .

"Процентното класиране" на търсена последователност се определя чрез сравняване на прогнозния резултат с разпределението на прогнозните резултати за съответния МНС, изчислен с помощта на набор от произволно избрани естествени пептиди. Епитопите с процентно класиране < 0.5 процента се считат за силни свързващи вещества, докато епитопите с процентно класиране < 2 процента се считат за слаби свързващи вещества [51].

Въпреки че до 12 супертипа MHC клас I епитопи могат да бъдат предвидени на сървъра, ние използвахме само A1, A2, A3, A24 и B7, защото тези пет супертипа покриват 100 процента от основните човешки раси [42] . Избрахме силни свързващи вещества и прогнозирахме тяхната антигенност, използвайки VaxiJen2.0 [45], след което прогнозирахме имуногенност от клас I, използвайки Международната епитопна база данни (IEDB) [52], която използва 3-кратно кръстосано валидиране.

И накрая, ние подредихме епитопи, които са както антигенни, така и имуногенни според процентното класиране и избрахме 15 епитопа с нисък резултат, три за всеки супертип и поне един за всеки кандидат протеин, с изключение на кандидат протеин, който не може да има силен CTL свързващ епитоп което е антигенно и имуногенно. И накрая, стойностите на IC50 за всеки CTL епитоп бяха предвидени от NetMHC-4.0 [53].
Клас II MHC молекули се свързват с антигенни пептиди и полученият комплекс може да бъде разпознат от HTL. Обикновено дължината на антигенните пептиди варира от 12 до 20 аминокиселинни остатъка, но често се наблюдават пептиди с дължина между 13 и 16 остатъка [54].

{{0}}мерите са най-разпространените MHC II епитопи за M. tuberculosis и са депозирани в IEDB. В резултат на това използвахме NetMHCIIpan-4.0 [51,55] за прогнозиране на свързването на 15-mer пептиди с човешки левкоцитен антиген-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, и H-2–1 алел. Прогнозата се основава и на NNAlign_MA с процентно класиране от < 2 процента и < 10 процента, считани съответно за силни и слаби свързващи вещества [51].

Също така, ние прогнозирахме 15-mer IFN индуциращи епитопи за кандидат протеини, използвайки IFNepitope сървъра [56], който използва хибриден подход на поддържаща векторна машина, който позволява виртуален скрининг на IFN{2}}индуциращ пептид/епитоп в пептид библиотека, състояща се от IFN- -индуцируеми и неиндуцируеми MHC II свързващи вещества, които активират Т-хелперни клетки. След това прогнозирахме антигенността на IFN-индуциращите епитопи [45] и накрая избрахме 16-те най-промискуитетни епитопа, които бяха силно свързващи се с MHC-II, IFN-индуциращи и антигенни.

Важно е да се отбележи, че сигналните пептиди са отстранени от кандидат протеини преди прогнозирането на епитопа. В това проучване сигналните пептиди бяха скринирани с помощта на SignalP 5.0 [57] и TargetP2.0 [58].

2.3. Предсказване на линеен В-клетъчен епитоп

Линейни В-клетъчни епитопи (16-mers) бяха предвидени с помощта на ABCpred [59,60] с праг по подразбиране от 0.51. Освен това, за да увеличим надеждността на резултатите от прогнозата, ние също използвахме BepiPred 2.0 [61] за прогнозиране на линейни В-клетъчни епитопи. Епитопите, получени от тези два софтуера, бяха допълнително подложени на предсказване на антигенността с помощта на VaxiJen2.0 [45]. Накрая, ние избрахме десет линейни В-клетъчни епитопа въз основа на високи ABCpred резултати и антигенност, с поне един епитоп, избран за всеки кандидат протеин.

2.4. Конструиране на мулти-епитопна ваксина кандидат с химерни свойства

Проектираната мулти-епитопна ваксина съдържа един HBHA (хепарин-свързващ хемаглутинин) адювант, един Pan HLA DR-свързващ епитоп (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 линейни В-клетъчни епитопа и един His × 6 етикет (фиг. 3). Използвани са линкери за свързване на епитопи, предотвратяване на производството на съединителни епитопи и подобряване на процесията и регенерацията на отделни епитопи в химерни ваксини [62].

За конструирането на този кандидат за ваксина, HBHA адювантът (UniProt ID: P9WIP9) беше разположен на N-края и свързан с PADRE надолу по веригата чрез EAAAK линкер. След това HTL епитопите, съединени от GPGPG линкерите, бяха свързани с PADRE. Освен това, CTL епитопи, присъединени от AAY линкера, бяха свързани с HTL епитопи чрез HEYGAEALERAG линкера, който също присъедини CTL епитопната единица към линейни В-клетъчни епитопи, свързани с помощта на KK линкери. Накрая, His × 6 етикет беше прикрепен към С-края на химерния протеин.

2.5. Антигенност, алергенност и физикохимични свойства

Антигенността на многоепитопната ваксина и осемкомпонентните протеини бяха предсказани от сървъра VaxiJen 2.0 [45], докато алергенността на тези протеини беше предсказана от сървъра AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 използва аминокиселинни E-дескриптори, ACC трансформация на протеинови последователности и k-най-близки съседи (kNN) за класифициране на алергени.

Методът постигна 85,3 процента точност с 5-кратно кръстосано валидиране. За прогнозиране на физикохимични свойства, като полуживот, изоелектрична точка, индекс на нестабилност, алифатен индекс и голяма средна стойност на хидропатичност (GRAVY) на тази ваксина с множество епитопи, беше използван сървърът ExPASy ProtParam [64].
Освен това, разтворимостта на мулти-епитопния ваксинен пептид беше оценена с помощта на сървър proteinSol (PROSO II) [65] въз основа на класификатор, използващ фините разлики между добре познатите неразтворими протеини от TargetDB и разтворимите протеини от TargetDB и PDB [ 66]. При оценка чрез 10-кратно кръстосано валидиране, той постигна 71.0 процента точност (площ под ROC крива=0.785).

2.6. Имунна симулация

За характеризиране на профила на имунния отговор и имуногенността на ваксината бяха извършени имунни симулации in silico с помощта на сървъра C-ImmSim [67]. C-ImmSim прогнозира имунни взаимодействия, използвайки специфични за позицията точкови матрици, получени от техники за машинно обучение за прогнозиране на пептиди.
Той едновременно симулира три отделения, представляващи три отделни анатомични области, открити при бозайниците: (i) костния мозък, където хемопоетичните стволови клетки са симулирани за производство на нови лимфоцити и миелоидни клетки; (ii) тимуса, където са избрани наивни Т клетки, за да се избегне автоимунитет; и (iii) лимфен орган като лимфни възли.

За ефективно иницииране и усилване на ваксината, ние следвахме подхода на [68], където две инжекции бяха приложени през четири седмици. Всички параметри на симулация бяха зададени на стойности по подразбиране, с времеви стъпки, зададени на 10 и 94 (всяка времева стъпка е осем часа).

2.7. Прогноза за неподреден регион

Присъщо неуредени региони (IDRs) присъстват в много протеини. Неподреденият регион беше предвиден с помощта на DISOPRED3 [69], който използва DISOPRED2 и два други модула, базирани на машинно обучение, обучени на големи IDR за идентифициране на неподредени остатъци. Тогава те бяха анно

2.8. Прогноза за вторична и третична структура

Вторичната структура на проектираната ваксина е предсказана от сървъра PSIPRED 4.0 [70], който първо използва PSI-BLAST за идентифициране на последователности, тясно свързани с протеина на заявката. Третичната структура на тази ваксина е предсказана с помощта на сървъра за усъвършенстване на сглобяване с итеративна нишка (I-TASSER) [71].

Има четири ключови стъпки в моделирането на ITASSER; а) идентификация на шаблона за нишка; б) итеративна симулация на сглобяване на структура; в) подбор и усъвършенстване на модела; и г) базирана на структура функционална анотация [72,73].

I-TASSER генерира пет модела, които бяха проверени с помощта на ProSA-web [74] и моделът с най-нисък Z-резултат беше избран за по-нататъшно усъвършенстване. ProSA-web сравнява резултатите на модела, получени от експериментално проверени структури, депозирани в PDB. Графика на местния резултат за качество помага да се идентифицират проблемните области в модела и същите резултати бяха представени с помощта на цветен код при представянето на 3D структурата. Това е полезно за ранно структурно определяне и усъвършенстване.

2.9. Усъвършенстване на третичната структура

„Грубият“ 3D модел на кандидата за ваксина, получен от ITASSER, беше усъвършенстван на две стъпки с помощта на два сървъра; първо с ModRefiner [75], последван от GalaxyRefine [76]. ModRefiner използва C следи, за да повлияе на конструкцията и усъвършенстването на протеини, получени чрез минимизиране на енергията на атомно ниво в две стъпки.

Първо, C следите бяха използвани за конструиране на основната верига, последвано от усъвършенстване на ротамерите на страничната верига и гръбначните атоми, използвайки базирани на физиката и знанията съставни силови полета. GalaxyRefine използва множество шаблони за генериране на надеждни основни структури, докато ненадеждните цикли или терминали са генерирани чрез моделиране, базирано на оптимизация.

2.10. Валидиране на третична структура

Усъвършенстваната структура на кандидата за ваксина беше потвърдена от графики на Ramachandran, генерирани от базите данни PROCHECK [77] и MolProbity [78]. Графиките на Рамачандран оценяват конформацията на гръбнака на протеините чрез разделяне на аминокиселинните остатъци на две области: разрешени и забранени. PROCHECK използва стереохимия, за да оцени нетното качество на протеиновите структури, като ги сравнява с усъвършенстваните структури при същата резолюция и след това представя региони, изискващи допълнителен анализ.

Molprobity валидира модели на локални и глобални макромолекули (протеини и нуклеинови киселини) чрез комбинация от рентгенови, NMR, изчислителни и cryoEM критерии [79]. Силата и чувствителността за оптимизиране на разположението на водорода и анализ на контакта с всички атоми се използват широко в актуализирана версия на критериите за ковалентна геометрия и ъгъл на усукване [80].

2.11. Прекъснати В-клетъчни епитопи

Прекъснатите В-клетъчни епитопи в нативната протеинова структура бяха предсказани с помощта на ElliPro [81]. ElliPro прилага три алгоритъма за приближаване на формата на протеина като елипсоид, изчислява индекса на изпъкналост на остатъка (PI) и групира съседните остатъци въз основа на техните PI стойности. ElliPro предоставя на всеки изходен епитоп оценка, описана като средната стойност на PI за епитопния остатък. Елипсоид с PI стойност 0.9 се състои от 90 процента от съдържащите се протеинови остатъци, докато останалите 10 процента от остатъците лежат извън елипсоида. За всеки епитопен остатък стойността на PI се изчислява от центъра на масата на остатъка, разположен извън възможно най-големия елипсоид.

2.12. Молекулярен докинг на химерни протеини

Молекулярно свързване на проектираната ваксина (лиганд) с Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) имунен рецептор беше извършено с помощта на Patchdock [82]. Първите 10 модела след това бяха прецизирани с помощта на FireDock [83]. PatchDock заменя представянето на повърхността на молекулите с точки на Конъли с вдлъбнати, изпъкнали и плоски петна.

След това моделите бяха оценени въз основа на геометрично прилягане и атомна десолватация. [82]. FireDock оптимизира конформациите на страничната верига и ориентацията на твърдото тяло и генерира резултат от 3D рафиниран комплекс въз основа на енергията на свързване [83]. Избрахме първия модел на Firedock, базиран на глобалната енергия, като докинг комплекс. И накрая, енергията на свързване и съдържанието на дисоциация в докинг комплекса беше предсказано с помощта на сървъра PRODIGY [84].

2.13. Симулация на молекулярната динамика

Бяха извършени молекулярно-динамични симулации върху протеини с помощта на бързия и свободно достъпен уеб сървър, сървър за анализ на вътрешните координати в нормален режим (iMODS) [85] и последователни и оптимални резултати от докинг бяха получени от сървъра PatchDock-FireDock. Във вътрешните координати анализът в нормален режим (NMA) генерира колективни движения, критични за макромолекулната функция. iMODS представя механизми за изследване на тези режими като анализ на вибрации, анимации на движение и траектории на преобразуване, които са извършени почти интерактивно при различни разделителни способности [85].

2.14. Обратна транслация, оптимизация на кодони и in silico клониране на ваксината

За ефективна експресия на кандидата за ваксина в клетките на Escherichia coli, cDNA беше генерирана in silico чрез оптимизация на кодон и обратна транслация с помощта на Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Оптимизацията включва (i) избягване на rho-независими транскрипционни терминатори, ii) избягване на места за свързване на прокариотни рибозоми, (iii) избягване на мястото на разцепване на рестрикционните ензими NcoI и XhoI, което служи като N-крайни и С-крайни рестрикционни места за вмъкване на cDNA шаблон на ваксина и (iv) само частична оптимизация за прилагане на насочена към място мутагенеза. Индексът на адаптация на кодона (CAI) и съдържанието на GC предсказаха качеството на сДНК с опален стоп кодон (TGA), вмъкнат след маркера His × 6. След това оптимизираният ДНК фрагмент на кандидата за химерна ваксина беше интегриран в обратната верига на pET-28a(plus) с помощта на инструмента SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com