Cistanche Herba има антидепресивна ефикасност при хроничен непредвидим стрес

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li и др

РЕЗЮМЕ

Cistanche tubulosa, един вид Cistanches Herba, наскоро беше потвърдено, че има антидепресантна ефикасност при плъхове с хроничен непредвидим стрес (CUS) чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота. В тази статия ние се стремим да проучим метаболитния профил на C. tubulosa при нормални и CUS-индуцирани депресивни модели на плъхове in vitro и in vivo. Използвайки UPLC-Q-TOF-MS, in vitro стомашно-чревния метаболизъм наЕкстракт от Cistanche tubulosa(CTE) се оценява както при нормални, така и при CUS плъхове. В същото време in vivo метаболизма на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при нормални и депресирани плъхове също е изследвано в урина и изпражнения на плъхове. Общо 20 и 26 метаболита са характеризирани от in vitro и in vivo метаболизъм съответно при нормални и CUS плъхове. CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се метаболизира до агликони и продукти на разграждане на фенилетаноидни гликозиди (PhGs) и иридоидни гликозиди, независимо дали от нормална или депресирана чревна микробиота на плъх in vitro. Метаболитите от фаза II на агликоните и продуктите на разграждане на PhGs и иридоидните гликозиди са основните метаболити в урината и изпражненията на плъхове. В допълнение, метаболитната способност за генериране на вторични гликозиди и агликони в депресивната чревна микробиота на плъх е много по-слаба от тази в нормалната чревна микробиота на плъх, което се дължи на нарушените гликозидни хидролази, продуцирани от чревната микробиота при CUS депресирани плъхове. Резултатите от това проучване поставиха основата за разбиране на метаболитния процес и терапевтичния механизъм на антидепресантното свойство на CTE.

Ключови думи: Cistanche tubulosa, Депресия Метаболизъм, In vitro, In vivo, Чревна микробиота

1. Въведение

Cistanches Herba е официално записан като изсушени сочни стъбла на Cistanche deserticola (YC Ma) и C. tubulosa (Schrenk), които се използват за лечение на бъбречна недостатъчност, импотентност, женско безплодие, морбидлекорея, профузна метрорагия и сенилен запек [1]. Съвременните фармакологични проучвания показват, че Cistanches Herba притежава различни биологични активности като анти-невродегенерация, имунорегулация и противовъзпалително [2,3]. Предишните ни разследвания потвърдиха товаЕкстракт от Cistanche tubulosa(CTE), които се състоят от 48,6 процента фенилетаноидни гликозиди (PhGs), 6,9 процента иридоидни гликозиди и 20.0 процента общи захариди, биха могли значително да облекчат депресивните симптоми на депресивни плъхове, предизвикани от хроничен непредсказуем стрес (CUS) чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота [4]. Последните проучвания показват, че промените в състава на чревната микробиота са свързани с развитието и прогресирането на депресия [5,6]. Относителното изобилие на микробните родове беше значително нарушено при плъхове с депресивен модел CUS в сравнение с нормалните контроли [7]. При пациенти с депресия разнообразието и богатството на чревната микробиота също са значително променени [8]. Освен това различни съединения, включително фенилетаноидни гликозиди (PhGs) и иридоидни гликозиди, се считат за основни съставки на Cistanches Herba [2,3], които лесно се метаболизират в техните вторични гликозиди и агликони, включително хидрокситирозол (HT), 3,4-дихидроксифенетил гликозид, дегликозилирана генипозидова киселина и др. от човешката чревна микробиота. Тези метаболити се абсорбират по-лесно през червата и проявяват биологична активност, съответстваща на прототипния компонент [9–11]. По този начин ние вярваме, че по време на появата и развитието на депресия, нарушаването на структурата на чревната микрофлора неизбежно ще повлияе на метаболизма на оралните традиционни китайски лекарства (TCM) в стомашно-чревния тракт, в допълнение към повлияването на физиологичното състояние на гостоприемника. Повечето от съществуващите метаболитни данни за Cistanches Herba идват от метаболитни проучвания върху здрави животни [12–15]. Следователно би било от по-голямо клинично значение да се изследва метаболитният профил на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в патологично състояние за изясняване на неговите биоактивни компоненти и разбиране на механизма на действие за неговата антидепресивна ефикасност.

В настоящото проучване ние се стремим да характеризираме метаболитните профили на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)както при здрави, така и при CUS-индуцирани депресивни моделни плъхове чрез ултра-ефективна течна хроматография квадруполна времепролетна масспектрометрия (UPLC-Q-TOF-MS). Стомашен сок, чревна течност и микробиота на нормални и депресивни патологични плъхове са използвани за симулиране на метаболитния процес на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в стомашно-чревния тракт in vitro, независимо и последователно. In vivo метаболитите също се изясняват след перорално приложение на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при нормални и CUS плъхове. Това проучване предоставя нови прозрения за метаболизма и активните метаболити на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)за депресия.

2. Материал и методи

2.1. Материал

Изсушени стъбла на C. tubulosa бяха събрани от окръг Hetian (Xinjiang, Китай). Образците от ваучери бяха удостоверени от проф. Xiaobo Li и депозирани в хербариума на Факултета по фармация, Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай). Методът на екстракция беше използван, както е посочено в нашата предишна публикация [4]. TheЕкстракт от Cistanche tubulosa(CTE) пробите се съхраняват при 4 градуса и се разтварят отново със стерилна вода преди употреба. Стерилни водни разтвори на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)след това пробата се филтрира през 0.22 μm мембрана и филтратите се събират в стерилни епруветки.

Ехинакозидът е предоставен от лабораторията на д-р Pengfei Tu, Пекинския университет (Пекин, Китай). Актеозид, изоактеозид, 2'-ацетилактеозид и цистанозид А са закупени от Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Ченгду, Китай). Хидрокситирозол, кафеена киселина, 3,4-дихидроксибензенпропионова киселина, 3-хидроксифенилпропионова киселина и 3-фенилпропионова киселина бяха закупени от Aladdin IndustrialInc. (Шанхай, Китай). Чистотата на всеки компонент се определя като > 95 процента чрез HPLC-UV. HPLC-клас ацетонитрил е закупен от Merck (Darmstadt, Германия). Дейонизираната вода се приготвя от дестилирана вода с помощта на система за пречистване на вода Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Всички други използвани реактиви и химикали са с аналитичен клас.

2.2. Експерименти с животни

Мъжки плъхове Sprague-Dawley (200 ± 20 g) бяха доставени от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Пекин, Китай) и настанени в Центъра за лабораторни животни на Шанхайския университет JiaoTong (Шанхай, Китай). Животните бяха групови в къщи при контролирана стайна температура (25 ± 2 градуса, 55 ± 10 процента относителна влажност) с 12:12 часа цикъл светлина-тъмнина. На плъховете беше разрешен свободен достъп до обичайната храна за лабораторни плъхове и вода в продължение на 1 седмица. Съоръженията за животни и протоколите бяха одобрени от Комитета по етика на животните на Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай).

След едноседмична аклиматизация, дванадесет наивни плъха бяха разделени на случаен принцип в две групи (n=6), контролната група и групата с хроничен непредвидим стрес (CUS). CUS плъхове са разработени както в предишния ни доклад [4], които са били подложени на различни стресови фактори: бял шум (100 dB) за 1 час, стробоскопско осветление с нисък интензитет през нощта (120 светкавици/мин), лишаване от вода за 24 часа, празен бутилки с вода за 1 час (след лишаване от вода), лишаване от храна за 24 часа, физическо ограничаване (1-2 часа), принудително плуване (5 минути), замърсена клетка за 24 часа (200 ml вода в 100 g постелка от дървени стърготини), прищипване на опашката ( 1 минута), шок за 30 минути, наклон на клетката от 45 градуса за 24 часа и осветяване през нощта (12 часа). Стресорите се прилагат непрекъснато и на случаен принцип в продължение на 4 седмици, подробното подреждане е описано в таблица S1. След 4 седмици на стрес, тестът за предпочитане на захароза, тестът на открито и тестът за хранене с потиснато новост бяха извършени, както е описано по-горе [4]. Очертанията на CUS и поведенческия тест са показани на фиг. S1. След поведенчески тестове бяха получени най-малко 4 фекални пелети от всеки плъх и поставени в стерилни конични епруветки за in vitro анализ на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)метаболизъм.

2.3. Стомашно-чревен метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от нормален и CUS плъх in vitro

2.3.1. Метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в симулирани стомашни и чревни сокове

Петдесет милиграма CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)бяха добавени съответно към 10 mL симулиран стомашен сок и чревен сок. След това CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се инкубира при 37 градуса за 4 часа в стомашен сок и 6 часа в чревен сок. Култивираната смес (1 mL) се потушава с 3 mL наситен с вода n-бутанол незабавно при 0 и 4 часа в стомашен сок и при 0 и 6 часа в чревен сок. Методът на обработка на използваната проба беше както е описано по-горе [9].

2.3.2. Метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от нормална и CUS чревна микробиота на плъхове

Пресни нормални и CUS фекални проби от плъхове първо се смесват и хомогенизират с 25 пъти обем GAM бульон. Утайките се отстраняват чрез филтруване през три парчета марля. След това суспензията се инкубира при 37 градуса в анаеробен инкубатор, в който въздухът се заменя с газова смес (H2 5 процента, CO2 10 процента, N2 85 процента). Петдесет милиграма CTE се добавят отделно към 5 mL нормална и CUS фекална суспензия на плъх и суспензията се инкубира при 37 градуса за 48 часа. Култивираната смес се отстранява и екстрахира с наситен с вода n-бутанол при 0, 12, 24 и 48 часа. Методът за обработка на пробата беше описан по-рано [9].

2.3.3. Последователен метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от стомашния сок, чревния сок, нормалната и CUS чревна микробиота на плъхове

Първо, 100 mg CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се добавя към 1{{10}} mL симулиран стомашен сок и се инкубира при 37 градуса за 4 часа. Цялата реакция се потушава с 3 пъти обема наситен с вода n-бутанол и се центрофугира при 3000 rpm за 15 минути, последвано от изпаряване на супернатанта под поток от азот газ при 37 градуса . Второ, остатъкът се разтваря отново в 0,4 mL стерилна вода, добавя се към 8 mL симулиран чревен сок и се инкубира при 37 градуса за 6 часа. По същия начин се приготвя и пробата със стомашен сок. Накрая, остатъкът се разтваря отново в 0,3 mL стерилна вода, добавя се съответно към 6 mL нормални и CUS фекални суспензии от плъхове и се инкубира при 37 градуса за 48 часа в анаеробинкубатор. Един милилитър от реакцията се гаси с 3 mL наситен с вода n-бутанол незабавно на 0 и 4 часа в стомашния сок, на 0 и 6 часа в чревния сок и на 0, 12, 24 и 48 часа в чревната микробиота на плъхове . Пробата беше обработена идентично CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в симулиран стомашен сок.

2.4. Метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от нормален и CUS плъх in vivo

След това всеки плъх в двете групи беше настанен в индивидуална метаболитна клетка. След нощно гладуване, което позволява само свободен достъп до вода, на всички плъхове се прилагат перорално 2 mL вода през стомашна сонда. Празни проби от урина и фекалии бяха събрани от всички плъхове от 0 h до 12 h. Освен това, CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) се прилага чрез сонда. Пробите от урина и фекалии се събират от 0 до 24 часа. Всички проби от урина и фекалии се съхраняват незабавно при -80 градуса.

Проби от урина и фекалии от нормални и CUS плъхове бяха предварително обработени, както е описано по-рано [12]. Всички получени проби бяха анализирани чрез UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Аналитичен метод

UPLC се извършва на система Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) с колона ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2.1 mm id, 1.7 μm, Waters Corp. , САЩ) чрез градиентно елуиране с използване на {{10}}.1 процента ацетонитрил на мравчена киселина (A) и 0.1 процента мравчена киселина във вода (B) при скорост на потока от 0,4 mL/min . Профилът на градиента беше: 0–5 минути (A:5–20 процента), 5–7,5 минути (A: 20–30 процента), 7,5–10 минути (A: 30–70 процента), 10–11 минути (A : 70–100 процента) и се задържа 1,5 минути. Градиентът се рециклира обратно до 5 процента за 0,5 минути и се задържа за 2,5 минути за следващия цикъл. Инжекционният обем беше 3 μL. Температурата на колонната пещ беше зададена на 35 градуса.

Масспектрометрията се провежда с помощта на масспектрометър Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Йонизацията се извършва в режим на отрицателен електроспрей (ESI−). MS параметрите бяха както следва: капилярно напрежение, −2.0 kV; напрежение на конус, 20 V; температура на източника, 120 градуса; температура на десолватация, 500 градуса; газови потоци на конус и десолватация, съответно 50 и 1000 L/h. За точно измерване на масата, левцин-енкефалин беше използван като заключваща маса за генериране на [M–H]- йон (m/z 554.2615). Експеримент MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) в две функции на сканиране беше проведен, както следва: функция 1 (ниска енергия): m/z 50–1000, 0,25 s време на сканиране, 0,02 s междусканиране на забавяне, 6 eV енергия на сблъсък; функция 2 (висока енергия): m/z50–1000, 0,25 s време за сканиране, 0,02 s забавяне между сканирането, енергийна рамка на сблъсък от 20–45 eV.

2.6. Обработка на данни

Данните бяха обработени с помощта на софтуер UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) за идентифициране на метаболити в рамките на точните масови сурови данни за пълно сканиране, събрани чрез MSE. Съединенията бяха идентифицирани въз основа на точна маса, фрагменти при високоенергийна масспектрометрия. Прагът на интензитета беше зададен като 100,0 броя. Идентификацията на целта, толерансът за съвпадение на фрагменти и други параметри бяха зададени автоматично.

3. Резултати

3.1. Промени в поведението при плъхове с индуцирана от CUS депресия

Плъховете с депресивни симптоми, предизвикани от CUS, бяха оценени чрез поведенчески тестове, включително тест за предпочитане на захароза, тест на открито поле и тест за хранене с потискане на новостите. t-тестът на Стюдънт разкрива, че предпочитанията за захароза в теста за предпочитания към захароза (p < .001),="" общото="" изминато="" разстояние="" в="" теста="" на="" открито="" (p="">< .001)="" и="" латентността="" за="" хранене="" при="" теста="" за="" потискане="" на="" новост="" (p="">< .01)="" са="" значително="" различно="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група="" след="" 4-седмично="" лечение="" с="" cus="" (фиг.="" 1).="" тези="" открития="" показват,="" че="" моделът="" на="" хроничен="" непредсказуем="" стрес="" е="" разработен="">

3.2. Характеризиране на химичните съставки на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)

Цялостен анализ на прототипни съставки на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)беше проведено от UPLC-Q-TOF-MS. Общо 27 съставни части от CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)бяха открити и условно характеризирани, включително 20 PhGs, 5 иридоиди и иридоидни гликозиди и 2 олигозахариди. Подробна информация, включително време на задържане, точни MS и MS/MS фрагментни йони, са изброени в Допълнителна информация (Таблица S2), за да се даде представа за структурата на тези химични съставки. UPLC-Q-TOF-MS обща йонхроматограма (TIC) на CTE е показана на Фиг. S2.

3.3. Стомашно-чревен метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от нормален и CUS плъх in vitro

В това проучване потенциалните метаболити на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)чрез нормални и CUS плъхове in vitro бяха открити от TICs и идентифицирани с комбинация от елементни състави и MS/MS фрагментни масспектри след сравняването им с контролните проби. Всички метаболити от CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в симулирани стомашни и чревни сокове, нормалната и CUS чревна микробиота на плъхове са изброени в таблица 1.

3.3.1. Метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в симулирани стомашни и чревни сокове

Седем метаболита на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в симулиран стомашен сок бяха условно идентифицирани чрез точна информация за маса и MSE фрагмент: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1.66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12, 2.36 min), M5 (m/z 445.1715, C20H30O11, 2.60 min), M7 (m/z 179.0338, C9H8O4, 2.85 min), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20, 4.77 min), M16 (m/z 827.2580, C37H48O21, 5.73 min) и M18 (m/z623) .1968, C29H36O15, 5.81 min). Дегликозилирането, дехидроксилирането, дехидрогенирането и изомеризацията се считат за основните метаболитни пътища за CTE в стомашния сок. Установено е, че M4 и M5 имат молекулно тегло с 2 Da и 16 Da по-ниско от техния прототипен компонент, декафеоиллактеозид, и по този начин са идентифицирани съответно като негови дехидрогенирани и дехидроксилирани продукти. M12 беше идентифициран като изомер на ехинакозида, произвеждащ същите йони като ехинакозида при m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Същите метаболити бяха открити след CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)инкубация в чревен сок. Трябва да се отбележи, че кафеоиловата група на C-6' позиция в PhGs се метаболизира лесно от храносмилателни ензими в чревния сок, за да произведе своите декафеилови метаболити и кафеена киселина.

3.3.2. Метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от нормална и CUS чревна микробиота на плъхове

Общо 20 метаболита, биотрансформирани от CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при нормална чревна микробиота са открити и идентифицирани (фиг. 2). От резултатите се наблюдава, че PhGs се разграждат до агликон хидрокситирозол (HT) M2 (m/z 153.0550, C8H10O3, 1.78 min) и кафеена киселина (CA) M7 (m/z 179.0338, C9H8O4, 2.85 min), след което те бяха допълнително метаболизирани до M3 (m/z 163.0390, C9H8O3, 2.02 минути), M6 (m/z 181.0501, C9H10O4, 2.76 минути), M10 (m/z 195.0655, C10H12O4, 4.35 минути) и M11 (m/z 165.0552 , C9H10O3, 4.36 минути) чрез дехидроксилиране, редукция и метилиране. В допълнение, централните метаболитни пътища, които произвеждат директни метаболити на PhG прототипни съединения от CTE в нормална чревна микробиота на плъхове, са редукция, метоксилиране, дегликозилиране, декафеоил, дехидрогениране и изомеризация.

След инкубиране в индуцирана от CUS депресия чревна микробиота на плъх, CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се превръща в 20 метаболита чрез същите метаболитни пътища като нормалните плъхове.

3.3.3. Последователен метаболизъм на CTE от стомашния сок, чревния сок, нормалната и CUS чревна микробиота на плъх

След последователна инкубация в стомашен сок, чревен сок, нормална и CUS чревна микробиота на плъх, CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се метаболизира до 14 метаболита (включително 8 със стомашен сок, 7 с чревен сок, 11 с нормална и 10 с чревна микробиота на CUS плъх). Сред тях M2(HT) и M11 (3-хидроксифенилпропионова киселина, 3-HPP) са крайните метаболити на PhG след последователно инкубиране на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в стомашния сок, чревния сок и чревната микробиота. Няма значителна разлика в метаболитите между нормален и CUS плъх.

M8, M9, M14, M17, M19 и M20 бяха открити само в независимия метаболизъм на CTE от нормална и CUS чревна микробиота на плъх. Тези метаболити са главно метаболитни междинни продукти, които са били напълно метаболизирани до крайни метаболити при изследването на последователния метаболизъм на CTE и следователно са трудни за откриване.

3.3.4. Разлики между скоростта на метаболизма на CTE от нормална и CUS ратинтестинална микробиота

За да се изяснят разликите между скоростта на метаболизма на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)чрез нормална и CUS чревна микробиота на плъх, относителното съдържание на 27 прототипни съединения и 20 метаболита след инкубиране със стомашен сок, чревен сок, нормална и CUS чревна микробиота на плъх се определя отделно и последователно (Таблици S3 и S4). Резултатите показват, че въпреки че няма значителни разлики между CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)метаболити на нормални и депресивни плъхове, се наблюдава значителна разлика в техните метаболитни скорости. Например С2 и С5 бяха идентифицирани като 8-епилоганова киселина или неин изомер. Те бяха напълно метаболизирани в нормални проби в рамките на 12 часа инкубация. При патологично депресирана чревна микробиота на плъх обаче те се метаболизират напълно след 48 часа инкубация. Очевидно е, че скоростта на метаболизма при нормалния плъх е по-бърза от тази при CUS плъха. Подобни резултати са открити от C18 (изоактеозид). Освен това трябва да се отбележи, че площта на пика на M12 (изомеризация на ехинакозид) и M16 (изомеризация на тубулозид А) в нормални проби е много по-голяма от тази в CUS проби, което показва, че реакцията на изомеризация на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)е по-разпространена при нормална чревна микробиота на плъх, отколкото при депресивна чревна микробиота на плъх.

3.4. Метаболизъм на CTE от нормален и CUS плъх in vivo

Чрез сравняване на биологични проби от групата, третирана с CTE, с празни биологични проби, общо 26 метаболита (съединение 1-26) на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)бяха открити ненормални и CUS плъхове (Таблица 2). Типичните UPLC хроматограми на нормални и CUS проби от урина на плъх са представени на Фиг. 3.

3.4.1. Характеризиране на метаболитите на CTE в нормален и CUS ратурин

Общо 18 in vivo метаболита на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)в нормални проби от урина на плъх са условно идентифицирани. Метаболитите на разграждане на PhGs, включително HT и CA, и тяхното по-нататъшно сулфатиране (съединение 1, 2, 3, 5, 8 и 16), метилиране (6, 21, 22 и 24) и метоксилиране (13 и 14) метаболити бяха основни метаболити в нормалната урина на плъх. Иридоидните гликозиди лесно се метаболизират до агликони (23, 25 и 26) чрез дегликозилиране. Трябва да се отбележи, че не е открит прототип на компонент в нормалната проба от урина на плъх.

В пробата от урина на депресивен плъх, 22 метаболита на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)бяха открити и характеризирани. Едно прототипно съединение, 8-епилоганова киселина, беше открито в патологична урина на плъх. Други метаболити са в съответствие с тези, открити в нормална урина на плъх, включително сулфатирани метаболити (1, 2, 3, 8, 10 и 16), метилирани метаболити (6, 11, 19 и 22), метоксилирани метаболити (13 и 14) на HT и CA, и теагликоните на иридоидните гликозиди (25 и 26).

3.4.2. Характеризиране на метаболитите на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при нормални и CUS ratfeces

В това проучване само един метаболит (съединение 20, 3-HPP) на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)е идентифициран в нормални изпражнения на плъх. Повечето PhG първо са били разградени до CA и впоследствие са претърпели допълнителен метаболизъм до основния си микробен метаболит, 3-HPP. Във фекална проба от плъх CUS, 3 метаболита бяха условно характеризирани, включително сулфатиран 3-HPP (съединение 16) и сулфатиран HT (съединения 2 и 3).

3.4.3. Разлики между in vivo метаболитите на CTE при нормални и CUS плъхове

След перорално приложение на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa), in vivo метаболитите показват очевидни разлики при здрави и депресивни моделни плъхове. 21 метаболита (съединение 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 и 19–26) бяха открити както в проби от здрави, така и в проби от CUS плъхове. Съединение 23 (дегликозилирана генипозидова киселина) е идентифицирано само в проби от здрави плъхове, докато съединения 4 (НТ), 7 (8-епилоганова киселина), 15 (3, 4-дихидроксибензенпропионова киселина) и 18 ({{ 19}}HPP глюкуронидна конюгация) са открити само в CUS моделни проби от плъхове. В обобщение, прототипните съставки са открити само при CUS плъхове, докато повече метаболити от фаза II са открити при нормални плъхове.

4. Обсъждане

В това проучване три in vitro инкубационни модела, включително стомашен сок, чревен сок, нормална и CUS чревна микробиота на плъхове, бяха използвани независимо и последователно за изследване на стомашно-чревния метаболитен профил на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)инвитро. Установено е, че PhG и иридоидните гликозиди в CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)лесно се метаболизират до техните вторични гликозиди и агликони от CUS-индуцирана депресивна чревна микробиота на плъх. След това in vivo метаболизъм на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при нормални и CUS плъхове също беше потвърдено. Предложените метаболитни пътища за CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при здрави и CUS-индуцирани депресивни плъхове са показани на Фиг. 4. PhG, като ехинакозид и актеозид, се метаболизират до НТ и СА, а СА претърпява допълнителен метаболизъм до основния си микробен метаболит, 3-HPP. След това HT, CA и 3-HPP се метаболизират до техните сулфатирани, метилирани и метоксилирани метаболити. Иридоидните гликозиди, включително генипозидова киселина, канканозид А и канканозид N, се метаболизират до техните агликони чрез дегликозилиране. Те допълнително демонстрираха, че PhGs и иридоидните гликозиди в CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)лесно се метаболизират до вторични гликозиди и агликони при CUS плъхове. Тези метаболити обикновено показват по-добра чревна абсорбция и бионаличност, за да се абсорбират допълнително в кръвта, за да проявят биологична активност [16–18]. Струва си да се отбележи, че изомеризацията е преобладаваща за PhGs в стомашно-чревния тракт, съответните метаболити са идентифицирани след сравняване с UPLC времето на задържане на техните прототипни съединения въз основа на аноптимизиран идеален UPLC градиентен профил.

Кафеената киселина е първичният продукт на разграждане на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)от депресивна патологична чревна микробиота на плъхове. Предишни публикации съобщават, че кафеената киселина предизвиква антидепресивни ефекти при теста за принудително плуване при мишки. Нивото на тРНК на невротрофичния фактор, получен от мозъка (BDNF) във фронталния кортекс, и нивото на мРНК на TrkB в амигдалата е значително намалено след теста за принудително плуване, като първото намаление е значително инхибирано от кафеената киселина [19]. Хидрокситирозолът е агликонът на PhGs, който защитава неврогенезата и когнитивната функция чрез предотвратяване на индуцираното от стрес регулиране на нервния протеин BDNF [20]. По този начин е необходимо да се обърне повече внимание на някои биоактивни метаболити (т.е. HT и CA), трансформирани от чревната микробиота след перорално приложение.

В допълнение, настоящите констатации предоставят доказателства, че при депресивна чревна микробиота метаболитната способност за генериране на вторични гликозиди и агликони е значително по-слаба от тази при нормална чревна микробиота на плъх. Причината вероятно се дължи на предизвикани от депресия структурни промени на чревната микробиота, което води до намалена активност на метаболитните ензими, произведени от чревната микробиота [21]. Интересното е, че предишно проучване показа, че типът Bacteroidetes кодира най-изобилните гени на гликозидна хидролаза и полизахаридна лиаза за гликозидната хидролиза и разцепването на сложни въглехидрати с механизъм на елиминиране [22]. По-специално, Bacteroides spp. включително B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis иB. xylanisolvens показват доминиращ общ брой гени, кодиращи GHs и PLs. Parabacteroides distasonis също притежава същите характеристики [22]. Нашите предишни проучвания потвърдиха, че 28-дневната хронична непредвидима стресова стимулация намалява относителното изобилие на родовете Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas и Weissella, докато увеличава Ruminococcus и Deinococcus при плъхове [4]. Трябва да се отбележи, че Bacteroides и Parabacteroides са двата най-разпространени микробни таксона, които представляват приблизително 20 процента относително изобилие при нормални плъхове. След лечение с CUS относителните количества на Bacteroides и Parabacteroides рязко спаднаха до приблизително 5 процента при плъхове с депресивен модел. Следователно, това неизбежно ще доведе до намаляване на общия брой на GH и PL ензими в CUS плъхове и допълнително нарушава дегликозилираната реакция от CUS депресивната чревна микробиота след перорално приложение на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)при моделни плъхове.

5. Заключение

В настоящото проучване техниката UPLC-Q-TOF-MS беше установена и приложена за скрининг и идентифициране на метаболитите наЕкстракт от Cistanche tubulosaпри нормални и CUS депресивни плъхове in vitro и in vivo. Резултатите показаха, че CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)се метаболизира до агликони и продукти на разграждане на PhGs и иридоидни гликозиди както от здрава, така и от депресирана чревна микробиота. След перорално приложение на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa), фаза II метаболити на агликони и продукти на разграждане на PhGs и иридоидгликозиди са открити предимно в урината на плъхове. Метаболитната способност за генериране на вторични гликозиди и агликони в депресивната чревна микробиота на плъхове е много по-слаба от тази в чревната микробиота на нормалния плъх, което се дължи на нарушените гликозидхидролази, произведени от чревната микробиота при плъхове с депресия на CUS. Това проучване предоставя нова перспектива за по-късните развитие на CTE(екстракт от Cistanche tubulosa)като потенциален антидепресант.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от грантове от Националната ключова програма за научни изследвания и развитие на Китай (2017YFC1702400).

Приложение A. Допълнителни данни

Допълнителни данни към тази статия могат да бъдат намерени онлайн на HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

От: ' In vitro и in vivo метаболизъм наЕкстракт от Cistanche tubulosaпри нормални и хронични непредвидими депресивни плъхове, причинени от стресYang Li и др

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Препратки

[1] Комисия по китайска фармакопея, Фармакопея на Китайската народна република, издание от 2015 г., China Medical Science Press, Пекин, Китай, 2015 г., стр. 135 част I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Анализ на химичните съставки във видовете Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: преглед на неговите химични, фармакологични и фармакокинетични свойства, J. ​​Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Антидепресант-подобни ефекти наЕкстракт от Cistanche tubulosaвърху плъхове с хроничен непредсказуем стрес чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Оста черво-мозък: как микробиомът влияе върху тревожността и депресията, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Последни разработки в разбирането на ролята на чревната микробиота в здравето и заболяванията на мозъка, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Вариации в чревната микробиота и фекален метаболитен фенотип, свързани с депресия чрез 16S rRNA генно секвениране и LC/ MS-базирана метаболомика, J. ​​Pharm. Biomed. анален 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: depression-associated gut microbiota induces невроповеденчески промени при плъхове, J. Psychiatr. Рез.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Човешки стомашно-чревен метаболизъм на водния екстракт от Cistanches Herba in vitro: изясняване на метаболитния профил въз основа на цялостна идентификация на метаболита в стомашния сок, чревния тракт сок, човешки чревни бактерии и чревни микрозоми, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Идентифициране на ехинакозидни метаболити, произведени от човешки чревни бактерии с помощта на ултра-ефективна течна хроматография/квадруполна time-of-flight масспектрометрия, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Скрининг и идентифициране на три типични метаболита на фенилетаноидни гликозиди от Cistanches Herba от човешки чревни бактерии с помощта на UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. анален 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Бърз скрининг и идентифициране на разликите между метаболитите на Cistanche deserticola и C. tubulosa воден екстракт при плъхове чрез UPLC- Q-TOF-MS комбиниран анализ на разпознаване на образи, J. Pharm. Biomed. анален 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Систематично характеризиране на метаболитите на ехинакозид и актеозид от Cistanche tubulosa в плазма, жлъчка, урина и изпражнения на плъхове въз основа на UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Подход за идентифициране на последователни метаболити на типичен фенилетаноиден гликозид, ехинакозид, базиран на течна хроматография - време на улавяне на йони от
полетен масспектрометричен анализ, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Метаболизъм на ехинакозид, добър антиоксидант, при плъхове: изолиране и идентифициране на неговите жлъчни метаболити, Лекарство Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Разбиране на молекулярните механизми на взаимодействието между билковите лекарства и чревната микробиота, Med. Рез. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Абсорбция и разпределение на гинзенозиди след перорално приложение прилагане на екстракт от Panax notoginseng на плъхове, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Взаимодействия на чревната микробиота с функционални хранителни компоненти и хранителни добавки, Pharmacol. Рез. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid намалява намаляването на кортикалната експресия на BDNF mRNA, предизвикана от излагане на принудително плувен стрес при мишки, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Прилагането на хидрокситирозол при майката подобрява неврогенезата и когнитивната функция при пренатален стрес потомство, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Влиянието на чревната микробиота върху лекарствения метаболизъм и токсичността, Expert Opin. Лекарство Metab. Токсикол. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Изобилието и разнообразието от въглехидратно-активни ензими в чревната чревна микробиота, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.