In Vitro активности против стареене на етанолни екстракти от розов рамбутан (Nephelium Lappaceum Linn.) за кожни приложения, част 1

абстрактно

Стареенето на кожата се характеризира с характеристики като бръчки, загуба на еластичност, отпуснатост, грапава текстура, мелазма и лунички. Няколко вида изследвания са фокусирани върху предотвратяването и лечението на стареенето на кожата с много естествени съставки. Това проучване имаше за цел да оцени анти-стареещите дейности за предотвратяване на стареенето на кожата на етаноловите екстракти от розов рамбутан (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) от листа (L), клони (B), семена (S) и кори от зрели (R) и млади (Y) плодове. Добивите на екстракцията на целия розов рамбутан (PR), извлечен чрез мацерация (M) и екстракция на Soxhlet (Sox), използвайки 95 процента етанол като разтворител, варират от 10.62 процента до 30 .63 процента. Флавоноидите са открити като основни фитохимикали в почти всички PR екстракти. Екстрактите PR-YM и PR-Y-Sox дават най-високо общо фенолно съдържание чрез анализа на Folin-Ciocalteu от 67,60 ± 4,38 mgGAE/g и общо съдържание на флавоноиди чрез модифицирания колориметричен анализ на алуминиев хлорид от 678,72 ± 23,59 mgQE/g, съответно. Екстрактите от PR-LM показват три най-високи антиоксидантни активности; отстраняване на свободните радикали (SC50 от 0.320 ± 0.{{40}}70 mg/mL) , инхибиране на липидната пероксидация (LC50 от 0.274 ± 0,029 mg/mL) и метална хелаторна активност (MC50 от 0,203 ± 0,021 mg/mL). Всички PR екстракти при 0,01 и 0,1 mg/mL не показват цитотоксичност съответно върху B16F10 клетки и фибробласти на човешка кожа. По същия начин, екстрактът от PR-R-Sox показва най-висока анти-меланогенеза върху B16F10 клетки (52,7 ± 0,9 процента) и активността на инхибиране на гъбната тирозиназа (IC50 от 0,04 ± 0,02 mg/mL), което е значително сравнимо с коджикова киселина (р <0,05). Екстрактът от PR-Y-Sox показва биосинтеза на колаген чрез метода Sirius Red и стимулиране на гени против стареене (Sirt1 и Foxo1) върху фибробласти на човешка кожа чрез RT-PCR метод, който е подобен на стандартните ʟ-аскорбинова киселина и ресвератрол, съответно. Това проучване предполага, че екстрактите PR-R-Sox и PR-Y-Sox могат да бъдат доразвити като естествени агенти против стареене за избелване и против бръчки в козметичната, козмецевтичната и фармацевтичната индустрия. 2023 Авторът(ите). Публикувано от Elsevier BV от името на университета King Saud.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да пречиства DPPH свободните радикали и има способността да пречиства реактивните кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на анионите от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Къде мога да купя Cistanche

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Въведение

В световен мащаб застаряващото население в света нараства по-бързо от всички останали възрастови групи. Световната здравна организация изчисли, че световното население на възраст над 60 години ще бъде 2,1 милиарда през 2050 г. и ще бъде изправено пред често срещани заболявания, включително остеоартрит, диабет, загуба на слуха, болестта на Алцхаймер, хронични обструктивни белодробни заболявания (ХОББ), депресия и деменция , рак и неврологични и сърдечно-съдови заболявания (Darawsha et al., 2021 г., СЗО, 2021 г.). Кожата е един от най-видимите органи по време на процеса на стареене. Стареенето на кожата е свързано със социалната комуникация, защото добрият външен вид прави благоприятно впечатление и подобрява самочувствието. Стареенето на кожата се влияе от фактори на околната среда или външни фактори като замърсители на въздуха, ксенобиотици, UV радиация и тютюнопушене, както и от вътрешни фактори като генетика, клетъчен метаболизъм, хормони и метаболитни процеси (Darawsha et al., 2021). Много скорошни видове изследвания са фокусирани върху поддържането на здрава кожа чрез отлагане, предотвратяване и лечение на стареенето за подобряване на външния вид на кожата чрез регенериране и стимулиране на естествените физиологични процеси за защита на кожата от стареене.

Реактивните кислородни видове (ROS) от клетъчния оксидативен стрес могат да причинят индукция на апоптотична клетъчна смърт чрез активиране на възпалителни процеси и техните сигнални пътища, повишаване на нивата на металопротеиназите (MMPs), разграждане на ненаситени липиди и промяна на структурите на фибриларните протеини, включително колагени и еластин, които се дължат на стареенето на кожата (Miastkowska и Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021). След меланогенезата меланинът е полифенолен пигмент, произведен в меланозоми на меланоцити, които се намират в очите, космите и кожата на животните и могат да предпазят кожата, увредена от ултравиолетово лъчение (Ali and Naaz, 2018). Тирозиназата е съдържащият мед ензим, който може да трансформира L-тирозин в L-допа и L-допа в одопахинон-Н плюс чрез реакции на хидроксилиране и окисляване и след това преминава през междинни продукти накрая до меланин (Solano, 2018). ROS също играе важна роля в регулирането на клетъчния оксидативен стрес в меланоцитите, които са дендритни клетки, които се локализират в базалния слой на епидермиса в кожата. Възпалителните медиатори в кожата, като интерлевкин (IL), простагландин Е2, фактор на туморна некроза и интерферон-гама, които се секретират главно от Th клетки, лимфоцити, дендритни клетки и моноцити, регулират стимулиращата активност на тирозиназата и регулирането на TYRP{{11 }} и TYRP-2 експресия и насърчаване на пролиферацията на меланоцити, което е свързано с производството на меланин (Fu et al., 2020). Свръхпроизводството и високото натрупване на меланин обаче причиняват стареене на кожата като мелазма, лунички, тъмни петна, лентиго и хиперпигментационни нарушения, които могат да бъдат естетически нежелателни (Ali and Naaz, 2018).

Сиртуините са ядрен никотинамид аденин динуклеотид (NAD плюс)-зависим клас III хистон деацетилаза, която регулира клетъчното стареене и апоптозата и клетъчния растеж чрез контролиране на р53, транскрипционни фактори на вилицата (FOXOs) и пероксизомен пролифератор-активиран рецептор гама (PPAR-c), включващ регулациите на метаболизма, клетъчната диференциация, оцеляването и стареенето. (Son et al., 2021). SIRT1, SIRT6 и рядко SIRT7 в семейството на сиртуините са регулирани за дерматологични проблеми, включително възпаление на кожата, кожна инфекция, рак, автоимунни заболявания, наследствени дерматологични заболявания, особено стареене на кожата (Son et al., 2021). Също така, FOXO1 е транскрипционен фактор, който се намира в цитоплазмата. SIRT1 деацетилира FOXO1 и активира транскрипцията на FoxO1 по множество пътища като MAPK (митоген-активирана протеин киназа), протеин киназа (AKT) и панкреатичен и дуоденален хомеобокс-1 (Pdx1) пътища (Sin et al., 2015) . Увеличаването на експресията на Sirt1 и Foxo1 mRNA регулира метаболизма на глюкозата, възстановяването на ДНК, неврозащитата, диференциацията, васкуларната защита и секрецията на инсулин; и намалява стареенето и свързаните с възрастта заболявания като оксидативен стрес, клетъчно стареене, невродегенерация, възпаление, инсулинова резистентност, сърдечно-съдови заболявания, затлъстяване и чернодробна стеатоза, както и стареенето на кожата (Son et al., 2021).

Законът за фармацевтичните продукти (лекарствата) и козметиката от 1940 г. определя лекарството като „всички лекарства за вътрешна или външна употреба от хора или животни и всички вещества, предназначени да бъдат използвани за или при диагностика, лечение, смекчаване или превенция на всяко заболяване или разстройство при хора или животни." Козметика е всяко изделие, предназначено да бъде втривано, изливано, поръсвано или пръскано, въведено в или прилагано върху която и да е част от човешкото тяло за почистване, разкрасяване, насърчаване на привлекателността или промяна на външния вид и включва всеки артикул, предназначен за употреба като компонент на козметика. Козмецевтичните продукти са козметично-фармацевтични хибриди, предназначени да подобрят здравето и красотата чрез съставки, които влияят върху биологичните текстури и функции на кожата (Joshi and Pawar, 2015). Понастоящем анти-стареенето козметиката, козмецевтичните продукти и фармацевтичните продукти съдържат активни съединения, които неутрализират свободните радикали като витамин Е, витамин С, глутатион и коензим Q10; и забавят стареенето на кожата от бръчки и мелазма като нуклеинови киселини, протеинови хидролизати, екстракти от водорасли, растителни масла, фитохормони , цитокини и невропептиди (Kim et al., 2015, Miastkowska and Sikora, 2018), както и полифеноли и флавоноиди от различни естествени растителни екстракти като екстрактите от Vigna subterranean, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus comosus и Manihot esculenta (Chutoprapat et al., 2020; Ding et al., 2020 Boonpisuttinant et al., 2022, Jampa et al., 2022).

Розов рамбутан или Ngo See Chom Pu (Nephelium lappaceum L.) е растение от семейство Sapindaceae, което е местно растение в област Klung, провинция Chanthaburi, в източната част на Тайланд. Плодовете на розовия рамбутан (PR) са сладки и имат добър вкус. Те имат тънка кора с жълтеникаво-розова кора и светлорозов шип със светлозелен връх, което е различно от другите видове като Ngo Rongrien и Ngo Nasarn, които имат светлочервени кори и шипове. Основните фитохимикали, открити в растенията рамбутан, са елагова киселина, корилагин, гераниин, кверцетин и рутин (Phuong et al., 2019, Phuong et al., 2020). По-рано беше съобщено, че обелките от рамбутан от други видове имат високо ниво на фенолни съединения и имат много биологични активности, като отстраняване на DPPH радикали, противовъзпалителни, антивирусни, противоракови и антибактериални (Chingsuwanrote et al. ., 2016; Hernández-Hernández et al., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari et al., 2017; Thitilertdecha и Rakariyatham, 2011). Екстрактите от розов рамбутан обаче нямат научен доклад за биологична активност, особено за анти-старееща активност за здравето на кожата и за естетически цели. Следователно, настоящото проучване имаше за цел да оцени и оцени потенциала на PR екстракти в кожни приложения в козметиката, козмецевтичните продукти и фармацевтичните продукти. Изследванията на in vitro биологични дейности против стареене, включително инхибиране на тирозиназа и антимеланогенеза, биосинтеза на колаген и стимулиране на Sirt1 и Foxo1 mRNA експресии, и трите антиоксидантни активности, както и цитотоксичността върху човешки дермални фибробласти, показват ефективността и безопасността на PR екстрактите, които могат да бъдат доразвити до естествени продукти за грижа за кожата.

2. Материали и методи

2.1. Подготовка и извличане

Петте части на розов рамбутан (PR), включително листа (L), клони (B), семена (S) и кори от зрели (R) и млади (Y) плодове, бяха събрани от район Клунг, Чантабури, Тайланд от юни до Август 2017 г. Ваучерните екземпляри бяха идентифицирани от ботаник в Горския хербариум на Тайланд и регистрирани в хербариума (Код: RSPG-RMUTT-0102) на Иновативни природни продукти от Thai Wisdom Research Unit, Факултет по интегративна медицина, RMUTT , Патум Тани, Тайланд. Всички части на розовия рамбутан бяха нарязани, измити с чешмяна вода, изсушени при 60 градуса във фурна с горещ въздух и смлени на прах с помощта на мелница. Всички части на розовите рамбутани са извлечени чрез мацерация и екстракция на Soxhlet, като се използва 95 процента етанол като разтворител, който е най-често използваният за извличане на лечебни растения, тъй като е безопасен и икономичен. Накратко, 10 g от всеки от PR праховете се екстрахират чрез (1): Мацерация (M) в 100 mL 95 процента (v/v) етанол (Bangkok Alcohol Industrial, Тайланд) с разклащане при 200 rpm при стайна температура (25 ± 2 градуса) за 48 часа; и (2): екстракция на Soxhlet (Sox) със 100 mL 95 процента (v/v) етанол при 80 ± 5 градуса C за 24 h. След това екстрактите първо се филтрират през памучна вата и след това преминават през филтърна хартия, свързана с вакуумна помпа. Филтратите бяха събрани, обединени и изсушени чрез ротационен изпарител. Суровите PR екстракти се съхраняват в стъклени бутилки и се съхраняват при 4 градуса в хладилник до употреба. Добивите при екстракция се извършват на база сухо тегло. 95 процента етанол се използва като разтворител за разтваряне на PR екстрактите преди експериментите.

2.2. Фитохимикали, общи феноли и флавоноиди и съдържание на кверцетин

Фитохимикали като антрахинони, алкалоиди, каротеноиди, гликозиди, флавоноиди, танини и ксантони на PR екстрактите са изследвани, както е описано по-горе (Boonpisuttinant et al., 2022). Качествените резултати се изразяват като ( плюс ) за наличието и (-) за отсъствието на фитохимикали. Общото фенолно съдържание (TPC) се анализира чрез анализа на Folin-Ciocalteu, както е описано по-рано (Boonpisuttinant et al., 2022). Накратко, 50 lL от PR екстрактите, 75 lL реагент Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, САЩ) и 75 lL 7,5 процента (w/v) Na2CO3 (Loba Chemie, Индия) бяха добавени в {{13} }добре микроплака, внимателно се смесва и след това се инкубира при стайна температура на тъмно място за 90 минути. След това абсорбцията при дължина на вълната 725 nm се измерва с четец на микроплаки. Фенолното съдържание се изчислява от стандартната крива на галовата киселина (Sigma-Aldrich, САЩ). Резултатите са изразени като mg еквиваленти на галова киселина (GAE)/g екстракт.

Общото съдържание на флавоноиди (TFC) чрез метода на модифицирания алуминиев хлорид се анализира следвайки Shraim et al. (2021). Накратко, 50 lL от PR екстрактите, 25 lL 10 процента AlCl3 (BDH Prolabo Chemicals, Белгия) и 100 lL 5 процента NaNO2 (Loba Chemie, Индия) бяха добавени в 96-ямкова микроплака. След 5 минути инкубация, към плочите бяха добавени 25 lL 1 М NaOH (BDH Prolabo Chemicals, Белгия). Реакцията се оставя чрез инкубиране при стайна температура за 10 минути. След това абсорбцията при дължина на вълната от 450 nm се измерва с четец на микроплаки. Съдържанието на флавоноиди се изчислява от стандартната крива на кверцетин (Sigma-Aldrich, САЩ). Резултатите са изразени като mg кверцетин еквиваленти (QE)/g екстракт.

Съдържанието на кверцетин в PR екстрактите е изследвано чрез метода HPLC (Shaikh and Jain, 2018). Накратко, точно претеглено количество от стандартния кверцетин се разтваря в метанол в 100 mL мерителна колба, за да се получи изходен разтвор от 1,000 lg/mL. Впоследствие стандартните разтвори бяха 2-кратно серийно разредени до 3,125 mg/mL. За подготовка на пробата 2,5 g от екстрактите се разтварят в 25 mL метанол в 25 mL от мерителната колба, за да се получи 1,000 mg/mL. Всички анализи бяха извършени на Agilent 1260 infinity HPLC система (Waters, Milford, MA, USA), оборудвана с фотодиоден детектор. Използваната аналитична колона беше разширена колона Agilent Zorbax C18 (5l × 100 mm × 4,6 mm) с подвижна фаза от метанол: 0,1 процента ортофосфорна киселина (75:25) при скорост на потока 0,6 mL/min. Температурата на колоната се поддържа при 25 градуса, а дължината на вълната на откриване се настройва на 370 nm. Всички разтвори и разтворители се филтруват през 0.22 lm филтър и се дегазират. Обемът на инжектиране на пробата беше 10 lL, а времето на изпълнение беше 8 минути.

2.3. Антиоксидантна активност

2.3.1. Активност на улавяне на свободните радикали

Активността на улавянето на свободните радикали на PR екстрактите е анализирана чрез метода на 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) от Boonpisuttinant et al. (2019). Към 96 ямкова микроплака. След инкубиране при стайна температура на тъмно място в продължение на 30 минути, абсорбцията се измерва при дължина на вълната 515 nm с помощта на четец на микроплаки. Процентите на DPPH радикална активност се изчисляват съгласно следната формула:

процент DPPH радикална активност {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

Където A0 е абсорбцията на контролата, а A1 е абсорбцията на пробите. Концентрациите, осигуряващи 50 процента извличане (SC50), след това се изчисляват от графиката, начертана между процента извличане на свободни радикали и концентрациите на пробата.

2.3.2. Инхибиране на липидната пероксидация

Инхибирането на липидната пероксидация на PR екстрактите се анализира чрез метода на железен тиоцианат Boonpisuttinant et al. (2019 г.). Към 96 ямкова микроплака. Реакцията се инициира чрез добавяне на 50 mL 5 mM NH4- SCN и 50 mL 2 mM FeCl2. След инкубиране при 37 градуса на тъмно място в продължение на 60 минути, абсорбцията при дължина на вълната от 490 nm се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на инхибиране на липидната пероксидация се изчисляват съгласно следната формула:

Където A0 е абсорбцията на контролата, а A1 е абсорбцията на пробите. Концентрациите, осигуряващи 50 процента от инхибирането на липидната пероксидация (LC50) се изчисляват от графиката, начертана между процента инхибиране на липидната пероксидация и концентрациите на пробата.

2.3.3. Хелиране на метали

Металното хелатиране на PR екстрактите беше анализирано чрез метода за хелатиране на железни йони (FIC) от Boonpisuttinant et al. (2019 г.). Към микроплака с 96 гнезда. След инкубиране при стайна температура на тъмно място в продължение на 60 минути, абсорбцията при дължина на вълната от 570 nm се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на метално хелатиране се изчисляват по следната формула:

Където A0 е абсорбцията на контролата, а A1 е абсорбцията на пробите. Концентрациите, осигуряващи 50 процента метално хелатиране (МС50) бяха изчислени от графиката, начертана между процентното метално хелиране и концентрациите на пробата.

2.4. Инхибиране на гъбична тирозиназа

Инхибиращата активност на гъбната тирозиназа на PR екстрактите се анализира чрез модифициран допахромен метод (Boonpisuttinant et al., 2022). Количество от 50 lL от PR екстракти или коджикова киселина (Sisco Research Laboratories (SRL), Индия) като положителна контрола, 50 lL 0,1 mg/mL L-тирозин (Sigma- Aldrich, САЩ), 50 mL от 0,1 mM фосфатен буфер и 50 mL от 0,1 mg/mL тирозиназа от гъби (Sigma-Aldrich, САЩ) бяха добавени към 96-микроплака с ямки. Преди и след инкубиране при 37 градуса С на тъмно място в продължение на 60 минути, абсорбцията при дължина на вълната от 450 nm се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на инхибиране на гъбната тирозиназа се изчисляват по следната формула:

процентно инхибиране на гъбична тирозиназа=[(A - B)-(C - D)]/=(A - B)×100 (4)

Където A е абсорбцията на празната проба след инкубация, B е абсорбцията на празната проба преди инкубация, C е абсорбцията на пробите след инкубация и D е абсорбцията на пробите преди инкубация. Концентрациите, осигуряващи 50 процента инхибиране на тирозиназата (IC50 mg/mL) бяха изчислени от графиката, начертана между процента инхибиране на тирозиназата и концентрациите на пробата

2.5. In vitro дейности против стареене върху клетъчни култури

2.5.1. Клетъчни култури

Миши меланоми (B16F10) и фибробласти на човешка кожа бяха използвани за изследване на анти-меланогенезата, биосинтезата на колаген и анти-стареенето на експресията на Sirt1 и Foxo1 mRNA, съответно. Тези две клетки са получени от Американската колекция от типови култури (ATCC), Вирджиния, САЩ. Клетките се култивират в Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, USA), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA ), 100 IU/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) при стандартни условия при 37 °C под 5 процента CO2 инкубатор преди експериментите.

2.5.2. Тест за цитотоксичност върху фибробласти на човешка кожа

Различните концентрации на PR екстрактите са изследвани за цитотоксичност върху миши меланоми (B16F10) и фибробласти на човешка кожа от 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил )-2,5-дифенил тетразолиев бромид (МТТ) анализ като описания по-рано Boonpisuttinant et al. (2022). Фибробластите на човешката кожа при плътност от 1 × 104 клетки на ямка се поставят в 96-плаки с ямки, регулира се обемът до 180 lL с DMEM и се инкубират при 37 градуса под 5 процента CO2 атмосфера за 24 часа. След това се добавят екстрактите в различни концентрации. Клетките се инкубират при 37 градуса С под 5 процента CO2 атмосфера за 24 часа. След това клетките се промиват с 10 mM PBS при рН 6.8 за 3 пъти и се добавя 1 mL от 0.5 mg/mL разтвор на МТТ (Sigma-Aldrich, САЩ). След инкубиране при стайна температура в продължение на 3 часа, МТТ разтворът се отстранява и към всяка ямка се добавят 100 lL диметилсулфоксид (DMSO). Плаките се разклащат внимателно при 200 rpm в продължение на 15 минути. Абсорбцията при дължина на вълната от 570 nm на разтворите се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на клетъчната жизнеспособност се изчисляват по следната формула:

Където Acontrol е абсорбцията на контролата, а A sample е абсорбцията на пробите.

2.5.3. Анти-меланогенеза върху B16F10 клетки

Анти-меланогенезата върху B16F10 клетки на PR екстрактите беше изследвана с помощта на описания по-горе метод от Boonpisuttinant et al. (2022). Клетките B16F10 при плътност от 2,5 × 105 клетки на ямка се посяват в 6-плаки с ямки и се инкубират при 37 градуса под 5 процента CO2 атмосфера за една нощ. След това се добавят екстрактите в концентрация от 0,01 mg/mL. Kojic киселина се използва като положителна контрола. Клетките се инкубират при 37 градуса под 5 процента CO2 атмосфера за 72 часа. След това супернатантите се събират в чистите епруветки за микроцентрофугиране, докато клетките се промиват с 10 mM фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) при рН 6,8 за 3 пъти, разтворени в 200 lL 10 процента NaOH и инкубирани при 60 градуса 1 час . Абсорбцията при дължина на вълната от 450 nm на супернатантите и клетъчните лизати се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на съдържанието на меланин се изчисляват по следната формула:

2.5.4. Биосинтеза на колаген върху фибробласти на човешка кожа

Биосинтезата на колагена на PR екстрактите беше изследвана по описания по-горе метод от Boonpisuttinant et al. (2022). Фибробластите на човешката кожа с плътност 5 × 105 клетки на ямка се посяват в 6-плаки с ямки и се инкубират при 37 градуса под 5 процента CO2 атмосфера за една нощ. След това се добавят екстрактите в концентрация 0.1 mg/mL. ʟ-аскорбиновата киселина се използва като положителна контрола. Клетките се инкубират при 37 градуса под 5 процента CO2 атмосфера за 24 часа. След това клетките се промиват с 10 mM PBS при рН 6,8 за 3 пъти, добавят се 1 mL от 0,1 процента (w/v) разтвор на Sirius red (Sigma-Aldrich, САЩ) в наситена пикринова киселина (Sisco Research Laboratories (SRL) ), Индия), и след това се инкубира при стайна температура в продължение на 1 час. Багрилото се отстранява и плочите се промиват с 1 mL 10 mM HCI (Merck Millipore, Германия) 5 пъти. След това клетките се разтварят чрез добавяне на 1 mL 0.1 М NaOH. Абсорбцията при дължина на вълната от 450 nm на супернатантите и клетъчните лизати се измерва с помощта на четец на микроплаки. Процентите на количеството колаген се изчисляват по следната формула:

Където Csample е съдържанието на колаген в пробите, а Ccontrol е съдържанието на колаген в контролата.

2.5.5. Стимулиране на гени против стареене върху фибробласти на човешка кожа

Стимулирането на гените против стареене (Foxo1 и Sirt1) на PR екстрактите се определя от RT-PCR, както е описано по-рано от Polouliakh et al. (2020). Фибробластите на човешката кожа с плътност от 5 × 105 клетки на ямка се посяват в 6-плаки с ямки, инкубирани при 37 градуса С под 5 процента CO2 атмосфера за една нощ. След това се добавят екстрактите в концентрация от 0,01 mg/mL. След инкубиране в продължение на 24 часа, общата РНК се екстрахира с NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Германия) съгласно инструкциите на производителя. Количеството на общата РНК се определя количествено чрез флуорометър Qubit 2.0 (Invitrogen, Масачузетс, САЩ). Специфичните праймери за RT-PCR, включително Foxo1, Sirt1 и b-актин, бяха закупени от Macrogen Oceania, Австралия. Следват се последователностите на специфичните праймери; Foxo1: 5′ -GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3′(напред) и 5′-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3′(назад); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(Напред), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (Назад); и b-актин: 5′ TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3′ (напред), 5′ -CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3′ (назад). PCR смесите съдържат 1x SuperScriptTM III One-Step RT-PCR система с PlatinumTM Taq ДНК полимераза Supermix (Invitrogen, Масачузетс, САЩ), 250 nM специфични праймери и 2 lg РНК. Всички RT-PCR реакции бяха извършени на TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Гьотинген, Германия) при условията на амплификация: 60 градуса С 30 минути за обратна транскрипция; след това 40 цикъла при 94 градуса за 15 s денатурация, 55 градуса C за 30 s отгряване и 68 градуса за 30 s удължаване; и накрая при 68 градуса С за 5 минути. След RT-PCR процесите, PCR продуктите след това се разделят върху 1,5 процента агарозен гел, смесен с буфера за зареждане на ДНК Novel Juice 6x (GeneDireXTM, Китай), наблюдавани с трансилюминатор и след това фотографирани с помощта на Quantity One 4.6.8 (основен) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Калифорния). Впоследствие плътността на лентата беше количествено определена с помощта на Image J (Версия 1.47, Национални институти по здравеопазване, Bethesda, MD, САЩ) и беше нормализирана към домакинския ген, b-актин.

2.6. Статистически анализ

Всички експерименти бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD) на независимите експерименти (n {{0}}). Статистическите разлики бяха анализирани чрез ANOVA с теста на Tukey (p <0.05). Връзките между биоактивностите бяха тествани чрез корелационния коефициент на Pearson.

3. Резултати

3.1. Добивите на екстракция, физическите характеристики и фитохимичното съдържание на PR екстрактите

Добивите на екстракция, физическите характеристики и фитохимичните съдържания на PR екстрактите са показани в таблица 1. Добивите на екстракция на PR екстрактите варират от 10,62 процента до 30,63 процента. Основните фитохимични компоненти на PR екстрактите са флавоноиди. Изключително, екстрактите от розов рамбутан от семена (PR-SM и PR-S-Sox) не съдържат флавоноиди, а показват само гликозиди като техни фитохимикали. Единствено PR екстрактите от зрели и млади кори чрез мацерация (М) показаха наличието на ксантони, които са термично лабилни полифеноли. В допълнение, екстракционните добиви на PR екстрактите чрез екстракцията на Soxhlet (Sox) изглеждат по-високи от мацерацията (M).

3.2. Общо съдържание на фенол (TPC), флавоноид (TFC) и кверцетин в PR екстрактите

Екстрактът PR от кори на млади плодове чрез мацерация (PRY-M) дава най-високо общо фенолно съдържание според анализа на FolinCiocalteu от 67,60 ± 4,38 mgGAE/g, докато екстрактът PR от кори на млади плодове чрез Екстракцията по Soxhlet (PR-Y-Sox) дава най-високото общо съдържание на флавоноиди чрез модифициран колориметричен анализ с алуминиев хлорид от 678,72 ± 23,59 mgQE/g (фиг. 1) (p < 0.05). Екстрактите PR-BM, PR-SM и PR-S-Sox обаче не показват фенолно съдържание. Беше разкрито, че всички PR екстракти показват съдържанието на кверцетин, определено от HPLC анализа. В допълнение, PR екстрактът от кори на зрели плодове чрез мацерация (PR-RM) дава най-високото съдържание на кверцетин от 190,10 ± 0,28 lg/mL. (фиг. 2).

3.3. Антиоксидантни и инхибиращи активности на гъбичната тирозиназа на PR екстрактите

Таблица 2 демонстрира трите антиоксидантни активности, включително активността за улавяне на свободните радикали чрез DPPH метода, инхибирането на липидната пероксидация чрез метода на железен тиоцианат; хелатиране на метали по метода FIC; и инхибирането на гъбната тирозиназа на PR екстрактите. Повечето от екстрактите на PR, с изключение на екстрактите PR-LM, PR-BM и PR-S-Sox, показаха превъзходна активност за улавяне на свободните радикали с диапазона SC5{{10}} от 0.{ {18}}23 – {{20}}.045 mg/mL, което е сравнимо със стандартната ʟ-аскорбинова киселина (SC50 от 0). 036 ± 0.{{40}}03 mg/mL) при p < 0.05. В допълнение, екстрактът от PR-LM показа най-високото инхибиране на липидната пероксидация с LC50 от 0 от 0.274 ± 0.029 mg/mL и металната хелаторна активност с MC50 от 0,203 ± 0,021 mg/mL, което е сравнимо със стандартния a-токоферол (LC50 от 0,122 ± 0,015 mg/mL) и EDTA (MC50 от 0,518 ± 0,034 mg/mL), съответно (p <0,05). Всички PR екстракти демонстрират активност на инхибиране на тирозиназата от гъби, докато екстрактът PR-R-Sox показва най-висока активност с IC50 от 0,04 ± 0,02 mg/ml, което е сравнимо със стандартната коджикова киселина (IC50 от 0,02 ± 0,01 mg /ml) (р <0,05).

3.4. Цитотоксичност на PR екстрактите

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>80 процента относителна жизнеспособност в сравнение с нетретираната група. Въпреки това, по-високите концентрации на всички PR екстракти се считат за цитотоксични за тези клетки. По-високата концентрация от тази от 1 mg/ml не е тествана, тъй като не може да се разтвори напълно в разтворителя.

3.5. Анти-меланогенеза на PR екстрактите

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 процента клетъчна жизнеспособност) (данните не са показани). Фигура 4 показва анти-меланогенезата върху клетките на миши меланоми (B16F10) на PR екстрактите при концентрация от 0,01 mg/ml. Всички PR екстракти показват антимеланогенеза върху B16F10 клетки. PR екстрактите от листа, клони, семена и зрели и млади плодове чрез екстракция на Soxhlet (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox и PR-Y-Sox ) показва най-високата анти-меланогенеза от 50,6–54,1 процента, което е драстично превъзхождащо стандартната коджикова киселина (37,9 ± 3,9 процента) с около 1,5 пъти, докато активността на екстрактите RB-M и PR-YM е сравнима с стандартна коджикова киселина (р <0,05).

3.6. Стимулиране на биосинтеза на колаген от PR екстрактите

Всички PR екстракти при концентрация {{0}}.1 mg/ml показват стимулиране на биосинтезата на колаген върху фибробластите на човешката кожа, определени чрез метода Sirius Red. Концентрацията от 0.1 mg/ml на PR екстрактите и ʟ-аскорбиновата киселина е най-високата концентрация, която не показва цитотоксичност върху фибробластите на човешката кожа. PR екстрактите от листа и клони чрез екстракция на Soxhlet (PR-LM и PR-BM екстрактите) показват най-висока биосинтеза на колаген (16,46 ± 0.{{20}}7 процента и 14,66 ± 0,09 процента, съответно), което е по-ниско от стандартната ʟ-аскорбинова киселина (34,07 ± 0,03 процента) с около 2 пъти (p <0,05) (фиг. 5).

3.7. Стимулиране на гените против стареене

Фигура 6 показва стимулирането на гени против стареене, включително Sirt1 и Foxo1 гени върху фибробластите на човешката кожа на PR екстрактите при 0.01 mg/ml беше определено чрез RT-PCR техника. Концентрацията на {{20}}.01 mg/ml от PR екстрактите и ресвератрол е най-високата концентрация, която не показва цитотоксичност върху фибробластите на човешката кожа. Интересното е, че екстрактите PR-L-Sox, PR-S-Sox, PRR-M, PR-R-Sox, PR-YM и PR-Y-Sox при 0,01 mg/ml показват най-висока стимулация на Foxo1 против стареене експресия на иРНК (495 bp), която е драматично по-добра от стандартния ресвератрол с около 2 пъти (p <0.05). От друга страна, екстрактите PR-S-Sox и PR-Y-Sox показват най-висока стимулация на експресията на иРНК против стареене Sirt1 (160 bp), която е по-ниска от тази на ресвератрол (p <0,05). Въпреки че почти всички PR екстракти демонстрират стимулиране на генната експресия против стареене, PR-R-Sox и PR-BM екстрактите не стимулират съответно експресията на Sirt1 и Foxo1.

4. Дискусия

Няколко естествени растения обикновено са били изследвани за техните фитохимикали, биоактивни съединения и биологични свойства, за да се намерят нови обещаващи естествени съставки за лекарства, хранителни добавки и козметични приложения. Розовият рамбутан е един от местните плодове в област Клунг, провинция Чантабури, Тайланд. Има няколко научни доклада за неговата биологична и фармацевтична активност, особено нейната активност против стареене. В това изследване петте части на розовия рамбутан, включително листа, клони, семена и кори от зрели и млади плодове, са извлечени чрез мацерация и екстракция на Soxhlet, като се използва 95 процента етанол като разтворител. Няколко новооткрити фитохимикали, включително кверцетин, които са вторични метаболити на растенията, са изследвани за ефекти против стареене в клетки, животни и хора (Phuong et al., 2020). От констатациите на това проучване, флавоноидите са основните фитохимикали на PR екстрактите. По-рано беше съобщено, че екстрактите от други видове рамбутан са представени с фитохимикали, включително флавоноиди, танини и каротеноиди, които корелират с техните антиоксидантни свойства (Rohman, 2017). Отсъствието на ксантони при екстракцията на Soxhlet може да се дължи на високи температури (Yuvanatemiya et al. 2022, Sankeshwari et al., 2018). Кверцетинът е едно от най-разпространените фенолни и флавоноидни съединения, открити в много плодове и зеленчуци, както и в рамбутан (Phuong et al., 2020). В това изследване по-високата температура (80 градуса C) на процеса на Сокслет може да извлече неустойчиво на топлина вещество, включително кверцетин, повече от студения процес. Количеството кверцетин, определено чрез HPLC анализ, може да се използва като маркер за контрол на качеството на PR екстрактите в производствения мащаб. Коефициентът на корелация на Pearson (R2) между TFC и TPC на PR екстрактите е 0,825, класифицирайки много силна връзка (R2=± 0,80 до ± 1.00) (p <0,01), което означава ако TFC се увеличи, TPC също ще се увеличи драматично. В допълнение, коефициентът R2 между TPC и съдържанието на кверцетин в PR екстрактите е 0,650, което класифицира силна връзка (R2=± 0,60 до ± 0,79) (p <0,05). Разликата в добивите на екстракция, фитохимикалите, както и TPC, TFC и кверцетин на PR екстрактите може да бъде повлияна от разтворителите, процесите на екстракция и температурите (Chutoprapat et al., 2020). Няколко проучвания са установили, че флавоноидите и фенолните съединения, както и кверцетинът, имат широк спектър от биологични и фармацевтични дейности, включително антимикробна, антиоксидантна, противовъзпалителна и против стареене активност (Panche et al., 2016, Shahidi и Yeo, 2018, Musika et al., 2021, Wang et al., 2022).

Както беше посочено по-горе, радикалните кислородни видове или ROS могат да причинят свързани с възрастта увреждания на клетъчно и тъканно ниво, ускорявайки хронологичното стареене и стареенето в околната среда, характеризиращо се с бръчки и атипична пигментация (Papaccio et al., 2022). Естествените антиоксиданти могат да поглъщат свободните радикали, което води до намалени противовъзпалителни ефекти, предотвратяване на рак, диабет и мозъчни нарушения, намаляване на кръвното налягане и атеросклероза и забавяне на стареенето на кожата (Miracle Uwa, 2{{20} }17). Почистването на свободните радикали, инхибирането на липидната пероксидация и металното хелатиране са широко изследвани като системи за изследване на антиоксидантната активност на природните продукти. За отстраняването на свободните радикали от DPPH странните електрони в молекулите на DPPH се редуцират чрез получаване на водороден атом от антиоксиданти, за да се превърнат в хидразинови молекули (Ionita, 2021). Методът на липидна пероксидация се основава на окисляването на медни (II) до медни (III) йони, преминали през емулсия на линолова киселина (Bakir et al., 2017), докато методът на метално хелиране се основава на окисляването на мед (II) за образуване на фери-ферозинов комплекс (Wong et al., 2014). Наличието на флавоноидно и фенолно съдържание в PR екстрактите от това изследване може да е допринесло за трите антиоксидантни активности. Установено е, че фенолните съединения (напр. корилагин, елагова киселина, гераниин и кверцетин) от екстрактите от рамбутан проявяват антиоксидантна активност чрез извличане на DPPH радикали и инхибиране на липидната пероксидация (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al., 2019, Monrroy et al., 2020, Araujo et al., 2021). Това е подобно на предишните доклади, че екстрактите от кори от други видове рамбутан показват високи TPC и TFC, както и показват по-силни антиоксидантни активности като ABTS, DPPH, O2-почистване, мощност на анализа за намаляване на желязо (FRAP ), хелатиращи агенти и липидна пероксидация (Lourith et al., 2017, Rohman, 2017, Monrroy et al., 2020). Интересно е, че коефициентът R2 между металното хелиране и инхибирането на липидната пероксидация на PR екстрактите показва много силна положителна корелация от 0,953, класифицирайки силна връзка при значително ниво от p <0,01.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】