In vitro оценка на P-gp-медиирани взаимодействия лекарство-лекарство с помощта на модела на човешки бъбречни клетки RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
Въведение In vitro оценката на инхибиторния потенциал на P-гликопротеин (P-gp) е важен въпрос по време на процеса на разработване на лекарства, тъй като позволява прогнозирането на клинично значими взаимодействия лекарство-лекарство (DDI) [1–3]. P-gp принадлежи към суперсемейството транспортери на ATP-свързващата касета (ABC) и е кодиран от гена за множествена лекарствена резистентност MDR1 (известен също като ABCB1). Известно е, че този мембранен транспортер е свръхекспресиран в туморни клетки и причинява резистентност към много противоракови лекарства [4]. Намира се във всички физиологични бариери, включително червата, черния дроб ибъбреци, P-gp предпазва от ксенобиотици, като ограничава абсорбцията на тези субстрати от храносмилателния тракт и улеснява изтичането им в жлъчката и урината. По този начин P-gp играе забележителна роля във фармакокинетиката на различни терапевтични класове [5–7]. Известно е, че множество лекарства като противоракови средства, противогъбични средства и сърдечно-съдови лекарства са субстрати и/или инхибитори на P-gp и много от тях участват в клинично значими взаимодействия [8–10]. Следователно, Американската администрация по храните и лекарствата (FDA) налага инхибиторния потенциал на P-gp да бъде оценен по време на ранните етапи на разработване на лекарството. In vitro анализите, проведени за тази цел, обикновено се основават на изследвания на лекарствения транспорт, използващи P-gp-експресиращи клетъчни линии. По-точно, насоките на FDA препоръчват определянето на in vitro стойностите на полумаксималната инхибиторна концентрация (IC50) за оценка на риска от клинични DDIs в резултат на инхибиране на P-gp. За тази цел са проведени много експериментални анализи и повечето от тях са фокусирани върху лекарствени взаимодействия, свързани с чревната абсорбция, като се използват моделите Caco-2 или MDCK-MDR1 [11–13]
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Отбъбречнаелиминирането също е общ път на елиминиране за различни класове лекарства, активната тубулна секреция чрез ABC транспортери също може да играе ключова роля в тези взаимодействия [14]. Въпреки това, in vitro данните забъбречнаDDI, медиирани от P-gp, са ограничени. Това отчасти се дължи на липсата на развитие и характеризиране на in vitro модели за прогнозиране набъбречнатранспорт на наркотици. Сред различните човешки клетъчни линии моделът RPTEC/TERT1 изглежда обещаващ за оценката набъбречналекарствени взаимодействия. Тази клетъчна линия е получена от здрав човешки донор и е генерирана от обезсмъртени проксимални тубулни клетки. Освен това, експресията и функционалността на P-gp са демонстрирани с помощта на този модел, като по този начин се потвърждава способността му да предсказвабъбречнаизтичане на лекарства [15, 16]. В този контекст, настоящото проучване е предназначено да изследва инхибиторния потенциал на P-gp, използвайки модела RPTEC/TERT1. Първо беше извършен скринингов анализ за натрупване на родамин 123 (R123), за да се получи профил на инхибиране за всяко тествано лекарство. Въз основа на този скрининг бяха избрани четири лекарства за оценка на техните зависими от концентрацията ефекти върху вътреклетъчното натрупване на две P-gp субстратни лекарства: апиксабан и ривароксабан
Ключови думи:бъбречна клетка, бъбречен модел, бъбречно лекарство, бъбречно елиминиране, бъбреци.
Материали и методи
РеактивиApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban, ri va r oxa ban, [13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin и dabigatran etexilate бяха закупени от Alsachim (Illkirch, Франция). Верапамил, кетоконазол, симвастатин, амиодарон, родамин 123, балансиран солев разтвор на Ханк (HBSS) и HEPES разтвор бяха закупени от Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Франция).
Клетъчна култура Клетките RPTEC/TERT1 бяха получени от Американската колекция за типови култури (ATCC, Molsheim, Франция) и култивирани в хормонално дефинирана среда без серум, състояща се от модифицирана среда на Dulbecco Eagle's Medium F12 (ATCC), допълнена с комплект растежен фактор (ATCC) и 1 процент антибиотична/антимикотична смес (пеницилин–стрептомицин, амфотерицин В) при 37 градуса и 5 процента CO 2. За всички експерименти клетките се посяват в 96-плаки с гнезда при плътност 50,000 клетки на ямка и бяха използвани за растеж след 14 дни култура. Средата се подновява на всеки 2 дни и клетките се използват от пасаж 27 до пасаж 34. Caco-2 клетки също се закупуват от ATCC. Клетките се поддържат в културална среда, състояща се от Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Мисури, САЩ), допълнена с 10% FBS, 1% несъществени аминокиселини и 1% антибиотична/антимикотична смес (пеницилин-стрептомицин, амфотерицин B ) при 37 градуса и 5 процента CO2. Caco-2 клетки се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от 5 × 10 3 клетки на ямка и се използват за растеж след 14 дни култивиране. Човешки проксимални тубулни епителни клетки (HPTECs) бяха получени от BIOPREDIC (Rennes, Франция) и култивирани в DMEM/F12, допълнен с хидрокортизон, EGF, инсулин, трансферин и натриев селенит. Клетките се посяват в 96-плаки за култура, покрити с колаген, при плътност от 6600 клетки на ямка и се използват за растеж след 11 дни култура.
Скринингов тест за натрупване на родамин 123 Инхибиторният потенциал на P-gp се определя чрез измерване на вътреклетъчното натрупване на родамин 123 в RPTEC/TERT1 клетки в присъствието и отсъствието на различни класове лекарства. Сред 14-те тествани лекарства, циклоспорин А (10 µM), кетоконазол (50 µM), верапамил (100 µM) и амиодарон (50 µM) бяха използвани като инхибитори на P-gp. Апиксабан, ривароксабан и дабигатран етексилат — три директни перорални антикоагуланта (DOACs) — бяха използвани като P-gp субстрати (10 µM). Варфарин (50 µM) беше използван като неинхибитор и пет противоракови лекарства, включително нилотиниб, кризотиниб, ерлотиниб и иделализиб, бяха използвани, без да се знаят техните профили на инхибиране в концентрация от 10 µM. Няколко условия бяха възпроизведени с клетките Caco-2, които са одобрени от FDA за изследвания на транспорта на лекарства. По този начин вътреклетъчното задържане на родамин 123 се определя в Caco-2 клетки в присъствието и отсъствието на верапамил (100 µM), циклоспорин А (10 µM), нилотиниб (10 µM) и DOACs (10 µM). ). Накратко, след 14 дни култивиране в 96-ямкови плочи, клетките бяха предварително инкубирани за 10 минути при 37 градуса с всяко лекарство, разтворено в HBSS с 10 mM HEPES (v/v). След това клетките се инкубират с 10 цМ родамин 123 за 45 минути при 37 градуса. Накрая, след три измивания в студен HBSS/HEPES разтвор, клетките се лизират при стайна температура в продължение на 45 минути в разтвор на натриев додецилсулфат (SDS), съдържащ 1% натриев борат. Количеството вътреклетъчен родамин 123 се определя количествено с помощта на наноспектрофлуорометър Infnite M (Life Sciences, TECAN, Швейцария), като дължините на вълните се настройват на 485/535 nm. Данните бяха изразени като проценти от натрупването на родамин 123 в контролни клетки, които не бяха изложени на никакви потенциални P-gp инхибитори и произволно зададени на 100 процента натрупване.
DOAC анализ на вътреклетъчно натрупване и определяне на IC50 От предишния скринингов анализ на родамин 123 бяха избрани четири лекарства за изследване на техните зависими от концентрацията ефекти върху вътреклетъчното натрупване на апиксабан и ривароксабан (10 µM) в RPTEC/TERT1 клетки. Кетоконазол, кризотиниб и нилотиниб бяха избрани като инхибитори на P-gp, а варфаринът беше избран като неинхибитор. Циклоспорин А (10 µM) се използва като широкоспектърен инхибитор на транспортери. Проучванията на взаимодействията между DOACs и нилотиниб за определяне на стойностите на IC50 бяха възпроизведени в Caco-2 клетки, за да се сравнят двата клетъчни модела. Всички съединения бяха разредени самостоятелно или със свързания инхибитор в HBSS транспортен буфер, допълнен с 1 процент HEPES (v/v) и 1 процент DMSO (v/v). Преди инкубацията всички разтвори бяха предварително затоплени до 37 градуса и рН беше коригирано до 7,4. За противораковите лекарства кризотиниб и нилотиниб, поради тяхната слаба разтворимост и цитотоксичен потенциал, концентрациите варират от 0,1 до 25 µM. За кетоконазол и варфарин концентрациите варират от 0,1 до 100 µM. Накратко, след 14 дни култивиране, всички лекарства, разтворени в HBSS с 1 процент HEPES (v/v), бяха предварително инкубирани за 10 минути при 37 градуса. След това клетките се инкубират с 10 цМ апиксабан или ривароксабан за 60 минути при 37 градуса. Накрая, след три промивания в студен разтвор на HBSS/HEPES, клетките се лизират при стайна температура за 45 минути в 0,2% разтвор на Triton X-100. След това количеството на вътреклетъчния DOAC се определя количествено чрез течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS). Данните бяха изразени като процентно увеличение на натрупването на DOAC и вътреклетъчното натрупване на DOAC беше произволно зададено на 100 процента в контролните клетки. Стойностите IC50 за инхибиране на активността на P-gp, които съответстват на стойностите на полу-максималната ефективна концентрация (EC50) за увеличаване на натрупването на DOAC, бяха определени от непретеглено нелинейно регресионно моделиране на най-малките квадрати на повишено натрупване с функцията 'nls()' в R софтуер, съгласно следното уравнение (Уравнение 1):
Течна хроматография–масспектрометричен анализКоличественото определяне на апиксабан (m/z 460.19793) и ривароксабан (m/z 436.07285) се извършва с помощта на Ultimate U300{{18 }} система за течна хроматография (Dionex, Сънивейл, Калифорния, САЩ), свързана с масспектрометър Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Бремен, Германия). LC разделянията бяха постигнати с помощта на аналитична колона Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) и скорост на потока 0.6 mL/min . Подвижна фаза А беше вода с 0.1 процента мравчена киселина (FA), а подвижната фаза B беше ацетонитрил с 0.1 процента FA. За ривароксабан градиентът е: 0–0.3 минути, 10 процента B; 0,3–1 мин, линейно от 10 процента до 70 процента B; 1–1,5 минути, 70 процента B; 1,51 мин, връщане към началните условия до 3 мин. За апиксабан градиентът е: 0–0,3 минути, 10 процента B; 0,3–0,7 минути, линейни от 10 до 90 процента B; 0,7–1,5, 90 процента B; 1,51 мин, връщане към началните условия до 3 мин. Откриването беше извършено в режим на паралелно наблюдение на реакцията с електроспрей (PRM) при разделителна способност 35, 000 (при m/z 200). Вътрешните стандарти (IS) са [13C,2H7]-апиксабан (m/z 468.2452) за апиксабан и [13C6]-ривароксабан (m/z 442.09297) за ривароксабан. За всяко лекарство и съответния IS бяха наблюдавани целеви йон (за количествено определяне) и потвърждаващ йон. За ривароксабан и неговия IS целевият йон е m/z 144,95125, а потвърждаващите йони са съответно m/z 231,11280 и m/z 237,13298. За апиксабан и неговия IS целевият йон е m/z 199,08656, а потвърждаващите йони са съответно m/z 282,12387 и m/z 241,06062.
Резултати
Скринингов тест за натрупване на родамин 123Скрининговият анализ за натрупване на родамин 123 беше извършен в RPTEC/TERT1 клетки с 14 лекарства с различни профили на инхибиране (фиг. 1). Както се очакваше, вътреклетъчното натрупване на родамин 123 в присъствието на циклоспорин А, широкоспектърен инхибитор, беше сред най-високите, с увеличение на натрупването от 75 процента в сравнение с контролните клетки. Наличието на верапамил, специфичен инхибитор на P-gp, води до увеличаване на натрупването на родамин 123 от 57 процента, което показва участието на P-gp. По същия начин, кетоконазол, описан като силен P-gp инхибитор, води до по-голямо увеличение (66 процента) на вътреклетъчното натрупване на родамин 123 в сравнение с верапамил, потвърждавайки неговия профил на инхибиране. Обратно, добавянето на амиодарон, характеризиран като умерен инхибитор на P-gp, причинява увеличение на натрупването от 59 процента, което е подобно на това, причинено от верапамил. Наблюдавани са различни профили на инхибиране за противораковите агенти нилотиниб, акситиниб, кризотиниб, ерлотиниб и иделализиб. Добавянето на нилотиниб предизвика силно увеличение на натрупването на родамин 123 (71 процента), което предполага значителен инхибиторен потенциал, последвано от акситиниб, което доведе до увеличение на задържането от 57 процента. От друга страна, кризотиниб и ерлотиниб демонстрират умерен до нисък инхибиторен потенциал, с увеличения на натрупването на родамин 123 съответно с 23 процента и 16 процента. Idelalisib не повлиява натрупването на родамин 123; същото се отнасяше и за варфарина, който беше
избран като неинхибитор. Сред трите DOAC, апиксабан и ривароксабан причиняват леки увеличения в задържането на родамин 123: съответно 33 процента и 12 процента. Интересно е, че дабигатран етексилат, пролекарство на дабигатран и известен субстрат на P-gp, причинява увеличение на задържането на родамин 123 с около 50 процента, въпреки че не е описан като потенциален инхибитор на P-gp. И накрая, добавянето на симвастатин причинява само леко увеличение на натрупването на флуоресцентния субстрат (32 процента). Въз основа на този скрининг бяха избрани четири лекарства за оценка на техните зависими от концентрацията ефекти върху вътреклетъчното натрупване на апиксабан и ривароксабан в рамките на модела RPTEC/TERT1. Кетоконазол беше избран като положително контролно условие за инхибиране на P-gp, а варфарин беше избран като неинхибитор на P-gp за отрицателно контролно условие. Нилотиниб и кризотиниб бяха избрани съответно като силни и умерени инхибитори на P-gp. Няколко условия бяха възпроизведени с референтния модел, Caco-2. Вътреклетъчното натрупване на R123 в клетките се определя след комбинация (или не) с апиксабан и ривароксабан (10 µM), нилотиниб (10 µM) и с циклоспорин А (10 µM) и верапамил (100 µM) за контролните условия за инхибиране (Фиг. 2А). Както се очакваше, верапамил и циклоспорин А предизвикаха силно увеличение на задържането на R123 от 297 процента и 275 процента, съответно. По същия начин, нилотиниб причинява силно увеличение на вътреклетъчното натрупване на R123 (229 процента), което потвърждава неговия инхибиторен потенциал. Комбинирането на R123 с DOAC води до незначителни увеличения в натрупването на R123 (40–44 процента) в сравнение с другите лекарства. Освен това, вътреклетъчното натрупване на родамин 123 в отсъствието и присъствието на циклоспорин А вбъбречнапървичните човешки клетки също бяха изследвани в това проучване, за да се провери надеждността на резултатите, получени с RPTEC/TERT1 клетки (фиг. 2B). Тези анализи показват, че наличието на циклоспорин А повишава задържането на R123 със 71 процента. Тази стойност е близка до тази, получена при същите условия с RPTEC/TERT1 клетки (увеличение от 75 процента с циклоспорин А). Следователно активността на P-гликопротеина е сходна в RPTEC/TERT1 модела и първичните човешки клетки.
DOACs Тест за вътреклетъчно натрупване: IC50 и определяне на съотношението I1/IC50 Бяха проведени проучвания за вътреклетъчно натрупване за оценка на P-gp-медиирания транспорт на апиксабан и ривароксабан при постоянна концентрация от 10 µM в RPTEC/TERT1 клетки in vitro и в присъствието на нарастващи концентрации на нилотиниб, кризотиниб, кетоконазол и варфарин (фиг. 2, 3). Моделирането на повишеното задържане на апиксабан и ривароксабан беше оценено, за да се определят стойностите на IC50. Комбинирането на DOACs с нилотиниб доведе до най-ниските стойности на IC50: 0,85 µM и 1,37 µM съответно за ривароксабан и апиксабан (Фигури 4, 5). Комбинацията с кризотиниб дава IC50 стойности от 10,1 µM и 12,2 µM съответно за ривароксабан и апиксабан. Изненадващо, комбинирането на DOACs с кетоконазол не дава най-ниските стойности на IC50 (16,5 µM и 16,9 µM съответно за ривароксабан и апиксабан). И накрая, както се очакваше, комбинация с варфарин, която беше
избран като неинхибитор, не повлиява вътреклетъчните задържания на двата DOAC. Вътреклетъчното натрупване както на апиксабан, така и на ривароксабан в Caco-2 клетки в присъствието на нарастващи концентрации на нилотиниб беше изследвано за сравнение с клетъчните модели. Интересно е, че както се наблюдава с модела RPTEC/TERT1, стойността на IC50 за ривароксабан (4,16 µM) е по-ниска от тази, получена за апиксабан (9,35 µM). Също така е интересно да се отбележи, че стойностите на IC50, наблюдавани в Caco-2 клетки, са по-високи от тези, получени в RPTEC/TERT1 клетки за същия инхибитор. Клиничното значение на DDI може да се предвиди от in vitro данни. Съгласно насоките на FDA съотношенията [I1]/IC50 са изчислени за всяка комбинация от лекарства. Това съотношение позволява концентрациите in vivo да бъдат сравнени с тези, за които е известно, че предизвикват съответен ефект in vitro. За апиксабан в RPTEC/TERT1 клетки съотношенията са съответно 3,1, 0,06 и 17,4 с нилотиниб, кризотиниб и кетоконазол (Таблица 1). В клетки Caco-2 съотношението [I1]/IC50 е 0,46 за взаимодействието между апиксабан и нилотиниб (Таблица 1). За ривароксабан съотношенията са малко по-високи от тези, получени за апиксабан в RPTEC/TERT1 клетки: съответно 5,1, 0,08 и 17,7 за нилотиниб, кризотиниб и кетоконазол (Таблица 2). По същия начин съотношението [I1]/IC50, наблюдавано за взаимодействието между ривароксабан и нилотиниб в Caco-2 клетки, е 1,03, което е по-високо от това, получено за апиксабан (Таблица 2).
Дискусия
Многобройни проучвания, проведени през последните десетилетия, съобщават за забележителна роля на P-gp във фармакокинетиката на лекарствата [17–19]. С оглед на нарастващия регулаторен интерес към лекарствените взаимодействия, медиирани от P-gp, in vitro анализите за изследване на инхибиторния потенциал на лекарствата са важен аспект от разработването на лекарства и клиничната практика. За тази цел са проведени много in vitro анализи и повечето от свързаните данни за прогнозираната чревна абсорбция са генерирани от клетъчните линии Caco-2 и MDCK-MDR1 [20–22]. Въпреки това, има малко данни за активната тубулна секреция на лекарства, която също играе ключова роля в разпределението на лекарствата и зависи от наличието на ABC транспортери. Това наблюдение е ясно свързано с липсата на характеризиранебъбречнаклетъчни линии за предсказване на лекарствабъбречнаefux. Тази цел изисква ин витробъбречнамодел, който точно имитира физиологичната бариера. Човешката клетъчна линия RPTEC/TERT1, която експресира няколко ABC транспортера (по-специално P-gp), изглежда е добра алтернатива, както беше показано в предишно проучване [16]. В този контекст, настоящата работа изследва приложението на модела RPTEC/TERT1 за оценка на инхибиторния потенциал на P-gp. Доколкото ни е известно, тази работа е първата, която предоставя данни от проучвания за инхибиране на P-gp при хорабъбречнаклетки.
In vitro анализите за определяне на инхибиторния потенциал на P-gp обикновено се основават на използването на специфичен референтен субстрат на P-gp, като дигоксин или родамин 123 [23–25]. Поради лесната им употреба, флуоресцентните сонди са изгодни за високопроизводителни анализи. Освен това, родамин 123 е широко прилаган за откриване на P-gp активност в широк кръг от изследвания [26–28]. По този начин в това проучване бяха извършени анализи на натрупване на родамин 123 в RPTEC/TERT1 клетки, за да се идентифицират профилите на инхибиране на 14 лекарства. Сред тези лекарства циклоспорин А, кетоконазол и верапамил бяха избрани като силни инхибитори на P-gp. Тези инхибитори са широко характеризирани за техния значителен P-gp инхибиторен потенциал, което води до модулиране както на транспорта на дигоксин, така и на родамин 123 [27, 29, 30]. Както се очаква, тези лекарства причиняват най-високите задържания на родамин 123 в RPTEC/TERT1 клетки. Обратно, не се наблюдава увеличение на задържането на R123 с варфарин, който беше използван като отрицателна контрола, потвърждавайки надеждността на модела RPTEC/TERT1. Интересното е, че сред всички тествани лекарства, DOACs - включително дабигатран етексилат, апиксабан и ривароксабан - причиняват ясно изразени увеличения в задържането на R123, въпреки че преди това не са били характеризирани като инхибитори, а само като P-gp субстрати [31, 32]. Това наблюдение може да се дължи на съществуването на така нареченото "конкурентно" инхибиране, при което лекарствата могат да взаимодействат със същите места на свързване на P-gp. Най-добре охарактеризираните места за P-gp са мястото H (за свързване на Hoechst 33342) и мястото R (за свързване на родамин 123). Въпреки това, множество други неизвестни места за свързване на лекарства могат да играят роля в тези взаимодействия, което би могло да обясни различните ефекти на DOAC върху натрупването на R123 [33, 34]. Следователно инхибирането на P-gp, наблюдавано за дадено лекарство, зависи от използвания субстрат по време на in vitro проучвания [28, 35]. Използването на различни P-gp субстрати, които взаимодействат с различни места за свързване на лекарството, следователно трябва да се счита за точно описание на предполагаемата P-gp инхибиторна активност на лекарствата. Също така е интересно да се отбележи, че няколко условия от скрининга на родамин 123 също бяха извършени в Caco-2 клетки, за да се сравнят клетките RPTEC/TERT1 с референтен модел в проучвания за транспорт на лекарства. Както се очакваше, циклоспорин А, верапамил и нилотиниб предизвикаха най-голямо увеличение на задържането на родамин. Същите профили на инхибиране се наблюдават както при Caco-2, така и при RPTEC/TERT1 клетки. Въпреки това, повишенията в задържането на родамин 123, генерирани от взаимодействията в модела Caco-2, са по-големи от тези, наблюдавани в RPTEC/TERT1 клетки, което предполага потенциална разлика в експресията на P-гликопротеин между моделите. Следователно, в настоящето В изследването е използван втори метод за оценка и потвърждаване на потенциалното инхибиране на P-gp от лекарства.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА
Въз основа на анализа за натрупване на родамин 123 бяха избрани четири лекарства, за да се определят техните зависим от концентрацията ефекти върху вътреклетъчното натрупване на апиксабан и ривароксабан. Доказано е, че P-gp играе основна роля в изтичането на апиксабан и ривароксабан [32, 36]. Поради това бяха оценени стойностите на IC50 на нилотиниб, кризотиниб и кетоконазол, като DOACs бяха избрани като лекарства "жертва". Доколкото ни е известно, това проучване е първото, което провежда проучвания за вътреклетъчно натрупване с DOACs при хорабъбречнаклетки. IC50 стойностите, получени за нилотиниб и кризотиниб, са в съответствие с техните профили на инхибиране, получени от анализа за натрупване на родамин 123. Нилотиниб, който предизвика силно увеличение на задържането на R123, представи най-ниската стойност на IC50 за двата DOAC, потвърждавайки неговия висок потенциал за инхибиране. Този резултат също е в съответствие с предишно проучване, което показва зависимо от концентрацията увеличение на вътреклетъчното натрупване на [3H]-паклитаксел в MDR1-трансфектирани клетки, което предполага, че има инхибиторен профил [37]. За кризотиниб анализът на R123 показа умерен инхибиторен потенциал, с по-малко увеличение на задържането на R123 от това, причинено от нилотиниб. Това наблюдение е подкрепено от предишно проучване, при което кризотиниб увеличава вътреклетъчното натрупване на R123 и доксорубицин в MDR1-трансфектирани клетки [38]. Този резултат също е в съответствие със стойностите на IC50, определени с DOACs, които са по-високи от съответните стойности за нилотиниб, потвърждавайки неговия умерен профил на инхибиране. Въпреки това, интересно е да се отбележи, че концентрация от 10 µM нито на нилотиниб, нито на кризотиниб не причинява същите увеличения в задържането на родамин 123 и DOACs. При скрининга с родамин нилотиниб повишава задържането на субстрата с около 71 процента, докато за DOACs е около 40 процента. Обратно, кризотиниб причинява малко увеличение на задържането на родамин (23 процента), но по-голямо увеличение на задържането на DOACs (около 50 процента) при същата концентрация. Както беше обсъдено по-рано, това наблюдение може да се обясни с разлики в местата на свързване на P-gp. Известно е, че много лекарства взаимодействат и се конкурират с Н-свързващото място, а не с R-свързващото място (където се свързва родамин 123) и обратно [39]. Интересно е, че кетоконазол, за който е известно, че е силен инхибитор на P-gp, причинява малко по-малко увеличение на задържането на родамин 123, отколкото нилотиниб (съответно 66 процента срещу 71 процента). Независимо от това, подобна стойност се наблюдава при Caco-2 клетки, където присъствието на кетоконазол причинява увеличение от 60 процента в натрупването на R123 [40]. Вътреклетъчното натрупване на DOACs за определяне на стойностите на IC50 също показва по-високи стойности в сравнение с нилотиниб и кризотиниб. Интересно е, че повечето от стойностите на IC50, открити в моделите LLC-PK1 или Caco-2, използващи дигоксин като субстрат на P-gp, са между 3 и 4 µM за кетоконазол [41, 42]. Тези стойности са доста различни от тези, открити в настоящото проучване (16,5 µM и 16,9 µM съответно с апиксабан и ривароксабан). Това наблюдение потвърждава, че изборът на субстрата и използвания модел са решаващи влияния при определяне на инхибиторния потенциал на P-gp. Освен това, скорошно проучване съобщава, че нивата на експресия на ABC транспортери в in-vitro клетъчни модели оказват влияние върху анализите за транспорт на лекарства и следователно върху оценката на DDI, свързани с P-gp [43]. Наистина, определянето на стойностите на IC50 за верапамил, използвайки ривароксабан като субстрат на P-gp, разкрива хетерогенност между клетъчните модели MDCKMDR1 и Caco-2, със стойности на IC50 съответно от 6,94 µM и 21,2 µM [43]. Освен това, зависимият от концентрацията ефект на нилотиниб върху вътреклетъчното натрупване на апиксабан и ривароксабан също е изследван в Caco-2 клетки в това проучване. Интересно е, че стойностите на IC50 за нилотиниб са значително по-високи в Caco-2 клетки, отколкото в RPTEC/TERT1 клетки. Това наблюдение може да се обясни с разликата в експресията на P-gp между тези модели. Освен това е известно, че разпределението на P-gp зависи от разглежданата тъкан. Fallon и др. демонстрира, че нивото на P-gp е по-високо вбъбрекотколкото в чернодробната тъкан при хора [45]. От друга страна, нивото на експресия на P-gp изглежда е по-високо в червата, отколкото вбъбректъкан [46]. Следователно използването на човешки клетки като модела RPTEC/TERT1, които не свръхекспресират транспортери, може да предостави допълнителни данни. Тези данни могат да бъдат използвани и приписани във физиологично базирано фармакокинетично моделиране (PBPK) чрез интегриране на няколко параметъра, като например количеството на P-gp в тъкан или in vitro модел или IC50 стойности.
Въпреки че стойностите на IC50, открити за кетоконазол в модела RPTEC/TERT1, са по-високи от тези, наблюдавани в литературата, съотношението [I1]/IC50 — валидирано като предиктор за потенциални клинично значими DDI за перорално прилагани лекарства — показва, че високи стойности, които са били над прага от 0,1, определен от FDA. Този резултат е в съответствие с клинично проучване, което показва двукратно увеличение на експозицията на апиксабан при едновременно приложение на кетоконазол [44]. Взети заедно, всички тези резултати показват, че моделът RPTEC/TERT1 е обещаващ инструмент за оценка на инхибиторния потенциал на P-gp.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
Заключение
Нашето проучване показа, че прилагането на модела RPTEC/TERT1 е удобно за оценка на P-gp инхибиторния потенциал на различни класове лекарства. Тестовете за натрупване на родамин 123 позволяват извършването на първоначален скрининг на лекарството. Въпреки това, P-gp инхибиторният потенциал на лекарства, които не взаимодействат с R мястото на P-gp, също трябва да бъде изследван с помощта на допълнителни субстрати за потвърждаване на прогнозите. Стойностите на IC50, определени от вътреклетъчното натрупване на апиксабан и ривароксабан, са в съответствие с профилите на инхибиране, наблюдавани с родамин 123. Освен това, употребата на кетоконазол и варфарин съответно като силен инхибитор и неинхибитор на P-gp потвърди надеждност на модела RPTEC/TER1, когато се използва за получаване на in vitro данни за инхибиторния потенциал на лекарството спрямо P-gp. И накрая, сравнение на резултатите, получени с помощта на модела RPTEC/TERT1 с тези, получени с помощта на Caco-2 клетки, подчерта значението на провеждането на in vitro проучвания в различни клетъчни модели, за да се потвърди инхибиторният профил за дадено лекарство.