Интрамускулното усилване с HIFN-Alpha 2b подобрява индуцираната от BCGphipps защита при миши модел на проказа

Резюме:

Имунитетът на гостоприемника към Mycobacterium leprae обхваща спектър от механизми, които варират от защита, управлявана от клетъчния имунитет, до увреждане, свързано с хуморалния имунитет, както при реакциите на проказа тип -2. Въпреки че интерфероните тип I (IFNs) участват в елиминирането на вътреклетъчните патогени, техният принос за производството на антитела и CD3 плюс FOXP3 плюс регулаторни Т клетки (Tregs) в медиираната от BCG ваксина защита при проказа е неизвестен. Първичното BCGphipps (BCGph), последвано от интрамускулно усилване на hIFN- 2b значително намалява размера на лезията и растежа на Mycobacterium lepraemurium в кожата. Т фоликуларните регулаторни клетки (TFR), подгрупа от Tregs, индуцирани от имунизация или инфекция, се намират в зародишните центрове (GC) и модулират производството на антитела.

Открихме нарушена индукция на Treg и подобрени GC в дрениращи лимфни възли на праймирани с BCGph и hIFN{0}}b усилени мишки. Освен това, тези мишки предизвикват значителни количества IL-4 и IL-10 в серума. По този начин нашите резултати подкрепят адювантните свойства на hIFN- 2b в контекста на BCGph прайминг за повишаване на защитния имунитет срещу кожна проказа.

Защитният имунитет се отнася до способността на тялото да се защитава срещу инфекциозни патогени чрез производство на антитела, Т-клетки и т.н., и е един от важните механизми за тялото да устои на болести. Имунитетът се отнася до способността на тялото да разпознава и реагира на различни чужди вещества (включително патогени, чужди тела, туморни клетки и т.н.), включително клетъчен имунитет и хуморален имунитет. Защитният имунитет е част от имунитета и двете са тясно свързани. Добрият имунитет може да насърчи подобряването на защитния имунитет, за да предотврати по-добре появата на заболявания. В същото време подобряването на защитния имунитет може също така да повиши имунитета, позволявайки на тялото да се справя по-добре с различни външни предизвикателства. Следователно поддържането на здрава имунна система, включително добър защитен имунитет, е много важно за поддържане на добро здраве. От тази гледна точка имунитетът също е много важен. Ако искаме да подобрим имунитета си, Cistanche може значително да подобри нашия човешки имунитет. Полизахаридите в Cistanche могат да регулират имунния отговор на човешката имунна система и да подобрят имунните клетки. Способност за стрес, засилване на бактерицидния ефект на имунните клетки.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Ключови думи:

Mycobacterium lepraemurium; миша проказа; интерферон алфа; BCGphipps; зародишни центрове; регулаторни Т клетки.

1. Въведение

Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis, етиологичните агенти на човешката проказа [1, 2], засягат кожата и периферните нерви [3]. Въпреки че са налични многолекарствени лечения (MDT) за проказа, броят на новите случаи остава стабилен (700, 000 годишно).

Освен това, липсата на ефективна диагностична процедура затруднява проследяването на предаването на M. leprae [4–7]. Генетичната предразположеност към ранна проказа [8] подчертава необходимостта от навременна диагноза и разработване на евтини имунотерапии за намаляване на случаите на проказа в развитите страни [9,10]. Спектърът от клинични прояви при проказата корелира с вида на предизвикания имунен отговор. Например, туберкулоидната проказа (ТТ), характеризираща се с доминантен Th1 отговор, ограничава растежа на бацилите чрез IFN-задвижвано активиране на микробицидните функции на макрофагите. Обратно, производството на класически Th2 цитокини (IL-4 и IL-10) е свързано със загуба на защита и засилен бациларен растеж при дисеминирана лепроматозна проказа (LL) [10]. Съществуват и междинни подтипове, които представляват смес от Th1 и Th2 отговори [10].

Инфекцията на мишки с M. lepraemurium (MLM) [11,12] е използвана за изследване на имунологичните механизми на човешката проказа [11–13], въпреки че MLM не показва тропизъм за периферните нерви [11,13] като M. leprae прави [14]. Въпреки това и двете микобактерии не могат да се култивират и растат бавно в гостоприемника, удвоявайки броя си за 1–3 седмици.

Експерименталната подкожна инфекция с малки дози бактерии имитира много естественото заболяване, което обикновено възниква, когато разрушаването на бариерите улеснява микобактериалната колонизация, предизвиквайки имунна реакция на периферно ниво [13,15–17]. Докато клетъчно-медиираният имунитет (CMI) е нарушен, хуморалният имунитет е практически незасегнат при човешка и миша проказа [18]. В допълнение, Th1- или Th2-клетки, други Т лимфоцити, оформят имунитета на гостоприемника към инфекция с M. leprae [18,19].

Интересно е как M. leprae влияе върху имунитета на гостоприемника при различните подтипове на микобактериална болест. Една хипотеза е, че патогенът намалява хуморалния и клетъчния имунитет на гостоприемника, за да зарази кожата и периферните нерви [3,14,15]. Има също доказателства, че бацилът нарушава активирането на макрофагите. Той също така намалява експресията на TNF-алфа и молекули като простагландини, които индуцират производството на IL-1 и реактивни кислородни и азотни междинни продукти (ROI и RNI), критични за микобактерицидните функции на макрофагите [20–22].

Хуморалните отговори, генерирани в GCs на вторични и третични лимфоидни тъкани, участват в защитния имунитет срещу патогени [23–26]. Скорошен доклад за проказа подчертава критичната роля на Tregs в инхибирането на Th1 и Th17 клетъчните отговори [19]. Наистина, балансът между тези подгрупи Т клетки в GCs [27–29] диктува защитните или патологични резултати от инфекциозни и автоимунни заболявания [30,31] и е от решаващо значение за разработването на терапии за индуциране на защитен имунитет [26,27 ].

По-специално, Т хелперните фоликуларни клетки (TFH) и особено Т фоликуларните регулаторни клетки (TFR) модулират GC отговора, за да индуцират дълготрайни хуморални имунни отговори, като същевременно предотвратяват производството на автоантитела [32,33]. Като се има предвид, че тип I IFN е свързан с генерирането както на TFH, така и на Tregs, той се очертава като обещаващ адювант за стимулиране на отговорите на TFH в GCs в контекста на BCG ваксинация [34].

Мукозното приложение на тип I IFN индуцира съзряване на дендритни клетки и генериране на CXCR5 плюс CD4 плюс TFH, улеснявайки развитието на GC и производството на антитела с висок афинитет в лимфните възли [34]. Обратно, тип I IFN отменя имунитета на гостоприемника при човешка туберкулоза чрез инхибиране на производството на индуцируема азотен оксид синтаза (iNOS), IL-12p40, IL-1A и IL-1, като същевременно индуцира IL-10 и IL-1R антагонисти [35–38]. По този начин участието на тип I IFNs зависи от контекста [38–42]. IFN от тип I се произвеждат на стабилно ниво, но след като вътреклетъчен патоген нахлуе в гостоприемника, се индуцират няколко хетерогенни и сложни антивирусни или антибактериални вродени реакции [43–48], включително превключване на клас антитела, соматична хипермутация и усилване на наличието на антиген в GC, което ще доведе до силни и ефективни отговори на антитела [34,49].

По-рано докладвахме за защитата, предоставена от последователно интрамускулно усилване на IFN при мишки, ваксинирани с Mycobacterium bovis BCG и провокирани с MLM [42] или срещу аерозолно провокиране с M. tuberculosis [41]. При мишки, заразени с MLM, защитата корелира с повишено производство на iNOS, азотен оксид и IgG3 антитела [42]. В контекста на предизвикателството с M. tuberculosis, защитените мишки предизвикват Th1 отговор [41].

В по-скорошно проучване тип I IFN модулират аутофагията и метаболизма при проказа [50]. В това проучване решихме да проучим допълнително защитата срещу миша проказа, индуцирана от ваксинация с M. bovis BCGphipps (BCGph) и фармацевтично представяне на човешки IFN- 2b [51]. В скорошни проучвания рекомбинантен BCG, който експресира човешки IFN- 2b, е използван за успешно лечение на рак на пикочния мехур [51–55]. В съответствие с тези данни, нашата цел в това проучване беше да анализираме защитата, предизвикана от BCGph прайминг и hIFN- 2b усилване в миши модел на проказа. Като цяло, нашите резултати предвиждат потенциала на BCGph подкожно първично и интрамускулно hIFN- 2b усилване за индуциране на защитен имунитет срещу човешка проказа.

2. Материали и методи

2.1. Животни

Мишки Balb/c без специфични патогени бяха отгледани и настанени в съоръженията за животни на Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional в Мексико Сити.

Всички експерименти с животни бяха извършени след одобрение (07 март 2014 г.) от Комитета за грижа и управление на животните (CIE-ENCB ZOO 016/2014).

2.2. Микроорганизми

Щамът BCG Phipps (ATCC® 35744™) (BCGph) е вариант на щама BCG, който е загубил региона RD1, който кодира ESAT-6 и CFP10, с най-малък брой Т клетъчни епитопи , 316, срещу BCG Tokyo, 359 и BCG Pasteur, 331, (Zhang et al., 2013) [51] и беше предоставено от д-р Hernández-Pando (INCMNSZ, Мексико Сити, Мексико). След това суспензиите на ваксината се съхраняват при –80 ◦C до употреба. Некултивируемият щам Mycobacterium lepraemurium (MLM) се изолира от далака на мишки, носещи четиримесечна инфекция чрез процедура, описана от Prabhakaran et al., 1976 [56], последвана от пречистване, като се използва процедурата за лична изолация, описана от Draper P. , 1980 [57]. Накратко, 4 g далачна тъкан се суспендира в 20 mL 0,2 М захароза и се смила в стъклен хомогенизатор тип Potter-Elvehjem. Получената суспензия се центрофугира в продължение на 20 минути при 150 × g за отстраняване на клетъчните остатъци (Sorvall RV5B, ротор HB4) (Sorvall Instruments, Wilmington, DE, USA). След това 9 mL от супернатанта се покриват с 12 mL 0, 3 М захароза и епруветките се центрофугират при 3500 × g за 10 минути при 4–10 ° C (Sorvall RC5B). Получената пелета, богата на бацили, се ресуспендира в 20 mL 0,2 М захароза и аликвотни части от 9 mL се наслагват върху 12 mL 1,5 М KCl.

След това епруветката се центрофугира при 4 ◦C за 10 min при 3500× g. Бацилите се събират, промиват се три пъти с фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) (0,01 М Na/K фосфат, 0,15 М NaCl, рН 7,4) и се ресуспендират в 40 ml разтвор, съдържащ смес от Percoll (3 части) и 0,1 процента Tween 80 (7 части). Суспензията се центрофугира при 23,000× g. Бациларната пелета се събира и се промива пет пъти с PBS, докато се елиминира Percoll. Чистотата на бациларния препарат се потвърждава чрез оцветяване по Ziehl-Neelsen. Пречистената бациларна суспензия се приготвя в синтетична среда 7H9 Middlebrook brothOADC (DIFCO, Детройт, Мичиган, САЩ) (7H9-OADC среда) и се определя количествено чрез нефелометрична референтна крива, приготвена с известни количества бактерии. Бациларната суспензия се разделя на аликвоти и се замразява при -20 ◦C, докато стане готова за употреба.

2.3. Имунизации

Групи от осемседмични Balb/c мишки (n=6) бяха подкожно имунизирани с 8 × 103 образуващи колонии единици (CFU) от BCGphipps в 200 µL стерилен PBS. Един месец по-късно всяка група мишки беше интрамускулно подсилена в продължение на три последователни дни (30, 31 и 32 дни след ваксинацията) със 100 µL PBS или със 100, 200 или 300 международни единици (IU) hIFN{{14} }b (Urifron, Probiomed, Azcapotzalco, Мексико Сити, Мексико).

2.4. M. lepraemurium Предизвикателство

За експериментите с предизвикване мишките се инокулират интрадермално с 2 × 106 жизнеспособни MLM в 20 µL PBS. След това мишките се настаняват при стандартни условия и се снабдяват с пречистена вода и чипове за храна за гризачи Purina (Cuautitlan Izcalli, Мексико) ad libitum. Заразените мишки бяха наблюдавани в продължение на осем седмици, точките от време, когато лезиите бяха очевидни в кожата на заразените животни. Прогресията на заболяването варира при мишките и корелира с експерименталните терапии (PBS, BCGph или hIFN- 2b).

2.5. Ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA)

Антителата в серумите на инфектирани с MLM мишки се измерват чрез индиректни ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA). Накратко, 96-плаки с ямки (Nunc, Rochester, NY, USA) бяха покрити за една нощ при 4 ◦C, с 10 µg пептидогликолипиди, разтворени в етанол [38]. След изпаряване на етанол при стайна температура [37], неспецифичното свързване се блокира с 3 процента обезмаслено мляко в PBS от 2 до 3 часа. След изхвърляне на блокиращия разтвор, 0.1 mL от серума, разреден (1:100) в 1 процент обезмаслено мляко в PBS, се добавя към ямките и се инкубира една нощ при 4 ◦C.

След това плаките бяха обилно промити с PBS и свързаните антитела бяха открити с {{0}}.1 mL анти-миши IgG (1:4000, BD 550487, BD Pharmingen, San Диего, Калифорния, САЩ), IgG1-HRP (1:2500, ab 97240, Abcam, Cambridge, MA, САЩ), IgG2a-HRP (1:2500, ab97245, Abcam), IgG2b-HRP (1: 2500, ab97250, Abcam), или IgG3-HRP (1:2500, ab97260, Abcam), или биотин-конюгирано плъше анти-мише IgA моноклонално антитяло (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen), последвано от пероксидаза от хрян (HRP)-конюгирано плъше анти-мише Ig антитяло (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen) или авидин-HRP (ab 59653, abcam) Хромогенният субстрат, тетраметил-бензидин в 0,05 М цитратно-фосфатен буфер (pH) 5.2), допълнен с 0,01 процента водороден пероксид (H2O2), се добавя към ямките за проявяване на цвят. Реакцията се спира с 1 М H3PO4. Оптичните плътности се измерват при 450 nm в ELISA четец за микроплаки (LabSystems Multiskan Plus, LabX, Midland, ON, Канада). IFN-, IL-4, IL-17, IL-6, TNF- и IL-10 бяха измерени в серума със специфични сандвич ELISA комплекти (PEPROTEC Inc., Cranbury , Ню Джърси, САЩ). според инструкциите на производителя.

2.6. Измервания на NO в серума на мишки

Накратко, серумите бяха третирани с етанол (1:1), за да се утаят протеини и други смущаващи фактори. След центрофугиране при 3000 rpm за 20 минути, 20 µL от възстановения серум се поставя в ямки на ELISA плака заедно със 100 µL от реактива на Griess и 80 µL дестилирана вода. Реагентът на Griess е смес от обем към обем на разтвор А (2 процента сулфаниламид в 5 процента фосфорна киселина) и разтвор Б (0,1 процента N-(1-нафтил) етилендиамин, дихидрохлорид. След 30 минути инкубиране при 25 ◦ C, развитият розов цвят се регистрира в ELISA четец при 595 nm Стойностите се екстраполират към стандартна крива на натриев нитрит в диапазона от 1–100 µM.

2.7. Имунофлуоресценция

Първичните антитела са получени от следните компании: кози анти-iNOS (клон M-19, Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ), заешки анти-нитротирозин (AB 5411, EMD, Millipore, Burlington, MA, САЩ ), биотин плъх Ly6C/Ly6G (клон RB6-8C5, BD Pharmingen), кози анти-CD3 епсилон (клон M-20, Santa Cruz Biotechnology), плъши антимиши FoxP3 (клон FJK{{12} }s, eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ), кози антипролифериращ клетъчен ядрен антиген (клон C-20, Santa Cruz Biotechnology), FITC-фъстъчен аглутинин (L7381- 1MG, SIGMA, St Луис, Мисури, САЩ) и APC-плъх анти-миши CD45R (клон RA3-6B2, BD Pharmingen).

Първичните антитела бяха открити със следните вторични антитела: Alexa Fluor 568 магарешки анти-кози IgG (A11057, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ), Alexa Fluor 488 магарешки анти-заешки IgG (711-546, Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove, Пенсилвания, САЩ) и Alexa Fluor 680 стрептавидин (S32358, Thermo Fisher Scientific).

Пет µm фиксирани с формалин парафинизирани срезове се инкубират при 60 ◦C за една нощ за депарафинизация. Тъканните срезове бяха бързо прехвърлени в ксилен (247642-2.5L, SIGMA) и хидратирани чрез последователно потапяне на предметни стъкла в абсолютен алкохол, 96% алкохол, 70% алкохол и вода. Слайдовете се потапят в разтвор за извличане на антиген, варят се в продължение на 30 минути и се охлаждат в продължение на 10 минути при стайна температура (RT). Слайдовете се изплакват няколко пъти с вода и се прехвърлят в PBS. Неспецифичното свързване беше блокирано с 5 процента нормален магарешки серум в PBS, съдържащ 0,1 процента Tween 20 и 0,1 процента Triton-X-100, за 30 минути при стайна температура във влажна камера. Първичните антитела се добавят към предметните стъкла и се инкубират една нощ във влажна камера при RT. Слайдовете се промиват внимателно в PBS и флуоресцентно белязаните вторични антитела се инкубират в продължение на 2 часа, при стайна температура или за една нощ във влажна камера.

Накрая слайдовете се промиват в продължение на 1 час в PBS и се монтират с Vectashield antifade монтажна среда с DAPI (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Снимките са направени с микроскоп Zeiss Axioplan. Всички зародишни центрове (GC) в секция на лимфен възел бяха измерени с автоматизиран инструмент на микроскопа Carl Zeiss и средният размер на GC беше изчислен с помощта на софтуера Prism. CD3 плюс FoxP3 плюс Tregs бяха преброени в 5 произволни 200 × полета на тъкан, за да се изчисли средният брой положителни клетки на поле.

2.8. Статистически анализ

Статистически значимите разлики между групите бяха изчислени чрез еднопосочна ANOVA, множество сравнения на Newman–Keuls, несдвоен/сдвоен двустранен t-тест на Student и P стойности < 0.05 се считат за статистически значими. Статистическите разлики бяха изчислени с Graph Pad Prism.

3. Резултати

3.1. BCGphipps (BCGph)-първиране, последвано от последователно интрамускулно hIFN- 2b усилване, предпазва Balb/c мишки от интрадермално предизвикателство с M. lepraemurium.

Преди това разработихме протокол за основно усилване, базиран на последователно интрамускулно усилване на IFN след BCG ваксинация на мишки [42] с обещаващи резултати за защита. Скорошни проучвания използват BCG рекомбинант, който експресира човешки IFN- 2b за лечение на рак на пикочния мехур [51,53]. Следователно, в настоящото изследване, нашата цел беше да анализираме защитата, предизвикана от BCGph прайминг, последвано от hIFN- 2b усилване в миши модел на проказа, следвайки схемата, изобразена на Фигура 1.

Фигура 1. Протокол за основно усилване за оценка на защитата на мишки срещу интрадермално заразяване с M. lepraemurium. Групи мишки Balb/c (n=6) бяха ваксинирани подкожно с ниска доза BCGph (8 × 103 CFU). Мишки от всяка група бяха интрамускулно подсилени в последователни дни (30, 31 и 32 дни след ваксинацията) с PBS или hIFN- 2b. Мишките бяха заразени с 2 × 106 жизнеспособен MLM осем седмици след последното усилване. След това мишките бяха умъртвени и биопробите бяха събрани осем седмици след заразяването. Развитието на кожни лезии се наблюдава и измерва, както е описано в Материали и методи.

Накратко, мишките бяха заразени интрадермално с MLM, осем седмици след третото усилване с 300 IU hIFN- 2b. Прогресията на заболяването се наблюдава през следващите осем седмици. В края на този период събрахме ингвинални лимфни възли, за да открием GC и да изброим Tregs и други клетъчни популации чрез имунофлуоресценция. Ние също използвахме имунофлуоресценция, за да визуализираме производството на iNOS от активирани макрофаги, местоположението на нитротирозинови (NT) остатъци и натрупването на Gr-1 плюс миелоидни клетки в кожата на нашите експериментални мишки. Освен това събрахме серума, за да измерим цитокините и антителата срещу гликолипидите на MLM чрез ELISA (Фигура 1).

Първо, за да оценим защитния ефект на BCGph прайминг и hIFN{{0}}b усилване срещу интрадермалното предизвикателство на мишки с MLM, ние измерихме кожните лезии и визуализирахме колонизацията на кожата с бацили чрез оцветяването на Ziehl-Neelsen (Фигура 2A–E). Кожата на непраймирани мишки, които са получили само носител (PBS), без предизвикателство с MLM, не показва бацили (Фигура 2А). Мишките, инокулирани с носителя и заразени с MLM, показват големи количества MLM бацили в кожата (Фигура 2В), докато праймирането на мишки с BCGph води до намаляване на микобактериалния растеж (Фигура 2С). Последователното приложение на hIFN- 2b също намалява растежа на микобактериите в кожата в сравнение с мишки, заразени с MLM (Фигура 2D). Мишките, имунизирани с BCGph и подсилени с hIFN- 2b, имат най-нисък микобактериален растеж (Фигура 2E). В съответствие с тези данни, здравите мишки, провокирани с MLM, които са получили само носител (PBS), развиват най-обширните кожни лезии (35 ± 9,9 mm2), докато мишките, които са били заредени с BCGph, имат кожни лезии с подобен размер на тези, развити в мишките са инокулирани с носителя и заразени с MLM (13.5 ± 4.24 mm2) (Фигура 2F). Мишките, инжектирани подкожно с hIFN- 2b, показват по-малки кожни лезии (20 ± 1,77 µm2). Трябва да се отбележи, че мишки, които са били първично обработени с BCGph и подсилени с hIFN- 2b, показват значително намаляване на размера на кожната лезия (5 ± 7,07 mm2) (p < 0,05) (Фигура 2F).

\

Фигура 2. Кожни лезии и микобактериален растеж в Balb/c, заразени с M. lepraemurium. Защитата на мишки се оценява чрез развитие на кожна лезия и визуализиране на микобактериален растеж в кожната лезия на осем седмици след предизвикване с MLM. Кожните лезии бяха оцветени с Ziehl-Neelsen. Представителни снимки с увеличения 400× на (A) непраймирани мишки и непровокирани мишки; (B) мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM; (C) мишки, имунизирани с BCGph и провокирани с MLM; (D) мишки, интрамускулно инокулирани с hIFN- 2b и провокирани с MLM; (E) мишки, приготвени с BCGph, подсилени с hIFN- 2b и заразени с MLM; (F) Ефективната защита е еквивалентна или на липсата на кожни лезии, или на значително намаляване на размера на кожните лезии, изразено в mm2, n=6 мишки/група. * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p <0,0005 се счита за статистически значимо.

3.2. Минимална кожна патология при мишки, имунизирани с BCGphipps и подсилени с hIFNa 2b, корелира с намалено натрупване на нитротирозин и нарушена неутрофилна инфилтрация

Азотният оксид е критичен за унищожаването на вътреклетъчни патогени. Въпреки това, прекомерното производство на азотен оксид, супероксиден радикал (O,- и водороден пероксид води до генериране на токсичен и нестабилен пероксинитрит, молекула, която реагира с тирозиновите остатъци върху протеините, за да образува стабилния NT 56-601. Въпреки че пероксинитрит убива микобактериите, уврежда и имунните клетки [57-59].

По този начин решихме да търсим iNOS-продуциращи клетки и неутрофили в кожата на нашите експериментални мишки чрез имунофлуоресценция. Видяхме фонови сигнали за iNOS и NT и много малко Gr-1 плюс клетки в кожата на мишки, получаващи само PBS (Фигура 3A). Повишено микобактериално натоварване и уголемени некротични лезии в кожата, свързани с натрупването на NT остатъци в некротичната кожна област (58, 59 от неваксинирани (Фигура 3B) и BCGph праймирани мишки, заразени с MLM (Фигура 3C) В съответствие с по-балансиран локален възпалителен отговор и облекчаване на кожната патология, NT и неутрофилната инфилтрация бяха намалени при мишки, получаващи последователни инокулации с hIFN- 2b (Фигура 3D) или мишки BCGph, първичен и подсилен с hIFN 2b (Фигура 3E). }} плюс неутрофили и редуцирани NT области съвпадат с най-малката възпалителна област в хистологични кожни срезове на мишки, приготвени с BCGph и подсилени с hIFN- 2b (Фигура 3F).

Фигура 3. Защитата е свързана с намалено натрупване на нитротирозин, нарушено натрупване на неутрофили и подобрено кожно възпаление. Срезовете на кожни лезии бяха оцветени с комбинация от антитела, специфични за iNOs (червено), NT (зелено) и Gr-1 (бяло). Представителни 200× снимки от (A) Кожа на непраймирани и незаразени мишки, (B) мишки, инокулирани с PBS и провокирани с MLM, (C) мишки, праймирани с BCGphipps и провокирани с MLM, ( D) мишки, интрамускулно инокулирани с hIFN- 2b и заразени с MLM и (E) мишки, приготвени с BCGph, подсилени с hIFN- 2b и заразени с MLM; (F, G) количествено определяне на възпалителната зона с автоматизирани инструменти на микроскоп Zeiss Axioplan, кожни лезии бяха събрани осем седмици след предизвикване с MLM, графиките показват средната площ, заета от възпалителни клетки в кожни лезии на проказа, изразени в µm2. Мащабна лента=100 µm. n=6 мишки/група * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p <0,0005 се счита за статистически значимо.

Производството на NO не е статистически значимо в сравнение с другите експериментални групи, но в групата от мишки, приети с BCGph и подсилени с hIFN- 2b, концентрацията на NO е по-висока (68,28 µM/L ± 0 .889), отколкото в PBS и MLM групите (62,79 µM/L ± 1.04), BCGph (63,37 µM/L ± 0,225), hIFN- 2b (62,57 µM/L ± 1,028 ) (Фигура 3G).

3.3. Противовъзпалителните цитокини се повишават в серума на мишки, приготвени с BCGphipps и подсилени с hIFN- 2b

Про- и противовъзпалителните цитокини бяха измерени в серума на Balb/c мишки след предизвикване с MLM. В съответствие с имуносупресивното състояние, причинено от MLM, концентрациите на провъзпалителни цитокини са ниски в серума на Balb/c мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM (IFN-, 625 ± 442 pg/mL; TNF-, 697 ± 436 pg/ mL; IL-6, 68 ± 48 pg/mL; IL-17, 95 ± 67 pg/mL). Обратно, те са имали умерени нива на противовъзпалителни цитокини в серума (IL-10, 1763 ± 124 pg/mL и IL-4, 1250 ± 173 pg/mL). Въпреки че мишките бяха защитени чрез първично BCGph и последователно усилване с hIFN- 2b, системните количества провъзпалителни цитокини не бяха статистически различни от тези при мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM. Неочаквано концентрацията на IL-4 (1875 ± 352 pg/mL, p < 0,05) и IL-10 (4250 ± 271 pg/mL) беше значително повишена в серума на тези мишки в сравнение с с мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM (Таблица 1). Тези резултати предполагат, че нашият протокол за ваксиниране може да активира противовъзпалителни пътища за предотвратяване на увреждане на тъканите.

3.4. Нарушено натрупване на Treg в дрениращите лимфни възли (DLN) на мишки, имунизирани с BCGphipps или подсилени с hIFN- 2b

Като се има предвид, че Tregs произвеждат IL-10 [61,62], решихме да определим количествено CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs в дрениращите лимфни възли (DLN), разположени близо до мястото на ваксинация. В неинфектираните мишки (PBS) Tregs все още присъстват (113 ± 9.8 CD3 плюс FOXP3 плюс Treg/200 × поле) (Фигура 4А). Както се очакваше, Tregs бяха значително повишени при мишки, заразени с MLM, които не получиха ваксината (BCGph) или hIFN- 2b (214 ± 30 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Фигура 4B). Съответно, по-ниски нива на Tregs са наблюдавани при мишките, приготвени с BCGph (160 ± 26 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Фигура 4C) и мишките, които са получили hIFN- 2b (162 ± 33 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Фигура 4D); мишките, приготвени с BCGph и подсилени с hIFN- 2b (127 ± 16 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Фигура 4E) имат подобна плътност на Tregs, отколкото неваксинирани мишки без hIFN- 2b подсилване. Въпреки това, след сляпо преброяване на CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs в DLN на нашите експериментални мишки, открихме, че Tregs са значително намалени в DLN на мишки след BCGph праймиране (p=0.0013), hIFN- 2 b инокулация (p=0.0074) или комбинирано BCGph иницииране и hIFN- 2b усилване (p=0.0013) в сравнение с мишки, провокирани с MLM (Фигура 4E).

Фигура 4. Нарушено натрупване на регулаторни Т-клетки (Tregs) в дрениращите лимфни възли (DLNs) на мишки, приготвени с BCGphipps и подсилени с hIFN- 2b. Мишките бяха умъртвени и DLN бяха събрани осем седмици след предизвикване с MLM. DLN се оцветява с антитела, специфични за CD3 (червени) и FOXP3 (зелени ядра), за да се открие CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs чрез имунофлуоресценция. (A) Базално натрупване на Tregs в DLN на неваксинирани мишки; (B) Трегове в DLN са увеличени след MLM предизвикване и сравнително намалени в (C) BCGph-праймирани, (D) hIFN- 2b инокулирани и (E) BCGph-праймирани-hIFN- 2b подсилени мишки; (F) морфометричният анализ показва значително намаляване на Tregs в DLNs на BCGph праймирани/hIFN- 2b подсилени мишки. Скала=100 µm, n=6 мишки/група * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p <0,0005 се счита за статистически значимо.

3.5. BCGphipps иницииране и hIFN- 2b усилване влияе върху отговорите на GCs в DLN на мишката

Има специални Tregs, разположени в GCs, известни като Т фоликуларни регулаторни клетки (TFR. Те модулират отговорите на GCs и предотвратяват генерирането на автореактивни плазмени клетки (28,33). Намалените Tregs в DLNs предполагат, че GCs отговорите могат да бъдат отприщени при мишки праймирани с BCGph и подсилени с hlFN-a 2b. В съответствие с липсата на антигенна стимулация, ние не открихме GCs в DLNs на неинфектирани мишки (Фигура 5A). Малки GCs присъстваха в DLNs на непраймирани мишки, заразени с MLMLigure 5B).

Фигура 5. BCGphipps прайминг и hFN-a 2b усилване влияят на GC отговорите в DLN след MLM предизвикване. Мишките бяха умъртвени осем седмици след предизвикване с ML M. Дрениращите лимфни възли (DLNs) бяха оцветени с антитела, специфичен за пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA, червени ядра), фъстъчен аглутинин (PNA, зелен) и CD45R (B22{{13 }}, бяло) за идентифициране на GC, съдържащи компактни клъстери от PCNA*PNA плюс * B220ниски GC В клетки. GC В клетки в DL Ns на (A) непраймирани и незаразени мишки; (B) мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM; (C) мишки, имунизирани с BCGph и провокирани с MLM; (D) мишки интрамускулно подсилени с hlFN-a 2b и провокирани с MLM; (E) мишки, имунизирани с BCGph, подсилени с hlFN-a 2b и заразени с ML M; (F) GC са измерени в индивидуални DL Ns на експериментални мишки, изчисляващи средния размер на GC. Мащабна лента=100 um.=6 мишки/група. " p < 0.05, * p < 0,005; *** y < 0,0005 се счита за статистически значимо.

Фигура 5. BCGphipps праймиране и hlFN-a 2b усилване влияят на GC отговорите в DLN след ML M предизвикване. Мишките бяха умъртвени осем седмици след предизвикване с ML M. Дрениращите лимфни възли (DLNs) бяха оцветени с антитела, специфични за пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA, червени ядра), фъстъчен аглутинин (PNA, зелен) и CD45R (B22{{ 13}}, бяло) за идентифициране на GC, съдържащи компактни клъстери от PCNAPNA плюс плюс B220ниски GC В клетки. GC В клетки в DL Ns на (A) непраймирани и незаразени мишки; (B) мишки, инокулирани с PBS и заразени с MLM; (C) мишки, имунизирани с BCGph и провокирани с MLM; (D) мишки, интрамускулно подсилени с hlFN-a 2b и заразени с MLM; (E) мишки, подсилени с BCGph, подсилени с hlFN-a 2b и заразени с MLM; (F) GC бяха измерени в отделни DLNs на експериментални мишки, за да се изчисли средният размер на GC. Мащабна лента=100 um. 1=6 мишки/група. " y < 0.05. * y < 0,005, *** y < 0,0005 се счита за статистически значимо.

Интересно е, че мишките, приготвени с BCGph, имат значително по-големи GC от мишките, заразени с MLM (Фигура 5C). Мишките, имунизирани с hlFN-a 2b (Фигура 5D), имат GCs със сравним размер с тези при мишки, заразени с MLM. Мишките, приготвени с BCGph и подсилени с hlFN-a 2b, имаха GCs с междинен размер (Фигура 5E). За да имаме по-количествена оценка на отговорите на GC в DLN, ние изчислихме средния размер на GC в отделните секции на DLN. В съответствие с нашите наблюдения, открихме значително намаляване на средния размер на GC в DLN след инжектиране на hlFN-a 2b и в протокола за първично BCGph/hIFN-a 2b усилване (Фигура 5E).

3.6. Сравними нива на гликолипид-специфични антитела при мишки, заразени с M. lepraemurium след първично BCGphipps и hIFN{3}}b усилване

Според разликите, наблюдавани в образуването и организацията на GC, ние измерихме концентрацията на антитела, специфични за гликолипиди, извлечени от MLM. В световен мащаб нашите резултати показват, че системните количества от различни класове и изотипове на гликолипид-специфични антитела не са повлияни от ваксинация, последователно прилагане на hIFN- 2b или протокола за първично BCGph/hIFN- 2b ( Таблица 2). Мишки, подсилени само с hIFN- 2b, предизвикаха по-високо количество IgG и IgG1 антитела в серума. Нивата на IgG и Ig G1 антитела обаче не са статистически значими в сравнение с другите експериментални групи (Таблица 2).

4. Дискусия

В настоящото проучване ние показахме, че нашият протокол за основно усилване, базиран на подкожно BCGphipps имунизиране и последователно интрамускулно усилване с увеличаващи се количества hIFN- 2b, предпазва мишки от интрадермално предизвикателство с MLM.

Протоколът за основно усилване предотврати растежа на MLM в кожата и облекчи локалната патология чрез намаляване на производството на NT и неутрофилното възпаление (Фигура 3E). Това също така доведе до индукция на противовъзпалителни цитокини (IL-4 и IL-10), които вероятно противодействаха на прекомерното възпаление на кожата и се проявиха системно. Неочаквано, въпреки че терапевтичният режим намали CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs в DLNs (Фигура 4E), GC отговорите не бяха драстично подобрени (Фигура 5E) и серумните концентрации на гликолипид-специфични антитела бяха подобни във всички експериментални групи, с изключение на мишки, инокулирани само с hIFN- 2b (Таблица 2). Независимо от това, нашите експериментални данни подкрепят потенциалното използване на BCG първичен адювант с интрамускулно усилване на IFN 2b, като обещаваща имунотерапия, която заслужава изследване при човешка проказа.

Клиничните прояви на проказата корелират с имунологичния спектър, открит при пациентите, и варират от LL до TT [2,4,14,18]. Като цяло, имунитетът на гостоприемника към M. leprae се характеризира главно с поляризиран Т хелперен отговор (Th1/Th2). От едната страна на спектъра, въпреки че LL се характеризира с енергия, все още има известна реактивност към микобактериалните антигени и производството на IL-4 и IL-10. Обратно, при ТТ, преобладаващият Th1 отговор води до активиране на макрофагите, управлявано от IFN, което ускорява елиминирането на бацилите. Мишките, заразени с MLM, обикновено развиват лепроматозна проказа без ясно доминиране на хуморалния или клетъчния имунитет [18–20].

Защитните антитела, предизвикани от инфекция или ваксинация [63], се произвеждат чрез процес, наречен афинитетно съзряване, който се извършва в зародишни центрове, образувани във вторични (далак, лимфни възли) или третични лимфоидни органи (TLO), генерирани в периферните тъкани [23,25] . Точно в GCs е мястото, където производството на В-клетки на паметта и дълготрайни плазмени клетки, секретиращи антитела, допринасят за генерирането на дългосрочен имунитет срещу бъдещи срещи с патогени. Ефективната индукция на GC отговори зависи от сътрудничеството на множество клетъчни типове, включително В клетки, Т фоликуларни хелперни клетки (TFH), макрофаги с усещане на тялото и фоликуларни дендритни клетки (FDC) [64]. Наистина, ваксините предизвикват успешни GC отговори и ектопични зародишни центрове в лимфните възли [24,25,31,49].

Освен това Т фоликуларните помощни клетки и Т фоликуларните регулаторни клетки [27–30] поддържат деликатния баланс между индуцирането на ефективни отговори на антитела и автоимунитета. Въпреки че не изключихме индукция на автоимунитет в нашето проучване, ние все пак се съсредоточихме върху ефектите на протокола за първично усилване с BCGph и hIFN- 2b върху Tregs от DLNs. Защитените мишки имат значително по-малко CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs в своите DLN. Необходими са обаче допълнителни проучвания, за да се определи дали някои от тези Tregs са Т фоликуларни помощни клетки, които регулират GC реакциите [27–30]. Тези резултати могат да означават, че е необходимо ефективно индуциране на защитен имунитет, съчетано с леко намаляване на Tregs в DLNs, за да се контролира микобактериалният растеж и да се предотврати патологично възпаление в кожата.

Предишни проучвания съобщават за системните и мукозните ефекти на тип I IFN върху Т фоликуларните хелперни клетки и Т фоликуларните регулаторни клетки [19,32,64]. В действителност, тип I IFN индиректно увеличава TFH в лимфните възли чрез стимулиране на Т-клетъчното праймиране от дендритни клетки [34]. Тип I IFN също насърчава смяната на изотипа в GC. В допълнение, скорошно проучване показа, че тип I IFN задейства образуването на TLO в белите дробове, управлявано от CXCL13- [49].

По този начин, индукцията на CXCL13 от тип I IFN може да подобри набирането на наивни В клетки към вторични лимфоидни органи и да увеличи производството на секретиращи антитела плазмени клетки, глобално подобрявайки дълготрайната памет и имунологичните отговори на плазмените клетки [23–25,64]. ], особено в присъствието на адюванти като поли IC [65]. В допълнение, приложението на IFN тип I индуцира образуването на GC в белите дробове на пациенти, засегнати от автоимунни заболявания [31] или туберкулоза [66,67]. По този начин блокадата на CXCL13 може да помогне за лечението на тези хронични възпалителни заболявания [49]. В този контекст, ние наблюдавахме много леко намаление на размера на GC в DLNs на защитени първично усилени мишки (Фигура 5E). Необходими са обаче допълнителни изследвания, за да се дефинира по-добре връзката между образуването на GC и защитата, индуцирана при тези мишки с първичен бустер. При експерименталните настройки на първично зареждане с BCGph и интрамускулно hIFN{15}}b усилване (51), мишките в нашето проучване са имали по-висока защита от приложението на BCGph-hIFN- 2b (80 процента), отколкото само от BCGph (60 процента), както е определено от отсъствието или малкия размер на кожните лезии (Фигура 2) и сравнимо количество IgG и IgG1 антитела, специфични за гликолипидите на MLM (Таблица 2). Нашите резултати контрастират с повишеното количество IgG при мишки, защитени чрез ваксинация с различен щам BCG (Pasteur) [41]. Тези данни предполагат, че типът BCG щам, използван за формулиране на ваксината, може да повлияе на резултата от хуморалния имунен отговор срещу MLM или M. leprae [51].

Освен това, няколко проучвания при туберкулоза показват потенциала и благоприятните ефекти на хетероложната стратегия за първично усилване при индуцирането на защитни имунни отговори [68–70]. Освен това е добре известно, че видът и пътят на имунизация влияят върху големината на антитялото и клетъчните имунни отговори. Изненадващо, защитените мишки показват значително по-високи IL-4 и IL-10 в серума в сравнение с мишки, третирани само с PBS, BCGph или hIFN- 2b самостоятелно (Таблица 1). Как противовъзпалителните цитокини влияят на защитния имунитет при проказа в момента се изследва в нашата лаборатория. Няколко проучвания обаче показват, че ефективният клетъчен имунитет срещу микобактериите разчита на деликатен баланс между защита и превенция на патологията [71]. В допълнение, има доказателства за индуциране на двата типа цитокини в други експериментални модели [72–75].

Нашите колективни резултати предполагат, че успехът на нашия протокол за основно усилване зависи от индуцирането на балансиран имунен отговор, който ефективно елиминира MLM в кожата и ограничава увреждането на тъканите чрез индуциране на противовъзпалителни цитокини (IL-4 и IL10), които вероятно защитават имунните клетки [76,77]. Наистина, IL-10, произведен от индуцирани Tregs, модулира възпалението на лигавичните повърхности, по-специално тези, свързани с възпалително заболяване на червата [77,78]. Тези констатации изискват подробно кинетично изследване на активирането на В клетките, образуването и регулирането на GC, генерирането на Т фоликуларни регулаторни клетки и активирането на NF-кВ в нашата система за първично усилване с BCGph и hIFN- 2b, последвано от MLM инфекция до имат по-механично разбиране за ролите на имунните клетки и NF-κB пътищата в индуцирането на защитен имунитет в кожата и лимфните възли след MLM предизвикателство.

5. Изводи

От тези данни можем да заключим, че последователното интрамускулно усилване с hIFN{0}}b подобрява BCG ваксинацията срещу M. bovis, предпазвайки от интрадермално провокиране с MLM и разкривайки обещаващите адювантни свойства на човешкия IFN-a 2b в контекста на BCG ваксинация за предотвратяване на инфекции с проказа в ендемични райони. Доколкото ни е известно, това е първият доклад за терапевтичната ефикасност на BCGphipps в комбинация с фармацевтично представяне на hIFN- 2b в предклиничен модел на заболяване, подобно на проказа.

Авторски принос:

Дизайн на изследването, GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; провеждане на изследване, GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; анализ на данни: GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; интерпретация на данни, GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; изготвяне на ръкопис, GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; преразглеждане на съдържанието на ръкописа, GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M.; GGG, OR-E., SOI-T. и JR-M. поема отговорност за целостта на анализа на данните. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

GGG и OR-E. бяха подкрепени от SNI, CONACYT (Мексико Сити, Мексико). GGG получи подкрепа от Perfil Prodep 2019–2022 и JR-M. беше подкрепен от вътрешни фондове от Медицинския център на Университета на Рочестър на Катедрата по медицина и RO1AI111914.

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Всички експерименти с животни бяха проведени след одобрение от Комитета за грижа и управление на животните в институцията (ZOO-010-2020). CIE-ENCB ZOO 016/2014, 07 март 2014 г.

Декларация за информирано съгласие:

Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни:

Данните ще бъдат споделяни в съответствие с институционалните указания.

Благодарности:

Благодарни сме на Ricardo Villalobos за помощта с IHC и Rogelio Hernandez Pando (INCMNSZ, Мексико Сити), които предоставиха щама BCGphipps.

Конфликти на интереси:

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. КОЙ. Световна здравна организация: Туберкулоза — глобални факти 2011/2102. Женева: СЗО Stop TB Dep. 2012. Налично онлайн: http://www.who.int/tb/publications/2011/factsheet_tb_2011.pdf (достъп на 1 февруари 2021 г.).

2. Добре, PE Проказа: Какво се "елиминира"? Бик. Световен здравен орган. 2007, 85, 1–2. [CrossRef]

3. Rambukkana, A. Как Mycobacterium leprae се насочва към периферната нервна система? Тенденции Microbiol. 2000, 8, 23–28. [CrossRef]

4. Родригес, JIA; Триелато, GL; Meirelles, NML; Тейшейра, CC; Лион, С.; Esteves, ARM Методи за класификация на проказата: Сравнително проучване в референтен характер в Бразилия. Вътр. J. Инфектирайте. дис. 2016, 45, 118–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Гелюк, А.; van der Ploeg, J.; Телес, ОБР; Kees, L.; Franken, MC; Prins, C.; Wouter, DJ; Сарно, NE; Сампайо, ЕП; Otenhoff, THM Рационалната комбинация от пептиди, получени от различни протеини на Mycobacterium leprae, подобрява чувствителността за имунодиагностика на инфекция с M. leprae. Clin. Vacc. Immunol. 2008, 15, 522–533. [CrossRef] [PubMed]

6. Гелюк, А.; Бобоша, К.; Шип, JJVDP-V.; Спенсър, JS; Бану, С.; Мартинс, MVSB; Чо, SN; Franken, KLMC; Ким, HJ; Бекеле, Й.; et al. Нови биомаркери с отношение към диагностиката на проказата, приложими в райони, хиперендемични за проказа. J. Immunol. 2012, 188, 4782–4791. [CrossRef]

7. Гелук, А. Биомаркери за проказа: бихте ли предпочели Т (клетки)? Лепр. Rev. 2013, 84, 3–12. [CrossRef] [PubMed]

8. Алкайс, А.; Алтер, А.; Антони, Г.; Орлова, М.; Нгуен, VT; Сингх, М.; Vanderborght, PR; Katoch, K.; Мира, МТ; Vu, НТ; et al. Поетапната репликация идентифицира алел с ниско производство на лимфотоксин като основен рисков фактор за ранна поява на проказа. Нац. Женет. 2007, 39, 517–522. [CrossRef] [PubMed]

9. Avanzi, C.; Сингх, П.; Труман, RW; Suffys, PN Молекулярна епидемиология на проказата: Актуализация. заразявам. Женет. Еволюция 2020, 86, 104581. [CrossRef]

10. Ластория, JC; Abreu, MA Проказа преглед на епидемиологичните клинични и етнопатогенни аспекти-част 1. Сутиени. Dermatol. 2014, 89, 205–218. [CrossRef]

11. Rojas-Espinosa, O. Актуални теми за профилите на имунологичния отговор на гостоприемника към микобактериални инфекции; Книга за прегледи; Tomioka, H., Ed.; Изследователска табела: Тривандрум, Индия, 2009 г.; стр. 97–140.

12. Адамс, LB; Pena, ТМ; Sharma, R.; Hagge, AD; Шур, Е.; Truman, RW Прозрения от животински модели върху имуногенетиката на проказата. Преглед. Мем. инст. Освалдо. Круз. 2012, 107, 197–208. [CrossRef]

13. Рохас-Еспиноса, О.; Becerril-Villanueva, E.; Уек-Родригес, К.; Arce-Paredes, P.; Reyes-Maldonado, E. Парализата на задните крайници при заразени с Mycobacterium lepraemurium мишки е резултат от увреждане на костите, а не от засягане на нервите. Clin. Exp. Immunol. 2005, 140, 436–442. [CrossRef]

14. Modlin, LR Вроденият имунен отговор при проказа. Curr. мнение Immunol. 2010, 22, 48–54. [CrossRef]

15. Оливейра, РБ; Очоа, Монтана; Sieling, PA; Rea, TH; Rambukkana, A.; Sarno, EN; Modlin, RL Експресия на Toll-подобен рецептор 2 върху човешки Schwann клетки: Механизъм на увреждане на нервите при проказа. заразявам. имунна. 2003, 71, 1427–1433. [CrossRef] 16. MacMicking, J.; Xie, QW; Nathan, C. Азотен оксид и функция на макрофагите. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 323–350. [CrossRef]

17. Евънс, Т.; Бътъри, Л.; Карпентър, А.; Springall, DR; Полак, J.; Cohen, J. Третираните с цитокини човешки неутрофили съдържат индуцируема синтаза на азотен оксид, която произвежда нитриране на погълнати бактерии. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 1996, 93, 9553–9554. [CrossRef] [PubMed]

18. Фонсека, AB; Саймън, MD; Cazzaniga, RA; de Moura, TR; де Алмейда, RP; Duthie, MS; Рийд, SG; de Jesus, AR Влиянието на вродените и адаптивни имунни отговори върху диференциалните клинични резултати от проказата. заразявам. дис. Бедност 2017, 6, 5–13. [CrossRef] [PubMed]

19. Садху, С.; Khaitan, BK; Джоши, Б.; Sengupta, U.; Nautiyal, AK; Mitra, DK Реципрочност между регулаторните Т клетки и Th17 клетките: значение за поляризирания имунитет при проказа. PLoS Негл. Троп. дис. 2016, 10, e0004338. [CrossRef] [PubMed]

20. Рохас-Еспиноса, О.; Уек-Родригес, К.; Arce-Paredes, P. Ефектът на екзогенната пероксидаза върху еволюцията на мишата проказа. Вътр. J. Lepr. Други Mycobact. дис. 2002, 70, 191–200.

21. Ischiropoulos, H. Биологично нитриране на тирозин: патофизиологична функция на азотен оксид и реактивни кислородни видове. Арх. Biochem. Biophys. 1998, 356, 1–11. [CrossRef]

22. Young, DB Липидът на проказата осигурява ключа за навлизане в клетките на Schwann. Тенденции Microbiol. 2001, 9, 52–54. [CrossRef]

23. Банард, О.; Cyster, JG Зародишни центрове: Програмирани за узряване на афинитета и диверсификация на антитела. Curr. мнение Immunol. 2017, 45, 21–30. [CrossRef] [PubMed] 24. Виктора, DG; Nussenweig, MC Germinal центрове. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 429–457. [CrossRef] [PubMed]

25. Cirelli, KM; Crotty, SH Подобряване на зародишния център чрез разширена наличност на антиген. Curr. мнение Immunol. 2017, 47, 64–69. [CrossRef]

26. Good-Jacobson, KL; Szumilas, CG; Чен, Л.; Sharpe, AH; Томайко, М.М.; Shlomchik, MJ PD-1 регулира оцеляването на В клетките на зародишния център и образуването и афинитета на дългоживеещи плазмени клетки. Нац. Immunol. 2010, 11, 535–542. [CrossRef]

27. Воленберг, И.; Agua-Doce, A.; Ернандес, А.; Almeida, C.; Оливейра, VG; Faro, J.; Graca, L. Регулиране на реакцията на зародишния център от Foxp3 плюс фоликуларни регулаторни Т клетки. J. Immunol. 2011, 187, 4553–4560. [CrossRef] [PubMed]

28. Литърман, Масачузетс; Pierson, W.; Лий, SK; Kallies, A.; Кавамото, С.; Rayner, TF; Сривастава, М.; Дивекар, Д.П.; Бийтън, Л.; Хоган, JJ; et al. FOXP3 плюс фоликуларни регулаторни Т клетки контролират отговора на зародишния център. Нац. Med. 2011, 17, 975–982. [CrossRef]

29. Майлс, Б.; Connick, E. Контрол на зародишния център от фоликуларни регулаторни Т клетки по време на инфекция. Отпред. Immunol. 2018, 9, 2704–3710. [CrossRef]

30. Фу, У.; Лиу, X.; Лин, X.; Feng, H.; Сън, Л.; Li, S.; Чен, Х.; Танг, Х.; Лу, Л.; Джин, В.; et al. Дефицитът на Т фоликуларни регулаторни клетки насърчава автоимунитета. J. Exp. Med. 2018, 215, 815–825. [CrossRef]

31. Пицалис, К.; Джоунс, GW; Bombardieri, М.; Jones, SA Ектопични лимфоидни структури при инфекция, рак и автоимунитет. Нац. Rev. Immunol. 2014, 14, 447–462. [CrossRef]

32. Алулу, М.; Carr, EJ; Гадор, М.; Bignon, A.; Liblau, RS; Fazilleau, N.; Linterman, MA Фоликуларните регулаторни Т клетки могат да бъдат специфични за имунизиращия антиген и да произлизат от наивни Т клетки. Нац. Общ. 2016, 7, 10579–10589. [CrossRef]

33. Винуеса, CG; Санс, И.; Cook, MC Дисрегулация на зародишни центрове при автоимунно заболяване. Нац. Rev. Immunol. 2009, 9, 845–857. [CrossRef]

34. Чучак, Х.; Yrlid, U.; Reizis, B.; Калинке, У.; Johansson-Lindborn, B. Сигнализацията на интерферон тип I в дендритни клетки стимулира развитието на Т фоликуларни помощни клетки, резидентни на лимфните възли. Имунитет 2009, 31, 491–501. [CrossRef]

35. Desvignes, L.; Улф, AJ; Ernst, JD Динамични роли на IFN тип I и тип II при ранна инфекция с Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 2012, 188, 6205–6215. [CrossRef]

36. Телес, MBR; Graeber, GT; Krutzik, RS; Монтоя, Д.; Шенк, М.; Лий, JD; Комисопулу, Е.; Kelly-Scumpia, K.; Чун, Р.; Iyer, SS; et al. Интерферон тип I потиска предизвиканите от интерферон тип II човешки антимикобактериални отговори. Наука 2013, 339, 1448–1453. [CrossRef]

37. Джи, DX; Ямаширо, LH; Чен, KJ; Мукайда, Н.; Крамник, И.; Дарвин, KH; Vance, RE Тип I интерферон-управлявана чувствителност към Mycobacterium tuberculosis се медиира от IL-1Ra. Нац. Microbiol. 2019, 4, 2128–2135. [CrossRef]

38. Manca, C.; Ценова, Л.; Bergtold, A.; Freeman, SH; Tovey, М.; Мусер, MJ; Бари, ЕК, 3-ти; Фрийдман, HV; Kaplan, G. Вирулентността на клиничен изолат на Mycobacterium tuberculosis при мишки се определя от неспособността да се индуцира Th1 тип имунитет и се свързва с индукция на IFN-/. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 2007, 98, 5752–5757. [CrossRef] [PubMed]

39. Telesca, C.; Анджелико, М.; Piccolo, P.; Nosotti, L.; Morrone, A.; Longhi, C.; Carbone, М.; Baiocchi, L. Интерферон-алфа лечение на хепатит D предизвиква обостряне на туберкулоза при имигрант. J. Инфектирайте. 2007, 54, e223–e226. [CrossRef] [PubMed]

40. Джакомини, Е.; Ремоли, ME; Гафа, В.; Пардини, М.; Fattorini, L.; Coccia, EM IFN- подобрява BCG имуногенността чрез действие върху DC узряването. J. Leukoc. Biol. 2008, 85, 462–468. [CrossRef] [PubMed]

41. Ривас-Сантяго, CE; Guerrero, GG IFN- Повишаване на Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Güerin-ваксина, стимулира Th1 тип клетъчен отговор и защита срещу M. tuberculosis инфекция. BioMed Res. Вътр. 2017, 2017, 6760. [CrossRef]

42. Гереро, GG; Rangel-Moreno, J.; Islas-Trujillo, S.; Rojas-Espinosa, O. Последователно интрамускулно усилване с IFN-Alpha защитава Mycobacterium bovis BCG-ваксинирани мишки срещу M. lepraemurium инфекция. BioMed Med. Рез. Вътр. 2015, 2015, 414027.

43. Макнаб, Ф.; Майер-Барбър, К.; Шер, А.; Wack, A.; O'Garra, A. Тип I интерферон при инфекциозни заболявания. Нац. Rev. Immunol. 2015, 15, 67–103. [CrossRef]

44. O'Shea, JJ; Visconti, R. Тип I IFN и регулиране на TH1 отговорите: Енигмите са разрешени и възникнали. Нац. Immunol. 2000, 1, 17–19. [CrossRef]

45. González-Navajas, JM; Лий, Дж.; Дейвид, М.; Raz, E. Имуномодулаторни функции на интерферони тип I. Нац. Rev. Immunol. 2012, 12, 125–135. [CrossRef]

46. ​​Le Bon, A.; Издръжлив, DF тип I интерферон като стимул за кръстосано праймиране. Cytokine Growth Fact Rev. 2008, 19, 33–40. [CrossRef]

47. Брачи, Л.; Канини, И.; Puzelli, S.; Сестили, П.; Вендити, М.; Спада, М.; Донатели, И.; Belardelli, F.; Proietti, E. Тип I IFN е мощен лигавичен адювант за селективна интраназална ваксинация срещу грипен вирус при мишки и засяга улавянето на антиген на мукозно ниво. Vaccine 2005, 23, 2994–3004. [CrossRef]

48. Диван, РБ; Атмар, RL; Кейт, TR; Quarles, JM; Кайтел, Вашингтон; Arden, NH; Уелс, Дж.; Ниньо, Д.; Wyde, PR Контрастни ефекти на интерферон тип I като мукозен адювант за ваксина срещу грип при мишки и хора. Vaccine 2009, 27, 5344–5348. [CrossRef] [PubMed]

49. Дентън, AE; Innocentin, S.; Carr, EJ; Брадфорд, BM; Lafouresse, F.; Mabbott, NA; Mörbe, U.; Лудевиг, Б.; Groom, JR; Good-Jacobson, KL; et al. Интерферон тип I индуцира CXCL13 за подпомагане на образуването на ектопичен зародишен център. J. Exp. Med. 2019, 216, 621–637. [CrossRef]

50. Толедо, PTG; Батиста-Силва, LR; Медейрос, RCA; Лара, FA; Moraes, MO Тип I интерферони, автофагия и метаболизъм на гостоприемника при проказа. Отпред. Immunol. 2018, 23, 806–817. [CrossRef]

51. Джан, В.; Джан, Й.; Zheng, H.; Пан, Й.; Liu, H.; Du, P.; Уан, Л.; Liu, J.; Жу, Б.; Zhag, G.; et al. Геномно секвениране и анализ на щамове BCG ваксина. PLoS ONE 2013, 8, e071243. [CrossRef]

52. Уек-Родригес, К.; Силва-Миранда, М.; Arce-Paredes, P.; Rojas-Espinosa, O. Ефект на реактивни кислородни посредници върху жизнеспособността и инфекциозността на Mycobacterium lepraemurium. Вътр. J. Exp. Патол. 2007, 88, 137–145. [CrossRef]

53. Ким, SH; Коен, Б.; Novick, D.; Rubinstein, M. Интерферонови рецептори тип I на бозайници се състоят от две субединици: IFN-R1 и IFN-R2. Gene 1997, 196, 279–286. [CrossRef]

54. Луо, Й.; Чен, X.; Han, RA; O'Donnell, M. Рекомбинантен бацил Calmette-Guérin (BCG), експресиращ човешки интерферон-алфа 2B, демонстрира повишена имуногенност. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123, 264–270. [CrossRef] [PubMed]

55. Сън, Е.; Ниан, X.; Liu, C.; Фен, X.; Han, R. Конструиране на рекомбинантен човешки IFN -2b BCG и неговите антитуморни ефекти върху ракови клетки на пикочния мехур in vitro. Женет. Mol. Рез. 2015, 14, 3436–3449. [CrossRef] [PubMed]

56. Прабхакаран, К.; Харис, EB; Kirchheimer, WF Свързване на 14C-белязана допа от Mycobacterium leprae in vitro. Вътр. J. Lepr. Други Mycobact. дис. 1976, 44, 58–64.

57. Draper, P. Пречистване на Mycobacterium leprae. В протоколите от приложение 4 на доклада от петата среща на научната работна група по имунология на проказата (IMMLEP), Женева, Швейцария, 24–26 юни 1980 г.; Световна здравна организация: Женева, Швейцария, 1980 г.

58. Ischiropoulos, H.; Нелсън, Дж.; Дюран, Д.; Al-Mehdi, A. Реакции на азотен оксид и пероксинитрит с органични молекули и пероксидаза от хрян: Интерференция с определянето на водороден пероксид. Свободен Радик. Biol. Med. 1996, 20, 373–381. [CrossRef]

59. Шьон, Т.; Ернандес-Пандо, Р.; Negesse, Y.; Leekassa, R.; Сундквист, Т.; Britton, S. Експресия на индуцируема синтаза на азотен оксид и нитротирозин в гранични лезии на проказа. бр. J. Dermatol. 2001, 145, 809–815. [CrossRef]

60. Силва-Миранда, М.; WeK-Родригес, К.; Мартинез, CE; Rojas-Espinosa, O. Експресия на циклооксигеназа-2, алфа 1-киселинен гликопротеин и индуцируема синтаза на азотен оксид в развиващите се лезии на миша проказа. Вътр. J. Exp. Пътека. 2006, 87, 485–494. [CrossRef]

61. Ернандес-Пандо, Р.; Шьон, Т.; Orozco, EH; Серафин, Т.; Estrada-Garcia, I. Експресия на индуцируема синтаза на азотен оксид и нитротирозин по време на еволюцията на експериментална белодробна туберкулоза. Exp. Токсичен. Патол. 2001, 53, 257–265. [CrossRef]

62. Изкуе, А.; Coombes, JL; Powrie, F. Регулаторни лимфоцити и чревно възпаление. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 313–338. [CrossRef]

63. Сакагучи, С.; Мияра, М.; Константино, CM; Hafler, DA FOXP3 плюс регулаторни Т клетки в човешката имунна система. Нац. Rev. Immunol. 2010, 10, 490–500. [CrossRef]

64. Plotkin, SA Корелати на защитата, предизвикана от ваксинация. Clin. Ваксина Имунол. 2010, 17, 1055–1065. [CrossRef] [PubMed]

65. Ву, Х.; Чен, Й.; Liu, H.; Xu, L.-L.; Teuscher, P.; Wang, S.; Lu, S.; Dent, AL Фоликуларните регулаторни Т клетки потискат производството на цитокини от фоликуларните помощни Т клетки и оптимизират IgG отговорите при мишки. Евро. J. Immunol. 2016, 46, 1152–1161. [CrossRef] [PubMed]

66. Джеянатан, М.; Дамянович, Д.; Shaler, CR; Лай, Р.; Wortzman, М.; Ин, С.; Zganiacz, A.; Лихти, Д.; Xing, Z. Диференциално отпечатан вроден имунитет чрез ваксинация за усилване на лигавицата определя противотуберкулозните имунни защитни резултати, независимо от Т-клетъчния имунитет. Мукозен имунол. 2013, 6, 612–625. [CrossRef] [PubMed]

67. Джеянатан, М.; Шао, З.; Ю, X.; Harkness, R.; Jiang, R.; Li, J.; Xing, Z.; Zhu, T. AdHu5Ag85A Имунизацията за усилване на респираторната лигавица подобрява защитата срещу белодробна туберкулоза при BCG-праймирани нечовекоподобни примати. PLoS ONE 2015, 10, e0135009. [CrossRef]

68. Афхами, С.; Drumond, VA; D'Agositnio, MR; Джеянатан, М.; Гилграс, А.; Xing, Z. Усъвършенстване на стратегии за имунотерапевтична ваксина срещу белодробна туберкулоза. Отпред. Immunol. 2020, 11, 557809. [CrossRef]

69. Торадо, Е.; Робинсън, RT; Cooper, AM Клетъчен отговор на микобактерии: Балансиране на защитата и патологията. Тенденции Immunol. 2011, 32, 66–72. [CrossRef]

70. Сю, X.; Гао, В.; Cheng, S.; Ин, Д.; Li, F.; Wu, Y.; Сън, Д.; Джоу, С.; Уанг, Д.; Джан, Й.; et al. Противовъзпалителни и имуномодулиращи механизми на аторвастатин в миши модел на травматично мозъчно увреждане. J. Neuroinflamm. 2017, 14, 167–182. [CrossRef]

71. Azeem, W.; Maukon, BR; Appel, S.; Maegrete, AO; Kalland, KH Двойни про- и противовъзпалителни характеристики на дендритни клетки, получени от моноцити. Отпред. Immunol. 2020, 11, 438–453. [CrossRef]

72. Султана, С.; Bishay, B. Неутрализиране на TNFR-1 и TNFR-2 модулира предизвикания от S. aureus септичен артрит чрез регулиране на нивата на провъзпалителни и противовъзпалителни цитокини по време на прогресията на заболяването. Immunol. Lett. 2018, 196, 33–51. [CrossRef]

73. Порнография, Д.; Гилиган, ММ; Хуанг, С.; Гартунг, А.; Cortes-Puch, I.; Sime, PJ; Phipps, RP; Серхан, CHN; Hammock, BD Резолюция на възпалението: двупосочен подход за предотвратяване на цитокинови бури при COVID-19 Cancer Metastasis Rev. 2020, 39, 337–340. [CrossRef]

74. Лонги, MP; Trumpfheller, C.; Idoyaga, J.; Каски, М.; Матос, И.; Kluger, C.; Салазар, AM; Колона, М.; Steinman, RM Дендритните клетки изискват системен отговор на интерферон тип I, за да узреят и индуцират CD4 плюс Th1 имунитет с поли IC като адювант. J. Exp. Med. 2009, 206, 1589–1602. [CrossRef]

75. Khader, SA; Гуглани, Л.; Rangel-Moreno, J.; Гопал, Р.; Джунечко, BAF; Фонтан, JJ; Martino, C.; Пърл, JE; Tighe, М.; Lin, Y.-Y.; et al. IL-23 е необходим за дългосрочен контрол на Mycobacterium tuberculosis и образуването на В клетъчни фоликули в заразения бял дроб. J. Immunol. 2011, 187, 5402–5407. [CrossRef] [PubMed]

76. Choreño-Parra, JA; Боба, С.; Rangel-Moreno, J.; Ахмед, М.; Мехра, С.; Роза, Б.; Мартин, Дж.; Митрева, М.; Каушал, Д.; Zúñiga, J.; et al. Инфекцията с Mycobacterium tuberculosis HN878 индуцира човешки В-клетъчни фоликули в мишки. J. Инфектирайте. дис. 2020, 221, 1636–1646. [CrossRef] [PubMed]

77. Schmidt, EG; Харибхай, Д.; Уилямс, JB; Aggarwal, P.; Jia, S.; Charbonnier, LM; Ян, К.; Лорие, Р.; Търнър, А.; Ziegelbauer, J.; et al. IL-10, произведен от iTreg клетки, контролира колит и патогенни екс. Treg клетки по време на имунотерапия. J. Immunol. 2012, 189, 5628–5648. [CrossRef]

78. Рубцово, Ю.П.; Rasmussen, JP; Chi, Y.; Fontenot, J.; Кастели, И.; Йе, X.; Treuting, P.; Siewe, I.; Roers, A.; Хендерсън, WRJ; et al. Регулаторният интерлевкин, получен от Т-клетките-10, ограничава възпалението в границите на околната среда. Имунитет 2018, 28, 546–558. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com