Изследване на токсичността на ифосфамид предизвиква общ регулатор нагоре по веригата в черния дроб и бъбреците

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han и др

Резюме:

Ифосфамид е алкилиращ агент, синтетичен аналог на циклофосфамид, използван за лечение на различни солидни ракови заболявания. В това проучване токсичността на ифосфамид е оценена чрез интраперитонеално приложение на единична и многократна доза при плъхове съгласно насоките за добра лабораторна практика и е последван допълнителен експеримент с микрочипове в подкрепа на токсикологичните открития. Единична доза ифосфамид (50 mg/kg) не предизвиква никакви патологични промени. Междувременно се наблюдава тежка бъбречна токсичност в групите на последователно прилагани 7 и 28 дни, със значително повишаване на нивата на урея в кръвта и нивата на креатинина. В анализа на токсичния списък гените, свързани със синтеза на холестерол, са засегнати най-вече в черния дроб, а гените, свързани с бъбречната недостатъчност, са засегнати вбъбрекслед приложение на ифосфамид. Освен това, регулаторният фактор на интерферон 7 беше избран като основен регулатор нагоре по веригата, който се промени и в дветечерен дробибъбрек, и беше установено, че взаимодейства с други целеви гени, като специфична за убиквитин пептидаза 18, радикален S-аденозил метионинов домен, съдържащ 2, и интерферон-стимулиран ген 15, което беше допълнително потвърдено от RT-PCR анализ в реално време. В заключение, препотвърдена предубедена към бъбреците токсичност на органите на ифосфамид и идентифицирани идентично променени гени и в дватачерен дробибъбрек. Необходими са допълнителни всеобхватни токсикогеномични изследвания, за да се разкрие точната връзка между индуцираните от ифосфамид гени и токсичността на органите.

Ключови думи:ифосфамид; хепатотоксичност; нефротоксичност; интраперитонеална токсичност

Цистанче е полезно за черния дроб и бъбреците

1. Въведение

Ифосфамид е алкилиращ агент, синтетичен аналог на циклофосфамид, използван за лечение на различни солидни ракови заболявания, включително саркоми и лимфоми. Ифосфамид е неспецифично противораково лекарство за клетъчния цикъл, което пречи на репликацията на ДНК и производството на РНК [1]. Въпреки че ифосфамид се понася относително добре в сравнение с други токсични алкилиращи агенти, известно е, че е свързан с множество животозастрашаващи нежелани реакции, които ограничават клиничната му употреба [2]. Основните странични ефекти на ифосфамид включват тежко бъбречно увреждане в резултат на реактивни токсични видове от ифосфамид, включително острибъбрек нараняване, интерстициален нефрит, хеморагичен цистит и синдром на Fanconi [3]. В клиниките се съобщава за тежка мултиорганна токсичност при пациенти, които са имали ранна бъбречна токсичност и повтаряща се индуцирана от висока доза ифосфамид недостатъчност на един орган, която е довела до последваща органна недостатъчност [4,5].

Токсичният метаболит на ифосфамид, акролеин и хлороацеталдехид е основен отговорен фактор за органната токсичност на ифосфамид. Предишни проучвания се фокусираха главно върху факторите, влияещи върху превръщането на ифосфамид в токсични метаболити, по-специално цитохром P450 (CYP) [6]. Относително изобилните CYP3A4 и CYP3A5 в бъбреците водят до токсични промени в ифосфамид и предизвикват нефротоксичност [7]. Акролеинът е силно реактивен алдехид, който може да активира пътя на вътреклетъчните реактивни окислителни гени и да увреди клетъчния органел. Хлороацеталдехид съобщава за потискане на активирането на комплекс I в митохондриалната дихателна верига, което може да доведе до изчерпване на вътреклетъчния глутатион (GSH) и клетъчна смърт [8].

Токсикологичното изследване на множество органи е по-полезно за разбирането на системните ефекти на лекарствата, отколкото насочването към конкретни органи за изследвания на токсичността. Черният дроб и бъбреците са основни органи, които участват в метаболизма и екскрецията на лекарствата и тези основни органи са предразположени към нежелани лекарствени реакции; често следва органна токсичност. Освен това, интегративната токсикологична оценка може да представи различни патологични находки, които могат да помогнат за разбирането и прогнозирането на предизвиканата от лекарството токсичност в системата.

Много проучвания са използвали профили на генна експресия, за да предскажат потенциалните отрицателни ефекти на химикалите. Въпреки това, повечето по-ранни проучвания се фокусираха върху оценката на токсичността на отделни целеви органи, само с ограничени патологични симптоми [9]. Освен това, комбинирано с генно профилиране на базата на микрочипове, то ще доведе до цялостно разбиране на токсичността на системно ниво, което може да предотврати потенциална токсичност, свързана с лекарства [10]. В това отношение, интегративни многоорганни токсикологични подходи с профилиране на генната експресия са използвани в проучвания на модели за прогнозиране на токсичност, за да се преодолеят данните за токсичност, получени от оценка на токсичността на един орган, което е недостатъчно за разбиране на токсичните механизми на лекарствата в системата [11].

В това проучване ние описваме токсичността на ифосфамид вбъбрекичерен дробслед остра и повтаряща се експозиция при плъхове Sprague–Dawley (SD). Проведени са анализи за профилиране на поддържаща генна експресия, за да се разкрие общият целеви ген, който е бил променен от ифосфамид както в черния дроб, така ибъбрек, което предполага вникване в интегративната токсичност на ифосфамид.

2. Резултати

2.1. Изследване за токсичност на единична доза

Не е наблюдавана токсичност в групите с 12,5, 25 и 50 mg/kg ифосфамид - не смърт, токсични симптоми, промени в телесното тегло или хистопатологични находки.

Междувременно, в хематологичното изследване, относителният брой на ретикулоцитите (RET) и абсолютният брой на неутрофилите (NEUA) и лимфоцитите (LYMA) намаляват в зависимост от дозата.

2.2. Едноседмично проучване за токсичност при многократно прилагане

Общото телесно тегло намалява след 1 седмица на приложение на ифосфамид и средните стойности на загуба на телесно тегло в групата на 100 mg/kg са по-високи от тези в групата на 75 mg/kg (Таблица 1). Междувременно, относителното тегло на органа постепенно се увеличава в групите, лекувани с ифосфамид (Таблица 2).

Една седмица последователно IP приложение на ифосфамид потиска хематологичния индекс, включително RBC, HGB, HCT, MCV и PLT, по дозозависим начин (Таблица 3). Освен това BUN и CREA се увеличават 1,2 пъти в контролната група в сравнение с групата на ифосфамид (Таблица 4).Бъбрекнараняванебеше допълнително подкрепено от хистопатологично изследване.

Не са наблюдавани хистопатологични признаци в черния дроб на мишки в групите на 75 и 100 mg/kg ифосфамид (Фигура 1А). Междувременно,бъбрециот групите на 75 и 100 mg/kg ифосфамид е установено, че имат минимална до лека степен на патологична промяна, включително тубулна дегенерация/дилатация (1 умерена в групата на 100 mg/kg), едноклетъчна некроза, хиперплазия на уротелиума и фокален кръвоизлив /задръстване (Таблица 5). В допълнение, очевидно увеличение на експресията на KIM-1 в областта на бъбречните тубули се наблюдава вбъбрекот групата на 100 mg/kg (Фигура 1B).

2.3. Четириседмично проучване за токсичност при многократно прилагане

Смъртност се наблюдава при групите, лекувани с 50 (5/10) и 70 (10/10) mg/kg след 21 и 10 дни последователно приложение, съответно. Освен това намаленото телесно тегло с повишено относително тегло на органа,черен дроб, ибъбрек, във всички групи, лекувани с ифосфамид, поддържа 4-седмична токсичност при многократно прилагане.

Извършени са хематологични и серумни биохимични анализи на оцелелите субекти. Няколко кръвни параметъра, включително RET, RBC, MONA, EOSA и LUCA, бяха значително намалени след 4 седмици приложение на ифосфамид.

В сравнение с контролната група, биохимичните анализи показват статистически разлики след 4 седмици приложение на ифосфамид. Например, нивата на AST и CK бяха значително повишени, а съотношението A/G, GLU и GGT бяха намалени (p < 0.01)="" в="" групата,="" лекувана="" с="" 50="" mg/kg,="" в="" сравнение="" с="" контролата="">

2.4. Анализ на индуцирана от ифосфамид генна експресия

Индуцираните от ифосфамид DEG бяха идентифицирани в черния дроб ибъбректъкани (Таблица 6). За черния дроб диференциално експресираните гени включват 2672 гена при 100 mg/kg BW/ден, 1283 гена са регулирани нагоре и 1389 гена са регулирани надолу. В бъбреците 401 гена са диференциално експресирани при 100 mg/kg телесно тегло/ден – 149 гена са регулирани нагоре и 252 гена са регулирани надолу. Както в черния дроб, така и в бъбреците, броят на регулираните надолу гени е по-голям от броя на гените, регулирани нагоре. Това може да предполага, че лечението с ифосфамид изглежда инхибира генната експресия.

Резултатите от анализа на биологичната функция са изброени в таблица 7. Установено е, че 1-седмичното приложение на ифосфамид променя гените, свързани с развитието на органите, най-вече в черния дроб. Вбъбрек, беше потвърдено, че гените, свързани с локализацията на имунните клетки, са засегнати най-вече.

В анализа на каноничния път на DEG, промените в синтеза на холестерол и гените, свързани с пътя на представяне на антиген, са очевидни вчерен дробибъбректъкани, съответно (Фигура 2). Освен това, LXE/RXR и сигнализирането на отговора на острата фаза бяха общият високорегулиран каноничен път вчерен дробибъбрек, които са замесени съответно в липидната хомеостаза и сигнализирането на възпалителни цитокини.

В анализа на чернодробния токсичен списък, гените, свързани със синтеза на холестерол, са засегнати най-вече, последвани от положителните протеини на отговор на острата фаза и панела с остра бъбречна недостатъчност (Таблица 8). Освен това резултатите от списъка на бъбреците разкриха, че гените, свързани с бъбречната недостатъчност, като цяло са засегнати от ифосфамид, включително биомаркери за обратим гломерулонефрит и панел за остра бъбречна недостатъчност.

Въз основа на базата от знания на IPA, общ регулатор нагоре по веригата регулира генната експресия в черния дроб и бъбреците след лечение с ифосфамид (Фигура 3). IRF7 е основният регулатор, който се променя както в черния дроб, така и в бъбреците и е установено, че взаимодейства с други целеви гени като USP18, RSAD2 и ISG15. Освен това, RT-PCR анализът в реално време потвърди експресията на IRF7, USP18, RSAD2 и ISG15. Въпреки че степента на промените във всеки ген е различна между черния дроб и бъбреците, експресията е потисната както в чернодробната, така и в бъбречната тъкан след 1 седмица приложение на ифосфамид. RSAD2 и USP18 са променили предимно гени чрез лечение с ифосфамид съответно в черния дроб и бъбреците.

3. Дискусия

В това проучване цялостната токсичност на ифосфамид в множество органи е изследвана с различни дози и условия на експозиция чрез IP път при плъхове съгласно стандарта GLP. В клиниките ифосфамид може да упражнява бимодално антитуморно действие с цитотоксични и имуномодулиращи ефекти, комбинирани с адаптивна имунотерапия [12]. Известно е, че ифосфамид се елиминира основно през бъбреците и около 80 процента от дозата е в непроменена форма, нефротоксичността е често известен страничен ефект на ифосфамид, а метаболитите като хлороацеталдехид и акролеин са отговорни за неговата клинична употреба [13, 14].

В настоящото проучване 1-седмично повтарящо се проучване за токсичност беше подходящо за изследване на токсичността на органите, получена от ифосфамид. Една седмица приложение на ифосфамид потиска кръвния индекс по дозозависим начин, което може да отразява типичната миелосупресия, получена от ифосфамид. Наред с нефротоксичността, няколко доклада показват, че миелосупресията е една от основните ограничаващи дозата токсичности на ифосфамид и левкопенията обикновено е по-тежка от тромбоцитопенията [15,16]. Нефротоксичността на ифосфамид може да доведе до синдром на Fanconi, при който има увреждане на функцията на проксималните тубули, което води до необратимо увреждане, а токсичният метаболит акролеин провокира уротоксичност с хеморагичен цистит [17]. Това е в съответствие с резултатите от настоящото изследване. В хистопатологичното изследване бъбреците и черният дроб са изследвани, за да се изследват патологични изменения, произтичащи от ифосфамид. И в двете групи, приемащи 75 и 100 mg/kg ифосфамид, бяха открити големи области на тубулна дегенерация и дилатация с хиперплазия на уротелиум в областта на бъбречното легенче. Освен това, експресията на KIM-1, молекула за увреждане на проксималните тубули на бъбреците, подкрепя наличието на свързана с ифосфамид нефротоксичност. Междувременно се наблюдава само минимална перипортална вакуолация в черния дроб. Освен това, въпреки че стойностите на AST и ALT намаляват в зависимост от дозата, промените са в референтния диапазон [18]. По-дълбоките причини за понижените нива на чернодробните ензими ще трябва да бъдат допълнително проучени. Общоприето е, че ифосфамидът е алкилиращ агент, който рядко се свързва с хепатотоксичност и само няколко случая са докладвани за индуциране на чернодробно увреждане, особено когато се комбинира с други химиотерапевтични лекарства като доксорубицин [19].

Напоследък забележим напредък в данните за генната експресия в токсикологията с високопроизводителни технологии доведе до генериране на достатъчно големи набори от данни в проучвания за токсичност и бяха направени много опити за прилагане на генния профил за прогнозиране на химическа токсичност [10,20]. В това проучване беше проведен анализ на микрочипове, за да се анализира отговорът на транскриптома, индуциран от прилагането на ифосфамид, и DEGs с кратна промяна, по-голяма или равна на 1,5, бяха избрани като целеви ген и бяха използвани биологичната функция, каноничният път и анализът на Tox list за да разберем функцията на индуцираните от ифосфамид гени. Извършен е допълнителен регулаторен анализ нагоре, за да се оцени възможността за мултиорганна токсичност в черния дроб и бъбреците.

В това проучване бяха избрани DEG, променени 15-кратно, и понижените гени бяха малко по-доминиращи от повишените гени както в черния дроб (52 процента), така и в бъбреците (62 процента). Резултатите от анализа на биологичната функция показват, че ифосфамид променя гените с биологични функции, свързани с развитието на тъканите, които обикновено се наблюдават както в черния дроб, така и в бъбреците.

Предишно проучване на Snouber et al. [21] съобщават, че е установено, че лечението с ифосфамид понижава Nrf-2 медиираните пътища на стрес окислителен отговор в микрофлуидната култура [21]. В съответствие с предишните проучвания, NRF2-медиираният път на реакция на оксидативен стрес беше значително модулиран от топ мрежи, което беше потвърдено както от настоящия каноничен път, така и от анализа на tox-list. Настоящите променени Nrf-2 медиирани пътища на окислителен отговор на стрес може да са тясно свързани с токсичния метаболит ифосфамид. Множество токсични метаболити на ифосфамид могат да реагират с GSH, мощен антиоксидант, за да образуват конюгати на различни места по протежение на пътя, а намаляването на нивото на GSH води до повишена токсичност, което показва значението на оксидативния стрес в органната токсичност на ифосфамид [8,22]. ]. В това отношение месна и N-ацетилцистеин се използват за облекчаване на органната токсичност на ифосфамид. Mesna служи като регионален детоксикант чрез свързване с токсичния метаболит на ифосфамид, главно срещу акролеин, чрез добавяне на Michael за образуване на по-малко вредно вещество [23]. Освен това се съобщава, че N-ацетилцистеинът има антиоксидантна активност и подобрява изчерпването на GSH при условия на оксидативен стрес [24]. Необходими са допълнителни проучвания, за да се изясни точната връзка между антидота на ифосфамид и пътя, регулиран при нефротоксични условия. Можем да спекулираме, че подобряването на токсичността на ифосфамид от месна или N-ацетилцистеин може да бъде последвано от подобрени Nrf-2-медиирани пътища на окислителен отговор на стрес.

В това проучване сигналите, свързани с възпалението, обикновено се регулират нагоре както в черния дроб, така и в бъбреците, което може да бъде разпознато чрез сигнализиране на острата фаза в анализа на каноничния път. Този резултат показва значението на възпалителната реакция в патофизиологията на органната токсичност на ифосфамид в двете тъкани, което допълнително се подкрепя от анализа на регулатора нагоре по веригата. В анализа на регулатора нагоре по веригата, гените, свързани със сигнала на IRF7 и интерферон (IFN), включително USP18, RSAD2 и ISG15, бяха избрани като общи регулатори нагоре по веригата в черния дроб и бъбреците. IRF7 е лимфоид-специфичен фактор, който е конститутивно експресиран в цитоплазмата на имунните клетки и може също да бъде индуциран от интерферон тип I, вирусна инфекция и външни стимули в различни клетки [25]. Предишно проучване съобщава за противоречиви про- или антионкогенни свойства на IRF7 в различни туморни клетки и промените в експресията на IRF7 са свързани с увреждане на ДНК [26–28].

В допълнение към важната си регулаторна роля в тип I IFN за антивирусни функции, се съобщава, че IRF7 потиска възпалителните реакции чрез сигналния път на TLR4 [29]. Освен това, Stout-Delgado et al. [30] съобщават, че индуцираното от стареенето окислително увеличение уврежда активността на IRF7, докато намаляването на стреса от антиоксидантни агенти подобрява активността на IRF7. В това проучване приложението на ифосфамид потиска експресията на регулаторите нагоре по веригата и моделите на експресия са идентични както в черния дроб, така и в бъбреците. Настоящите промени в експресията на IRF7 може да са свързани с възпалителната реакция и свойството на цитотоксичния алкилиращ агент на ифосфамид, което може да предложи IRF7 като обещаваща цел за органна токсичност на ифосфамид.

В това проучване открихме ген, който е идентично инхибиран както в черния дроб, така и в бъбреците след прилагане на ифосфамид, но тълкуването на неговото токсикологично значение беше фокусирано само върху бъбреците, което ограничава настоящото откритие. Освен това, допълнителни потвърждаващи проучвания, свързани с ефекта на наличния в търговската мрежа антидот ифосфамид върху текущо променения ген, могат да подкрепят настоящите открития.

В заключение, при многократно изследване на токсичността (1 седмица) на приложение на ифосфамид е установено, че има предубедена нефротоксичност, а не хепатотоксичност. В допълнение, настоящите резултати предоставят доказателства за индуцирана от ифосфамид хепатотоксичност и механизъм на нефротоксичност, който включва инхибиране на IRF-7. Необходими са по-нататъшни токсикогеномични изследвания на имунно-свързани органи, за да се изясни системният токсикологичен механизъм на ифосфамид и да се подкрепи връзката между генната и органната токсичност.

4. Материали и методи

4.1. Проучване върху животни

Осемседмични плъхове Sprague–Dawley (SD) без специфични патогени (n=140) са получени от Orient Bio Inc. (Seongnam, Корея). Животните бяха изследвани и аклиматизирани към лабораторните условия на околната среда за една седмица преди експеримента. Всички животни бяха настанени в пластмасови клетки при контролирани лабораторни условия (температура, 23 ± 3 ◦C; влажност, 55 ± 10 процента; и 12/12- h цикъл светлина/тъмнина) с лабораторна храна и вода ad libitum. Изследването върху животни беше одобрено от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Корейския институт по токсикология (Daejeon, Корея) и всички процедури бяха извършени в съответствие с Насоките за тестване за оценка на безопасността на лекарства от Корейската администрация по храните и лекарствата. Проучването при животни е разделено на три части: еднократна доза (остра) и многократна доза (1 седмица и 4 седмици) изследване на токсичността при последователно приложение. Четиридесет плъха бяха разпределени на случаен принцип в четири групи (контрола, t1, t2 и t3) с помощта на системата Path/Tox (версия 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) във всяко изследване на токсичността.

4.2. Експеримент за токсичност

Проучването за токсичност беше разделено на три части: проучвания за токсичност с единична доза (остра) и две многократни дози (последователна доза от 1 седмица или 4 седмици). За всяко изследване на токсичността плъховете бяха разпределени на случаен принцип в адекватни групи (контрола, доза 1, доза 2 и доза 3 за еднократни и 4-седмични проучвания за токсичност; контрола, доза 1 и доза 2 за 1- седмично изследване на токсичността) чрез използване на системата Path/Tox (версия 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). В проучването за токсичност ифосфамид се прилага интраперитонеално (IP), а контролната група получава дестилирана вода (DW). Дозата ифосфамид, използвана в изследването за токсичност, е както следва: изследване за остра токсичност (12,5, 25 и 50 mg/kg), 1-седмично изследване за токсичност (75 и 100 mg/kg телесно тегло/ден) и {{19 }}седмично изследване на токсичността (25, 50 и 70 mg/kg BW/ден). Общите клинични симптоми на животните, телесното тегло и смъртността се записват ежедневно по време на приложението и всички животни се умъртвяват 24 часа след последното приложение на ифосфамид. Бяха събрани кръвни проби и поставени в микроцентрофужни епруветки и EDTA-K2 епруветки съответно за серумна биохимия и хематологичен анализ. Тъканите на черния дроб и бъбреците се фиксират във формалдехид и се подлагат на хистопатологичен анализ. Допълнителна имунохистохимия, анализ на микрочипове и RT-PCR в реално време бяха извършени върху тъканите на черния дроб и бъбреците от изследването на субакутната токсичност (100 mg/kg BW/ден).

4.3. Хематологичен и серумен биохимичен анализ

Стандартните хематологични тестове бяха проведени с помощта на хематологична система ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Германия). Използвани са следните показатели: брой бели кръвни клетки (WBC), брой червени кръвни клетки (RBC), хематокрит (HCT), концентрация на хемоглобин, среден корпускуларен обем (MCV), среден корпускуларен хемоглобин (MCH), брой на тромбоцитите (PLT), брой лимфоцити (LYM), моноцити (MON), неутрофили (NEU), базофили (BAS), еозинофили (EOS) и големи неоцветени клетки (LUC) и ретикулоцити (RET).

Биохимичният анализ се провежда с помощта на автоматичен анализатор (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Токио, Япония) с центрофугиран серум. Основните биохимични показатели са аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), алкална фосфатаза (ALP), азот в кръвта в урината (BUN), креатинин (CREA), глюкоза (GLU), общ холестерол (TCHO), съотношение албумин/глобулин (A/G), триглицериди (TG), общ билирубин (TB), гама-глутамил трансфераза (GGT), фосфолипиди (PL), калций, хлорид, неорганичен натрий, фосфор и калий.

4.4. Хистопатологично и имунохистохимично изследване

Вградените в парафин тъкани бяха разрязани с дебелина 5-µm, оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и изследвани под микроскоп.

Бъбречната тъкан се подлага на имунохистохимия. Депарафинизираните и промити срезове се инкубират предварително с 10 процента кози серум, за да се блокира неспецифичното оцветяване. След това слайдовете се инкубират за една нощ с първичното анти-KIM1 антитяло (1: 750; Санта Круз, Калифорния, САЩ). След отстраняването на първичните антитела, срезовете бяха обработени с VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK) и KIM1 експресията беше изследвана под светлинен микроскоп.

4.5. Анализ на микрочипове и анализ на взаимодействие протеин-протеин (PPI).

Черният дроб и бъбреците от групата на 1-седмица (100 mg/kg) бяха хомогенизирани и общата РНК беше екстрахирана с RNase mini kit (Qiagen). Синтезът на cDNA беше постигнат с помощта на комплект за синтез на cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и подложен на микрочипове и PPI анализи.

Анализът на микрочипове беше извършен с помощта на Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 с GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, Калифорния, САЩ) и резултатите бяха обработени с помощта на софтуер за анализ GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Диференциално експресираните гени (DEGs), които се променят повече от 15-кратно след прилагане на ифосфамид, бяха избрани с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с post hoc теста на Tukey. Биологичните функции и каноничните пътища на избраните DEG бяха анализирани с помощта на софтуера Ingenuity Pathway Analysis (IPA, версия 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, Калифорния, САЩ) и беше извършен анализ на регулатора нагоре по веригата, за да се идентифицират регулаторите нагоре по веригата, които биха могли са отговорни за DEG, получени от токсичността на ифосфамид. Допълнителен мрежов анализ на взаимодействие протеин-протеин (PPI) на DEG беше извършен с помощта на софтуер STRING (версия 10) и взаимодействието беше потвърдено, когато средният резултат на достоверност беше над 0,4. Протеиновото взаимодействие е приблизителната вероятност да съществува предвидена връзка между два протеина в пътя на Енциклопедията на гените и геномите в Киото.

4.6. Количествено RT-PCR изследване в реално време

Експресията на общи регулаторни гени в изследването с микрочипове беше потвърдена с помощта на количествена RT-PCR в реално време. Ген-специфични праймери бяха получени от Bioneer (Daejeon, Корея). Праймерните последователности бяха както следва: интерферон регулаторен фактор 7 (IRF7): напред, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 и назад, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; специфична за убиквитин пептидаза 18 (USP18): напред, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 и обратен 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; радикал S-аденозил метионинов домен, съдържащ 2(RSAD2): напред, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 и назад, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; интерферон-стимулиран ген 15 (ISG15): напред, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3и назад, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Общата РНК се транскрибира обратно към сДНК, използвайки SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, СА, САЩ) и олиго-dT праймери, съгласно инструкциите на производителя. Нивата на експресия на иРНК на гени, свързани с регулация нагоре по веригата, бяха анализирани с помощта на системата StepOnePlus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, САЩ) с SYBR Green master mix (Applied Biosystems), съгласно протокола на производителя. 18S рибозомният РНК праймер беше използван като вътрешна контрола и резултатите бяха изразени като кратна промяна спрямо нормалната контролна група.

4.7. Статистически анализ

Данните бяха статистически анализирани с помощта на множество методи за сравнение. Когато тестът на Бартлет не показа значими отклонения от хомогенността на дисперсията, беше използван дисперсионен анализ (ANOVA), за да се определи дали някое от груповите средни стойности се различава при нивото на значимост p < {{0}}.05.="" в="" допълнение,="" тестът="" на="" dunnett="" беше="" използван="" за="" определяне="" на="" разликите="" в="" данните="" между="" контролната="" и="" третираната="" група,="" когато="" се="" установи,="" че="" данните="" са="" значими="" от="" теста="" anova.="" освен="" това,="" когато="" се="" наблюдават="" значителни="" отклонения="" от="" хомогенността="" на="" дисперсията="" от="" теста="" на="" bartlett,="" беше="" проведен="" непараметричен="" сравнителен="" тест,="" kruskal-wallis="" (h)="" test,="" за="" да="" се="" определи="" дали="" някое="" от="" груповите="" средни="" стойности="" се="" различава="" при="" p=""><0,05. когато="" се="" наблюдава="" значителна="" разлика="" в="" теста="" на="" kruskal–wallis="" (h),="" беше="" проведен="" субтестът="" на="" dunn's="" rank,="" за="" да="" се="" определят="" количествено="" специфичните="" двойки="" групови="" данни,="" които="" бяха="" значително="" различни="" от="" средната="" стойност.="" точният="" тест="" на="" фишер="" беше="" проведен="" за="" сравняване="" на="" двойки="" данни="" (включително="" разпространение="" и="" процент).="" нивото="" на="" вероятност="" беше="" зададено="" на="" 1="" или="" 5="" процента.="" бяха="" извършени="" статистически="" анализи="" чрез="" сравняване="" на="" данните="" от="" различните="" групи="" на="" лечение="" с="" тези="" от="" контролната="" група,="" използвайки="" path/tox="" (версия.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Декларация за наличност на данни:

Данните се съдържат в статията или в Допълнителните материали.

Конфликти на интереси:

Авторите декларират, че нямат конкурентни интереси.

Препратки

1. Палмерини, Е.; Сетола, Е.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Риги, А.; Longhi, A.; Чезари, М.; Пайоли, А.; Хаким, Р.; et al. Висока доза ифосфамид при пациенти с рецидивиращ и неоперабилен високостепенен остеосарком: ретроспективна серия. Клетки 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Странични ефекти на ифосфамид. Онкология 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Спрангерс, Б.; Lapman, S. Растящите болки на ифосфамид. Clin. Kidney J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Елиас, АД; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Шварц, Г.; Теплер, И.; McCauley, M.; Мазанет, Р.; Schnipper, L.; Фрай, Е., 3-то; Antman, KH Висока доза ифосфамид/карбоплатин/етопозид с поддръжка на автоложни хематопоетични стволови клетки: Безопасност и бъдещи насоки. Семин. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Моленкопф, А.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Последователен курс и проспективно управление на индуцирана от ифосфамид многоорганна токсичност. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Алекса, К.; Matsell, D.; Краус, К.; Gelboin, H.; Ито, С.; Koren, G. Цитохром P450 3A и 2B6 в развиващия се бъбрек: Последици за нефротоксичността на ифосфамид. Pediatr. Нефрол. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Лоуенберг, Д.; Thorn, CF; Деста, З.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB резюме: Пътища на ифосфамид, фармакокинетика и фармакодинамика. Фармакогенет. Геном. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Мартин-Брисак, Н.; Лау, В.; Янг, К.; O'Brien, PJ Акролеин и хлороацеталдехид: Изследване на клетъчните и безклетъчните биомаркери за токсичност. Chem. Biol. Взаимодействайте. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Ким, Дж.; Shin, M. Интегративен модел на прогнозиране на токсичност, предизвикана от много органи, използвайки данни за генна експресия. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Александър-Дан, Б.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Шарма, Н.; Бериндан-Неагое, И.; Módos, D.; Bender, A. Развитие в токсикогеномиката: Разбиране и прогнозиране на индуцирана от съединение токсичност от данни за генна експресия. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Ким, JY; Kim, YS Изграждане на прогнозен модел за оценка на токсичността на множество органи. Mol. Клетъчен токсикол. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Биното, Г.; Трентин, Л.; Semenzato, G. Ифосфамид и циклофосфамид: Ефекти върху имунологичното наблюдение. Онкология 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Горджани, Н.; Бенешич, А.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Индуцирана от хлороацеталдехид и акролеин смърт на човешки проксимални тубулни клетки. Pediatr. Нефрол. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Палет, Н.; Джоли, Д.; Леви, С.; Шове, С.; Trivin, C.; Аугусто, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Нефротоксичност на ифосфамид при възрастни пациенти. Clin. Kidney J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ифосфамид/месна. Преглед на неговата антинеопластична активност, фармакокинетични свойства и терапевтична ефикасност при рак. Лекарства 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Засаждане, А.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Фаза I проучване на доцетаксел и ифосфамид при пациенти с напреднали солидни тумори. бр. J. Рак. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Хронична нефротоксичност на ифосфамид при деца. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Шарп, П.; Vilano, JS Лабораторният плъх; CRC Press: Бока Ратън, Флорида, САЩ, 2012 г.
19. Cheung, MC; Джоунс, RL; Judson, I. Остра чернодробна токсичност с ифосфамид при лечението на саркома: Доклад за случай. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Използване на транскриптомика за разбиране на механизмите на индуцирана от лекарства токсичност. Фармакогеномика 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Жак, С.; Monge, М.; Legallais, C.; Leclerc, E. Транскриптомен анализ на ефекта на ифосфамид върху MDCK клетки, култивирани в микрофлуидни биочипове. Геномика 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Дирвен, Х.А.; Мегенс, Л.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Глутатионова конюгация на цитостатичното лекарство ифосфамид и ролята на човешките глутатион S-трансферази. Chem. Рез. Токсикол. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Джелани, Р.; Джаханбахш, С.; Кохан-Гадр, HR; Такур, М.; Хан, С.; Aldhaheri, SR; Янг, З.; Андреана, П.; Морис, Р.; Abu-Soud, HM Mesna (2-меркаптоетан натриев сулфонат) функционира като регулатор на миелопероксидазата. Свободен Радик. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Алнахди, А.; Джон, А.; Raza, H. N-ацетил цистеинът отслабва оксидативния стрес и глутатион-зависимия редокс дисбаланс, причинен от лечение с висока глюкоза/високо съдържание на палмитинова киселина в Rin-5F клетки на панкреаса. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Джан, Л.; Pagano, JS IRF-7, нов регулаторен фактор на интерферона, свързан с латентността на вируса Epstein-Barr. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Вируси и лимфоми. Н. англ. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Ромио-Мурез, Р.; Солис, М.; Nardin, A.; Goubau, D.; Барон-Бодо, В.; Лин, Р.; Маси, Б.; Салседо, М.; Hiscott, J. Различни роли на IFN регулаторния фактор (IRF)-3 и IRF-7 в активирането на антитуморните свойства на човешките макрофаги. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Нинг, С.; Пагано, JS; Barber, GN IRF7: Активиране, регулиране, модификация и функция. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Чен, PG; Гуан, YJ; Zha, GM; Дзяо, XQ; Zhu, HS; Джан, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 отслабва възпалителните реакции чрез TLR4 сигнален път. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Стаут-Делгадо, HW; Янг, X.; Уокър, WE; Тесар, BM; Goldstein, DR Стареенето уврежда регулирането на IFN регулаторния фактор 7 в плазмоцитоидните дендритни клетки по време на активиране на TLR9. J. Immunol. Рез. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]