Добавката на желязо забавя стареенето и удължава живота на клетките чрез потенциране на митохондриалната функция Ⅱ
Mar 23, 2023
3.2. Добавката с желязо повишава устойчивостта на оксидативен стрес
Клетъчното стареене е свързано сповишен оксидативен стрескойто уврежда биологичните системи и смекчава заболяванията, свързани с възрастта [34]. Тъй като добавките с желязо забавиха стареенето, ние проучихме ефекта му върхуоксидативен стрес. Използвахмеоксидативен стресиндукторно съединение, водороден прекис (H2O2), за тестване на окислителната устойчивост на клетките. Клетките първо се отглеждат в присъствието на желязо до етап на стационарна фаза (72 часа) в SD среда. След това клетките се промиват и инкубират с различни концентрации на H2O2 в YPD среда и расте в продължение на 24 часа.Окислителноустойчивостта на стрес беше анализирана чрез сравняване на клетъчния растеж на третираните с H2O2- клетки с нетретираната контрола. Открихме, че клетките, допълнени с желязо, са устойчиви на оксидативен стрес в сравнение с контролата (фигури2а и S3). За да се потвърди, че добавките с желязо осигуряват устойчивост на оксидативен стрес, BPS беше добавен към желязото и клетъчния растеж с H2O2 беше анализиран. Добавянето на BPS намалява устойчивостта на оксидативен стрес на клетките с добавка на желязо (Фигура2б). Тези резултати корелират с ролята на добавките с желязо за забавяне на стареенето и удължаване на живота на клетките.
3.3. Добавката с желязо потенцира митохондриалните функции
Митохондриите са основният клетъчен център за използване и метаболизъм на желязото [35–38]. Намаляването на митохондриалните функции е свързано със стареенето [39–43]. Желязото служи като кофактор на няколко митохондриални протеини, включително клъстери желязо-сяра и протеини, съдържащи хем [44–46]. Тези желязосъдържащи протеини участват в цикъла на митохондриалната трикарбоксилна киселина (TCA) и веригата за транспортиране на електрони (ETC) (Фигура 3а). Изследвахме дали увеличаването на продължителността на клетъчния живот чрез добавяне на желязо изисква митохондриални функции. За да тестваме това, ние анализирахме експресията на гените на митохондриалния TCA цикъл. Ние открихме, че добавката на желязо значително индуцира експресията на няколко гена на TCA цикъла (Фигури 3b и S4a). Метаболитите от цикъла на ТСА - кетоглутарат и оксалоацетат могат да произведат глутамат и аспартат чрез катаплеротични реакции в митохондриите (Фигура 3а). Тези аминокиселини се използват в биосинтезата на протеини, липиди и нуклеотиди [47–49]. Интересно е, че експресията на биосинтетични гени на глутамат (GDH1 и GDH3) и аспартат (AAT1 и AAT2) е намалена в клетки с добавка на желязо (Фигура 3с). Този профил на изразяване предполага, че добавянето на желязо насърчава запазването вместо консумацията на междинни продукти от цикъла на TCA. В съгласие с тази идея, генната експресия на гените на митохондриалния анаплеротичен път (PYC1, PYC2 и GDH2) беше значително увеличена в клетки с добавка на желязо (Фигура 3в). PYC1 и PYC2 кодират пируват карбоксилаза, която превръща пирувата в оксалоацетат. GDH2 кодира глутамат дехидрогеназа, която синтезира -кетоглутарат от глутамат. Заедно тези резултати предполагат, че добавките с желязо конфигурират клетките в метаболитно състояние, което благоприятства анаплерозата и предотвратява катаплерозата, за да стимулира метаболитите на цикъла на TCA.
Фигура 3.Добавката на желязо подобрява митохондриалните функции. (a) Преглед на митохондриитеTCA (трикарбоксилна киселина) цикъл и ETC (електронно транспортна верига) с основните катаплеротични иилюстрирани са анаплеротични реакции. (b) Щамът на прототрофните дрожди се инкубира със 100 ulµM FeSO4 и се отглеждат в SD среда за 8 часа при 30°С◦C. РНК се екстрахира от културите иекспресията на посочените гени на ТСА цикъла се анализира чрез количествена RT-PCR. (c) Изразяванеанализ на катаплеротични гени (GDH1, GDH3, AAT1,иAAT2) и анаплеротични гени (PYC1, PYC2,иGDH2) се извършва чрез количествена RT-PCR. (d) Експресионният анализ на ETC гените е направен отколичествена RT-PCR. Статистическа значимост (*p < 0.05) was determined by Student's t-тест.
Реакциите на цикъла на TCA генерират NADH и FADH2 които се окисляват от ETC комплекси I и II и са необходими за функционирането на TCA цикъла (Фигура3а). Макар чеS. cerevisiaeлипсва комплекс I, редуциращите еквиваленти се прехвърлят към дихателната верига чрез NADH дехидрогенази. Сукцинат дехидрогеназата играе централна роля и участва както в TCA цикъла, така и в ETC комплекс II (Фигура3а). Поразително е, че експресията на сукцинат дехидрогеназа (SDH1иSDH2) беше силно регулиран нагоре сред всички анализирани гени на TCA цикъл (Фигура3б, г). Тези резултати показват, че цикълът на TCA продължава към ETC, вместо да натрупва определен междинен продукт. По същия начин, експресията на всички други гени на ETC комплекси беше силно регулирана нагоре в клетки с добавка на желязо (Фигура3д). ETC се свързва с генерирането на реактивни кислородни видове (ROS), които регулират експресията наSOD2ген [50]. Той кодира манган-супероксид дисмутаза (MnSOD), която е основният чистач на митохондриалния супероксид.SOD2генната експресия се регулира нагоре в клетки с добавка на желязо (допълнителна фигура S4a), което е в съответствие с експресията на ETC гени. Допълнително анализирахме потенциала на митохондриалната мембрана (MMP), който се генерира от протонните помпи на ETC комплекси I, III и IV. Открихме, че добавянето на желязо повишава ММР на клетките (допълнителна фигура S4b). След това изследвахме структурата на митохондриите с помощта на флуоресцентна микроскопия. Открихме, че добавянето на желязо предотвратява фрагментирането на митохондриите (допълнителна фигура S4c). Като цяло тези резултати показват, че добавките с желязо потенцират митохондриалните функции на клетките.
3.4. Добавката на желязо повишава нивото на АТФ, необходимо за удължаване на клетъчния живот
Реакциите на митохондриалния TCA цикъл произвеждат редуциращи еквиваленти NADH и FADH2, които прехвърлят електрони към ETC и генерират аденозин трифосфат (ATP) чрез окислително фосфорилиране (OXPHOS) (Фигура3а). Тъй като експресията на TCA цикъла и ETC гените бяха подобрени от добавки с желязо, тествахме ефекта му върху синтеза на АТФ. В съгласие с профила на експресия на митохондриалния TCA цикъл, експресията на ETC ген и нивата на ATP са високи в клетките с добавка на желязо (Фигура4а). След това попитахме дали е необходим АТФ за удължаване на живота на клетките, допълнени с желязо. Ние инхибирахме синтеза на АТФ и измерихме CLS на дрождите. Антимицин А (AMA) е инхибитор на синтеза на АТФ, който се свързва с комплекс III и блокира трансфера на електрони в митохондриалния ETC [51]. Първо изследвахме нивото на АТФ и открихме, че лечението с AMA инхибира синтеза на АТФ (Фигура4б). Допълнително тествахме ефекта на AMA върху клетъчния живот на клетките с добавка на желязо. Дрождените клетки се инкубират с желязо и AMA в SD среда. Растежът на клетките достига насищане след 24 часа (допълнителна фигура S5). Впоследствие измерихме преживяемостта и открихме, че лечението с AMA инхибира медиираното от добавянето на желязо удължаване на живота (Фигура4° С). Заедно тези открития разкриват, че добавките с желязо повишават нивото на АТФ, което е необходимо за удължаване на живота на клетките. Ние също така наблюдавахме, че продължителността на живота на третираните с AMA клетки е по-ниска от контролата (Фигура4c), допълнително потвърждавайки, че неспособността да се синтезира АТФ компрометира продължителността на живота.
3.5. Добавката на желязо предотвратява ускореното стареене на AMPK Knockout Mutant
AMPK е главният регулатор на клетъчната енергийна хомеостаза [20,21]. Силно запазеният човешки аналог на AMPK в дрождиS. cerevisiaeе протеинът Snf1 [52]. AMPK активира функциите на митохондриите за производство на АТФ при условия на ограничена енергия. Скорошни доклади показват, че намаляването на митохондриалните функции с възрастта се случва отчасти чрез нарушената активност на AMPK в различни стари организми [53,54]. По този начин липсата на активност на AMPK засяга митохондриалните функции и компрометира множество клетъчни функции, включително метаболизъм, устойчивост на стрес и клетъчно оцеляване, които са най-критичните детерминанти на стареенето и продължителността на живота. В съответствие с предишни проучвания, ниеустанови, чеsnf1нокаут мутацията компрометира нивото на АТФ, устойчивостта на оксидативен стрес и продължителността на живота (Фигура5a–c).
Фигура 5.Добавянето на желязо спасява ускореното стареене на AMPK нокаут мутанта. Theдрожден прототрофен див тип и AMPK нокаут мутант (snf1∆) щамовете се отглеждат до стационарнифаза в SD среда за 72 часа при 30°С◦C. (a) ATP анализ на див тип иsnf1∆ щамове. (b) Окислителстрес анализ на див тип иsnf1∆ щамове с различни H2O2 концентрации. (c) Хронологиченанализ на продължителността на живота (CLS) на див тип иsnf1∆ щамове. (d) ATP анализ на див тип иsnf1∆ щамовеинкубирани с различни концентрации на FeSO4. (e) Анализ на окислителния стрес на див тип иsnf1∆ щамове, инкубирани с различни концентрации на FeSO4. (f) CLS анализ на див тип иsnf1∆ щамове, инкубирани с различни концентрации на FeSO4. Статистическа значимост (*p < 0.05) was determinedот Student'st-тест.
Тъй катоsnf1мутант е дефектен в митохондриалните функции, тествахме дали добавките с желязо могат да спасят фенотипите на ускорено стареене. Затова добавихме желязото къмsnf1мутант и анализира нивото на АТФ, оксидативния стрес и продължителността на живота. Установихме, че добавките с желязо повишават нивото на АТФ, устойчивостта на оксидативен стрес и продължителността на живота (Фигура5d–f). Като цяло тези открития потвърждават, че добавките с желязо забавят стареенето и удължават живота на клетките чрез увеличаване на функциите на митохондриите.
4. Дискусия
Хранителните вещества определят функционалното състояние на клетките и дефицитът на основни хранителни вещества компрометира човешкото здраве [55,56]. Освен това, хранителните вещества са основните регулатори на клетъчния метаболизъм, който контролира няколко биологични процеса, включителностареене, основен рисков фактор от няколкохронични болести. Спад вметаболитна активносте един от отличителните белези настареене [10]. Скорошни изследвания върху различни организми, включително бозайници, показаха, че забавянето на стареенето и увеличаването на продължителността на здравето е възможно чрез интервенции против стареене, включително прилагане на лекарства рапамицин и метформин [11,16]. Тези лекарства са насочени към чувствителните към хранителни вещества комплекси TORC1 и AMPK, които са важни метаболитни регулатори на клетките [11,16].
Желязото е основно хранително вещество, което участва в няколко важни метаболитни реакции в клетките [23–26]. Дефицитът на желязо уврежда метаболитната активност, което води до компрометирани клетъчни функции, което води до много заболявания, включително анемия, когнитивно увреждане и загуба намускулна сила [26,57–59]. Дефицитът на желязо е широко разпространен сред възрастните хораПо-голямо или равно на65 години [60–62].
Тъй като желязото регулира метаболитните процеси, ние изследвахме ролята му при стареенето. Използвахме дрожди като модел на организъм, за да изследваме ролята на желязото в хронологичното стареене. Изследвахме ефекта от добавянето на желязо върху CLS на дрождите. Установихме, че както FeSO4 и FeCl3 увеличи продължителността на живота на клетките. Използвайки различни соли на сулфат, хлорид и хелатор на желязо, ние потвърдихме, че продължителността на живота на клетката се удължава от желязото. Стареенето е свързано с постепенно натрупване на оксидативен стрес, който е вреден за клетъчните функции и намалява клетъчното оцеляване [34]. Тъй като открихме, че добавките с желязо забавят стареенето, тествахме дали може да осигури устойчивост на оксидативен стрес. За да изследваме фенотипа на оксидативния стрес, ние третирахме клетките с окислителния индуктор H2O2 и измерва клетъчното оцеляване. Установихме, че добавките с желязо повишават устойчивостта на оксидативен стрес в сравнение с контролата. Тези открития корелират с ролята на добавките с желязо за удължаване на живота.
Допълнително разкрихме механизма против стареене на добавките с желязо. Митохондриите са основните клетъчни потребители на усвояване и метаболизъм на желязо [35–38]. Първо анализирахме експресията на гените на митохондриалния TCA цикъл. Ние открихме, че експресията на почти всички гени от цикъла на TCA се регулира нагоре чрез добавяне на желязо. Важно е, че добавките с желязо регулират надолу експресията на митохондриална анаплероза и повишават регулацията на катаплеротичните метаболитни гени. Тези резултати разкриват, че добавянето на желязо подобрява синтеза на междинни продукти от цикъла на TCA и предотвратява тяхното клетъчно използване. Тези констатации подкрепят антистареещата активност на добавките с желязо, тъй като редовният износ на междинни продукти от цикъла на TCA засяга митохондриалната цялост [47]. Освен това, попълването на митохондриалния въглероден пул е от съществено значение за поддържане на митохондриалните функции, необходими за оцеляване по време на клетъчното стареене.
Междинният цикъл на TCA - доказано е, че кетоглутаратът удължава живота на различни организми [63]. Ние обаче открихме, че добавките с желязо повишават експресията на -кетоглутарат дехидрогеназа (KGD1иKGD2), който преобразува - кетоглутарат за образуване на сукцинил-КоА. Освен това, ние наблюдавахме, че експресията на гени на сукцинат дехидрогеназа (SDH1иSDH2) беше силно регулиран нагоре сред другите тествани гени на цикъла на TCA. Важно е, че сукцинат дехидрогеназата участва както в TCA цикъла, така и в ETC комплекс II. Тези резултати предполагат, че вместо натрупване на конкретен междинен продукт от цикъла на TCA, активността против стареене на добавките с желязо може да включва ETC пътя.
Тъй като TCA цикълът е функционално свързан с ETC, ние анализирахме експресията на ETC гени. Открихме, че добавките с желязо силно регулират експресията на ETC гени. TCA цикъл продукти NADH и FADH2 се окисляват от ETC комплекси и генерират ATP чрез OXPHOS. Открихме, че добавянето на желязо повишава нивото на клетъчния АТФ, което е свързано с регулирането на TCA цикъла и ETC гените. След това изяснихме дали повишаването на нивото на АТФ чрез добавяне на желязо е необходимо за удължаване на клетъчния живот. Открихме, че удължаването на живота чрез добавяне на желязо е премахнато чрез инхибиране на синтеза на АТФ. По този начин тези открития предполагат, че добавянето на желязо повишава нивото на АТФ, което е необходимо за удължаване на клетъчния живот. Нашите резултати са в съответствие с предишните доклади, показващи ролята на АТФ в продължителността на клетъчния живот [51,64,65]. Освен това използвахме добавки с желязо, за да подобрим митохондриалните функции и спасихме краткия живот и чувствителния към оксидативен стрес фенотип на AMPK мутанта. Като цяло тези резултати разкриха, че добавките с желязо потенцират митохондриалните функции, които забавят стареенето и увеличават продължителността на живота на клетките.
Скорошни проучвания показват, че добавките с желязо възстановяват митохондриалния дефект на мутанти с увредена лизозома и предотвратяват митохондриалния спад по време на стареене [66,67]. По този начин нашите резултати подкрепят предишните открития, че добавките с желязо подобряват митохондриалните функции. Интересното е, че едно от по-ранните проучвания показва, че добавките с желязо спасяват ускореното репликативно стареене на мутанти с нарушена лизозома; както и да еефектът върху клетките от див тип не е включен в доклада [67]. Независимо от това, нашите резултати са свързани с предишни констатации и въпреки различните модели на стареене (хронологично стареене), открихме, че добавките с желязо забавят стареенето и увеличават продължителността на клетъчния живот. По този начин, взети заедно, нашите резултати и предишни доклади ясно показват, че добавките с желязо могат да бъдат потенциално терапевтично средство за насочване към стареенето и увеличаване на продължителността на здравето.
Допълнителни материали:Фигура S1: Растеж и хронологичен анализ на продължителността на живота на дрождени клетки с добавка на желязо; Фигура S2: Анализ на растежа на различни дрождеви клетки, съдържащи желязо, сулфат и хлорид; Фигура S3: Анализ на устойчивост на окислителен стрес на клетки от дрожди, добавени с желязо. Фигура S4: Експресия на митохондриален ген, мембранен потенциал и анализ на структурата на дрождени клетки с добавка на желязо; Фигура S5: Анализ на растежа на дрождеви клетки, добавени с желязо и антимицин А; Таблица S1: Списък на праймерите, използвани за RT-PCR в това изследване.
Авторски принос:JLJ: Методология, формален анализ, разследване и преглед; TCYN: Методология, официален анализ, разследване и преглед; FN: валидиране, формален анализ и преглед; FE: Рецензиране, редактиране и надзор; MA: Концептуализация, обработка на данни, методология, писане, преглед, редактиране и надзор. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.
Финансиране:Тази работа беше подкрепена от Института по биоинформатика (BII), Фонда за развитие на кариерата A*STAR (C210112008) и безвъзмездната помощ за наградите Global Healthy Longevity Catalyst (MOH-000758-00).
Благодарности:Благодарим на Maurer-Stroh Sebastian, Lee Hwee Kuan, Loo Lit Hsin, Chiam Keng Hwee и Prakash Arumugam за подкрепата на това изследване.
Конфликти на интереси:Авторите декларират липса на конкуриращи се финансови и нефинансови интереси.
Препратки
1. Блум, Делавер; Канинг, Д.; Любет, А. Глобалното застаряване на населението: факти, предизвикателства, решения и перспективи.Чал. Разтвор. Перспектива. Дедал2015, 144, 80–92.
2. Отдел по икономически и социални въпроси на ООН, отдел „Население“.Перспективи за световното население за 2019 г; Акценти (ST/ESA/SERA/423); ООН: Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ, 2019 г.
3. Робин, Дж.Застаряващо население: живеем по-дълго, но по-здрави ли сме?Организацията на обединените нации, Департамент по икономика и социални въпроси, Отдел Население: Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ, 2021 г.; UN DESA/POP/2021/TP/NO.
4. Николи, Т.; Партридж, Л. Стареенето като рисков фактор за заболяване.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [CrossRef] [PubMed]
5. Hou, Y.; Дан, X.; Бабар, М.; Wei, Y.; Hasselbalch, SG; Croteau, DL; Bohr, VA Стареенето като рисков фактор за невродегенеративно заболяване.Нац. Rev. Neurol.2019, 15, 565–581. [CrossRef] [PubMed]
6. Харман, Д. Процесът на стареене: основен рисков фактор за заболяване и смърт.Proc. Natl. акад. Sci. САЩ1991, 88, 5360–5363. [CrossRef] [PubMed]
7. Партридж, Л.; Deelen, J.; Slagboom, PE Изправен пред глобалните предизвикателства на застаряването.Природата2018, 561, 45–56. [CrossRef] [PubMed] 8. Фонтана, Л.; Кенеди,
BK; Лонго, VD; Сийлс, Д.; Мелов, С. Медицински изследвания: Лечение на стареенето.Природата2014, 511, 405–407. [CrossRef] [PubMed]
9. Фонтана, Л.; Партридж, Л.; Longo, VD Удължаване на здравословния живот - от дрожди до хора.Наука2010, 328, 321–326. [CrossRef] [PubMed]
10. López-Otín, C.; Blasco, MA; Партридж, Л.; Серано, М.; Kroemer, G. Отличителните белези на стареенето.клетка2013, 153, 1194–1217. [CrossRef]
11. Партридж, Л.; Фуентеалба, М.; Кенеди, Б. К. Стремежът да се забави стареенето чрез откриване на лекарства.Нац. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [CrossRef]
12. Цимерман, А.; Хофер, С.; Pendl, T.; Кайнц, К.; Направен от.; Carmona-Gutierrez, D. Дрожди като инструмент за идентифициране на съединения против стареене.FEMS Yeast Res.2018, 18, foy020. [CrossRef]
13. Kaeberlein, M.; Burtner, CR; Kennedy, BK Последни разработки в стареенето на дрожди.PLoS Genet.2007, 3, e84. [CrossRef]
14. Лонго, В.Д.; Шадел, GS; Kaeberlein, M.; Кенеди, Б. Репликативно и хронологично стареене вSaccharomyces cerevisiae. Cell Metab.2012, 16, 18–31. [CrossRef] 15. Лонго, В.Д.; Fabrizio, P. Хронологично стареене в Saccharomyces cerevisiae.Стареене Res. мая2011, 57, 101–121. [CrossRef]
16. Кулкарни, А.С.; Gubbi, S.; Barzilai, N. Ползи от метформин за намаляване на отличителните белези на стареенето.Cell Metab.2020, 32, 15–30. [CrossRef]
17. Алфата, М.; Wong, JH; Кришнан, VG; Лий, YC; Sin, QF; Го, CJH; Конг, KW; Лий, WT; Люис, Дж.; Хун, С.; и др. TORC1 регулира транскрипционния отговор към глюкозата и цикъла на развитие чрез пътя Tap42-Sit4-Rrd1/2 в Saccharomyces cerevisiae.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [CrossRef]
18. Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR сигнализиране при растеж, метаболизъм и заболяване.клетка2017, 168, 960–976. [CrossRef]
