ISG15-зависимото активиране на сензора MDA5 е антагонизирано от SARS-CoV-2 папаиноподобната протеаза, за да избегне вродения имунитет на гостоприемника
Nov 08, 2023
Активирането на RIG-I-подобните рецептори, ретинолова киселина индуцируем ген I (RIG-I) и протеин 5, свързан с диференциация на меланома (MDA5) установява антивирусно състояние чрез регулиране на интерферон (IFN)-стимулирани гени (ISG). Сред тях е ISG15, чиито механични роли във вродения имунитет все още остават загадъчни. В настоящото проучване ние съобщаваме, че конюгацията на ISG15 е от съществено значение за антивирусните IFN отговори, медиирани от вирусния РНК сензор MDA5. ISGилирането на домените за активиране и набиране на каспаза на MDA5 насърчава неговата олигомеризация и по този начин предизвиква активиране на вродения имунитет срещу редица вируси, включително коронавируси, флавивируси и пикорнавируси. Зависимото от ISG15-активиране на MDA5 се антагонизира чрез директно де-ISGилиране, медиирано от папаиноподобната протеаза на SARS-CoV-2, наскоро появил се коронавирус, причинил пандемията от COVID-19 . Нашата работа демонстрира решаваща роля на ISG15 в медиирания от MDA{20}}антивирусен отговор и също така идентифицира ключов механизъм за избягване на имунитета на SARS-CoV-2, който може да бъде насочен към разработването на нови антивирусни средства и ваксини за борба с COVID-19.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Вирусното смущение на имунната хомеостаза на гостоприемника се наблюдава от вродената имунна система, която разчита на рецептори, които усещат молекулярни модели, свързани с опасност или патоген (PAMP) 1–3. RIG-I-подобните рецептори (RLRs) RIG-I и MDA5 са основни за откриване на вирус чрез изследване на цитоплазмата за вирусни или получени от гостоприемника имуностимулиращи РНК4. Свързването на РНК към С-терминалния домен (CTD) и хеликазата на RIG-I и MDA5 води до тяхната сигнализираща конформация, която позволява набирането на няколко ензима5. Тези ензими модифицират RLRs в множество домейни и сайтове, а пост-транслационните модификации (PTMs) са особено добре проучени за домейните за активиране и набиране на каспаза (CARDs), сигналните модули. Протеин фосфатаза 1 (PP1) / дефосфорилира RIG-I и MDA5 CARDs6. В случая на RIG-I, дефосфорилирането насърчава Lys63-свързаното полиубиквитиниране на CARDs от TRIM25 (тристранен мотив, съдържащ 25) и други E3 лигази7,8, което стабилизира олигомерната форма на RIG-I, като по този начин позволява митохондриално антивирусно -свързване на сигнализиращ протеин (MAVS). В сравнение с тези на RIG-I, отделните стъпки на активиране на MDA5 и включените критични PTM са по-малко разбрани. Активирането на RLR индуцира производството на тип I и III IFNs, които от своя страна разпространяват антивирусно сигнализиране чрез регулиране на ISGs9,10. Сред тях е ISG15, подобен на убиквитин протеин, който може да бъде ковалентно конюгиран с лизинови остатъци на целеви протеини, PTM процес, наречен ISGylation11. Въпреки че е широко признато, че конюгацията на ISG15 действа антивирусно12, механизмите на ISGилиране на протеина на гостоприемника, които биха могли да обяснят широката антивирусна рестрикционна активност на ISG15, в момента не са известни. Причинителят на продължаващата пандемия от COVID-19, тежкият остър респираторен синдром коронавирус 2 (SCoV2), принадлежи към семейство Coronaviridae, което съдържа няколко други човешки патогени. Коронавирусите имат изключителна способност да потискат медиираните от IFN антивирусни отговори, а ниското производство на IFN при SCoV2-инфектирани пациенти корелира с тежко заболяване13. Сред коронавирусните антагонисти на IFN е папаиноподобната протеаза (PLpro), която има деубиквитинираща и де-ISGилираща активност14,15. В настоящото проучване ние идентифицираме съществена роля за ISGylation в активирането на MDA5. Освен това показваме, че SCoV2 PLpro взаимодейства с MDA5 и антагонизира ISG15-зависимото MDA5 активиране чрез активно де-ISGилиране, разкривайки, че SCoV2 вече е еволюирал, за да избегне имунното наблюдение от MDA5.
Резултати
MDA5, но не и RIG-I, сигнализирането изисква ISG15.
За да идентифицираме PTM на MDA5 CARDs, които могат да регулират активирането на MDA5, ние подложихме афинитетно пречистен MDA5–2CARD, слят с глутатион-S-трансфераза (GST–MDA5–2CARD), или GST самостоятелно, на течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (LC –MS/MS) и установи, че по-специално GST–MDA5–2CARD се пречиства съвместно с ISG15, което изглежда като две ленти, които мигрират по-бавно (с ~15 и 30 kDa) от немодифицирания GST–MDA5–2CARD (разширени данни Фиг. 1а). Имуноблотингът (IB) потвърди, че GST–MDA5–2CARD е модифициран от ISG15 (разширени данни, фиг. 1b). След това определихме уместността на ISG15 за сигнализиране, предизвикано от MDA5-. Докато експресията на FLAG-MDA5 в миши ембрионални фибробласти (MEFs) от див тип (WT) индуцира IFN-информационна РНК и протеин, както и Ccl5 транскрипти по дозозависим начин, експресията на FLAG-MDA5 в Isg15−/− MEFs доведе до аблация експресия на антивирусен ген и протеин (Фиг. 1а и Разширени данни Фиг. 1с). По подобен начин индукцията на антивирусен ген чрез силно намалена в ISG15 нокаутирани (KO) HeLa (човешки) клетки в сравнение с WT контролни клетки (Фиг. 1b и Разширени данни Фиг. 1d), изключвайки специфичен за вида ефект. Обратно, FLAG–RIG-I индуцира сравними количества секретиран IFN-протеин, както и Ifnb1 и Ccl5 транскрипти в Isg15−/− и WT MEFs (Фиг. 1а и Разширени данни Фиг. 1с). Транскриптите на IFNB1 и CCL5, както и производството на IFN-протеин от FLAG–RIG-I са сходни или леко повишени в ISG15 KO HeLa клетки в сравнение с WT клетки (фиг. 1b и разширени данни, фиг. 1d), в съответствие с предишни доклади, че ISGylation отрицателно въздейства на RIG-I сигнализация16,17
Фиг. 1|ISGylation се изисква за MDA5, но не и RIG-I, сигнализиране. a, b, ELISA на IFN- от супернатанти на MEFs (WT или Isg15−/−) (a) и HeLa клетки (WT или ISG15 KO) (b), временно трансфектирани с увеличаващи се количества FLAG-маркирани MDA5 или RIG-I за 40 ч. Цели клетъчни лизати (WCLs) бяха изследвани от IB с анти-ISG15, анти-FLAG и анти-актин (контрол на натоварването). c, ELISA на IFN- от супернатанти на WT или Isg15−/− MEFs, които са били фалшиво стимулирани или трансфектирани с EMCV РНК (0.1 или 0.4 µg ml−1), HMW-поли (I: C) (0.5 µg ml−1 ) или RABVLe (1 pmol ml−1 ), или инфектирани с SeV (10 хемаглутинационни единици (HAU) ml−1 ) за 24 ч. d, RT-qPCR анализ на Ifnb1, Ccl5 и Tnf иРНК в WT и Isg15−/− MEFs, стимулирани както в c. e, IRF3 фосфорилиране в WCLs на NHLFs, които са били трансфектирани с посочените siPHKs за 30 часа и след това фалшиво стимулирани или трансфектирани с EMCV РНК (0,4 µg ml-1) или RABVLe (1 pmol ml-1) за 6 часа, оценено от IB с анти-pSer396-IRF3 и анти-IRF3. f, ELISA на IFN- от супернатанти на NHLF, които са били трансфектирани с посочените siPHK за 30 часа и след това симулирано стимулирани или трансфектирани с EMCV РНК (0,4 µg ml-1) или RABVLe (1 pmol ml-1), или инфектирани с SeV (10 HAU ml-1) за 16 часа. g, ELISA на IFN- от супернатантите на PBMCs, които са трансдуцирани в продължение на 40 часа с посочените shRNA лентивирусни частици и след това са заразени с mutEMCV (MOI=10) или SeV (200 HAU ml-1) в продължение на 8 часа. h, RT-qPCR анализ на IFNA2 и IL-6 mRNA в PBMCs, които са трансдуцирани и инфектирани, както в g. Данните представляват най-малко два независими експеримента с подобни резултати (средно ± sd от n= 3 биологични повторения в a–d и f и средно от n= 2 биологични повторения в g и h). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
След това тествахме ефекта от делецията на ген ISG15 върху активирането на ендогенни MDA5 и RIG-I от съответните им лиганди. Производство на IFN, както и генна експресия на IFNB1, CCL5 и TNF, индуцирана от трансфекция на РНК на вируса на енцефаломиокардит (EMCV) или поли(I:C) с високо молекулно тегло (HMW), като и двете се усещат предимно от MDA5, бяха дълбоко атенюирани в Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa и ISG15 KO HAP-1 клетки в сравнение с техните съответни контролни клетки (Фиг. 1c, d и Разширени данни Фиг. 1e–g). Важно е, че премахването на антивирусната генна индукция от EMCV РНК или HMW-poly(I: C) в ISG15 KO клетки не се дължи на анулирана MDA5 генна експресия; напротив, експресията на MDA5 mRNA беше повишена в ISG15 KO клетки в сравнение с WT клетки (разширени данни Фиг. 1f, g). За разлика от стимулирането с MDA5 агонисти, стимулирането на Isg15−/− MEFs и ISG15 KO HeLa клетки чрез трансфекция на водеща РНК на вируса на бяс (RABVLe) или инфекция с вируса Sendai (SeV), които са RIG-I стимули, доведе до производство на IFN и антивирусна генна експресия, сравнима с WT клетки (фиг. 1c, d и разширени данни, фиг. 1e). За да изключим потенциални клонални ефекти, които биха могли да бъдат свързани с клетки с изтрити ген ISG15, ние проведохме експерименти за преходно заглушаване на гени в първични нормални човешки белодробни фибробласти (NHLF). Заглушаването на ISG15, подобно на нокдауна на MDA5, доведе до почти пълна загуба на фосфорилиране на IFN-регулаторен фактор 3 (IRF3) – отличителен белег на активирането на RLR-сигнала – след стимулиране с EMCV РНК, но не и RABVLe изолирано производство на IFN, както и експресия на антивирусен транскрипт в NHLFs, трансфектирани с EMCV РНК, но не и в клетки, стимулирани с RABVLe или SeV (фиг. 1f и разширени данни, фиг. 1h). Медиирано от малка фибичка (sh)RNA заглушаване на ISG15 или MDA5 в първични човешки периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCs) също значително намалява експресията на антивирусен протеин и транскрипт след инфекция с рекомбинантен мутантен EMCV (mutEMCV) с дефицит на MDA5 антагонизъм18,19, в сравнение с инфектирани PBMCs, трансдуцирани с ненасочена контролна shRNA (фиг. 1g,h и разширени данни, фиг. 1i). Обратно, изчерпването на ISG15 или MDA5 не повлиява цитокиновите отговори в PBMCs след SeV инфекция (фиг. 1g, h и разширени данни, фиг. 1i). Тези резултати показват, че ISG15 е от съществено значение за имунното сигнализиране от MDA5, но не и от RIG-I. MDA5 CARDs са ISGилирани при Lys23 и Lys43.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
За да потвърдим нашия MS анализ, който идентифицира MDA5–2CARD ISGylation, първо тествахме дали ендогенният MDA5 също е модифициран от ISG15. Ендогенният MDA5 е силно ISGилиран в клетки, трансфектирани с HMW-poly(I:C), или инфектирани с вируси на денга (DENV) или Zika (ZIKV), които се усещат от MDA5 (реф. 5) (Фигура 2а). Трябва да се отбележи, че ендогенният MDA5 също е ISGилиран в неинфектирани клетки, макар и на много ниски нива (Разширени данни Фиг. 2а), което е в съответствие с предишни открития, че много протеини на гостоприемника също са ISGилирани на ниски нива в нормални (неинфектирани) условия20. В клетки, третирани с анти-IFNAR2 за блокиране на IFNAR-сигнално-медиирана регулация на ISG, заглушаването на ISG15 или MDA5 доведе до сравнимо намаляване на експресията на IFNB1 ген след mutEMCV инфекция (разширени данни Фиг. 2b), което показва, че ISG15-зависим Сигнализирането на MDA5 възниква дори при липса на сигнализиране на IFNAR.
t MDA5Δ2CARD (съдържащ хеликаза и CTD), е основното място на MDA5 ISGylation, показващо две видни ленти за ISGylated 2CARD (фиг. 2b). Възстановяване на ISG15 KO HeLa клетки или с WT ISG15, или с неконюгируем ISG15 мутант, в който двата глицина, необходими за конюгиране, са заменени с аланин (ISG15-AA)21, демонстрира ковалентна ISG15 конюгация (фиг. 2c) . Мутация на индивидуални лизинови остатъци в GST–MDA5–2CARD до аргинин разкрива, че мутацията на единично място на Lys23 и Lys43 значително намалява ISGylation (разширени данни, фиг. 2c), докато тяхната комбинирана мутация (Lys23Arg/Lys43Arg) почти премахва ISGylation (фиг. 2d). ). FLAG–MDA5 с пълна дължина Lys23Arg/Lys43Arg също показа значително намалено ISGylation (фиг. 2e и разширени данни, фиг. 2d); остатъчното ISGилиране, наблюдавано при FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, вероятно се дължи на допълнителни второстепенни места в 2CARD и/или Δ2CARD. Трябва да се отбележи, че мутацията Lys23Arg/Lys43Arg не повлиява MDA5–2CARD SUMOylation5 (разширени данни Фиг. 2e). Освен това, докато RIG-I–2CARD беше силно убиквитиниран (което представлява ковалентно Lys63-свързано убиквитиниране7), нито MDA5–2CARD WT, нито Lys23Arg/Lys43Arg мутантът показаха откриваеми нива на убиквитиниране (Разширени данни Фиг. 2f). Взети заедно, тези резултати показват, че MDA5 CARD се подлагат на ISGylation на две основни места, Lys23 и Lys43.
За активиране на MDA5 е необходимо CARD ISGylation.
При сравняване на тяхната способност за предаване на сигнал, MDA5–2CARD Lys23Arg и Lys43Arg мутанти с едно място показват частично намалено активиране на IFN-промотор в сравнение с WT MDA5–2CARD, докато мутантът Lys23Arg/Lys43Arg има дълбоко намалена сигнална активност, която е почти толкова силна като този на сигнално-дефектните мутанти Ser88Glu и Ser88Asp6 (Разширени данни Фиг. 2g). За разлика от това, мутант, в който Lys68, който е лизиновият остатък, който е най-близък до Lys43 и Lys23, е заместен с аргинин (Lys68Arg), показва сравнима ISG15 конюгация и сигнална компетентност с WT 2CARD (Разширени данни Фиг. 2c, g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, за разлика от WT MDA5–2CARD, също не успя да индуцира димеризация на IRF3 (разширени данни Фиг. 2h). FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg или Lys23Arg/Lys43Arg също показаха намалени или почти премахнати способности за активиране на IFN-промотор, в сравнение с FLAG–MDA5 WT (фиг. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg показа дълбок сигнален дефект дори когато се експресира във високи количества, докато WT MDA5 индуцира антивирусни транскрипти по дозозависим начин (фиг. 2g). Съгласно STAT1 фосфорилирането, отличителен белег на IFNAR сигнализирането, както и експресията на ISG протеин са силно индуцирани от MDA5 WT, но не и от Lys23Arg/Lys43Arg (фиг. 2h). Допълването на MDA5-генно редактирани човешки астроцити (SVGAs) с MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg или Ser88Glu доведе до силно намалени IFNB1, CCL5 и ISG транскрипти в сравнение с клетки, експресиращи WT MDA5 (Фиг. 2i и Разширени данни Фиг. 2i) . Тези резултати показват, че ISGилирането при Lys23 и Lys43 е от съществено значение за MDA5-медиирани цитокинови отговори.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Дефосфорилирането от РР1 регулира MDA5 ISGилирането.
Подобно на RIG-I, MDA5 се фосфорилира в CARDs в неинфектирани клетки, което предотвратява автоактивирането; дефосфорилирането на RIG-I и MDA5 от PP1 / е от решаващо значение за отприщването на RLRs от техните сигнално-потиснати състояния 6, 22–24. Дефосфорилирането на RIG-I позволява Lys63-свързано убиквитиниране на CARDs, което насърчава мултимеризацията и сигнализирането на RIG-I5. Подробностите за това как дефосфорилирането на CARD (при Ser88) задейства активирането на MDA5 остават неуловими и затова тествахме дали дефосфорилирането регулира MDA5 ISGylation. Заглушаване на PP1 / силно намалено MDA5–2CARD ISGилиране (разширени данни Фиг. 3a). Освен това, фосфомиметичните Ser88Glu и Ser88Asp мутанти са намалили ISGylation, докато фосфон-нулевият Ser88Ala мутант показва по-силно ISGylation от WT MDA5–2CARD (Разширени данни Фиг. 3b). Обратно, MDA5 WT и Lys23Arg/Lys43Arg имат сравнимо Ser88 фосфорилиране (разширени данни Фиг. 3c). Заедно тези данни предполагат, че дефосфорилирането на MDA5 при Ser88 предхожда CARD ISGилирането. След това използвахме V протеина на вируса на морбили (MeV-V), който антагонизира дефосфорилирането на MDA5 Ser88 чрез PP1 / антагонизъм25. Експресията на MeV-V засилва фосфорилирането на Ser88 (показателно за аблирано дефосфорилиране) на GST-MDA5-2CARD или FLAG-MDA5 по дозозависим начин, както беше показано по-рано . Подобреното фосфорилиране чрез MeV-V корелира с намаляване на ISGилирането (разширени данни Фиг. 3d,e). За разлика от WT MeV-V, мутантният MeV-V, който е премахнал PP1-свързването и MDA5-дефосфорилиращия антагонизъм (MeV-VΔtail)25, показва малък ефект върху MDA5–2CARD ISGylation (Разширени данни Фиг. 3f), засилване на инхибирането на ISGylation, което се дължи основно на инхибиране на PP1, а не на други антагонистични ефекти, от MeV-V. V протеините от вирусите Nipah и Hendra (NiV-V и HeV-V) също повишават фосфорилирането на MDA5 Ser88 и, съответно, потискат MDA5 ISGилирането (разширени данни Фиг. 3g,h), което предполага, че няколко парамиксовирусни V протеина инхибират MDA5 ISGилирането чрез манипулация на Ser88 фосфорилиране, въпреки че точните механизми за отделните V протеини остават да бъдат определени. Взети заедно, тези данни предполагат, че MDA5 CARD ISGилирането зависи от дефосфорилирането при Ser88.
ISGylation насърчава MDA5 сглобки от по-висок порядък.
RLR активирането изисква РНК свързване, RLR олигомеризация и тяхното преместване от цитозола към митохондриите за взаимодействие с MAVS5. За да изясним механизма, чрез който ISGylation влияе върху активността на MDA5, първо проучихме дали ISGylation засяга свързването на РНК. Ендогенният MDA5, пречистен от WT или Isg15-/- MEFs, взаимодейства еднакво добре с HMW-poly(I: C) in vitro (Разширени данни Фиг. 4а). MDA5 WT и Lys23Arg/Lys43Arg показаха сравнимо свързване с HMW-poly(I: C), което показва, че ISGylation не повлиява РНК-свързващата способност на MDA5 (Разширени данни Фиг. 4b). Когато наблюдавахме транслокацията на MDA5 от цитозола към митохондриите след EMCV РНК стимулация, открихме, че заглушаването на ISG15, но не така. C трансфекцията, премахна транслокацията на MDA5 (фиг. 3а). Обратно, транслокацията на RIG-I след трансфекцията на RABVLe е ефективна както при ISG15-изчерпана, така и при si. С-трансфектирани клетки (фиг. 3b). Тези данни показват, че ISGylation регулира транслокацията на MDA5 или стъпка преди нея. Тъй като транслокацията на MDA5 от цитозол към митохондрии изисква взаимодействие с 14-3-3η26, ние сравнихме 14-3-3η свързването на WT и мутантния MDA5. Способността на MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg да свързва 14-3-3η е подобна на тази на WT MDA5 или мутанта Lys68Arg (разширени данни Фиг. 4с). Въпреки това, докато стимулирането на EMCV РНК ефективно индуцира MDA5 олигомеризация в WT MEFs, образуването на MDA5 олигомери е премахнато в ISG15-дефицитни MEFs (фиг. 3c). Нокдаунът на ISG15 в 293T клетки също премахва олигомеризацията на FLAG-MDA5-2CARD (фиг. 3d). Обратно, ко-експресията на компонентите на машината за ISGylation, Ube1L и UbcH8, силно засилва олигомеризацията на MDA5–2CARD в si. С-трансфектирани клетки, но не и в ISG15-изчерпани клетки (фиг. 3d), което показва, че ISGилирането е необходимо за образуването на MDA5 олигомер. В подкрепа на тази концепция, FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg показа почти премахната олигомеризация, докато WT MDA5 олигомеризира ефективно (фиг. 3е). Ние също така сравнихме ефекта на мутацията Lys23 Arg/Lys43Arg с този на разрушаващи олигомеризацията мутации, които се локализират или към интерфейса между MDA5 мономерите и възпрепятстват РНК-свързващата медиирана MDA5 филаментация (Ile841Arg/Glu842Arg и Asp848Ala/Phe849Ala) 27, 28, или към CARDs (Gly74Ala/Trp75Ala) и нарушават 2CARD олигомеризацията27. За разлика от WT MDA5, мутантът Lys23Arg/Lys43Arg, подобен на MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, показа недостатъчна олигомеризация и, в съответствие с това, премахна способността за активиране на IFN-промотор (фиг. 3f, g). Въвеждането на Lys23Arg/Lys43Arg в фона на Ile841Arg/Glu842Arg или Asp848Ala/Phe849Ala, всеки от които сам по себе си намалява MDA5 олигомеризацията и сигнализирането, също премахва образуването на MDA5 олигомер и IFN-индукцията (фиг. 3f,g). Тъй като LGP2 улеснява нуклеацията на MDA5 върху двойноверижна РНК и по този начин олигомеризацията на MDA5 29, 30, ние сравнихме свързването на LGP2 на MDA5 WT и Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg взаимодейства с LGP2 толкова ефективно, колкото WT MDA5 (разширени данни Фиг. 4d), укрепвайки предложението, че CARD ISGylation насърчава олигомеризацията на MDA5 независимо от РНК-свързващата медиирана филаментация. Взети заедно, тези резултати установяват, че ISGylation улеснява CARD олигомеризацията и MDA5 сглобките от по-висок ред.
Фиг. 2|Активирането на MDA5 изисква ISGylation при Lys23 и Lys43. ендогенно MDA5 ISGилиране в NHLF, които са били фиктивно третирани, трансфектирани с HMW-poly(I: C) (0.1 µg ml-1 ) за 40 часа (вляво) или инфектирани с DENV или ZIKV (MOI {{ 10}} за всеки) за 48 часа (вдясно), определено чрез IP с анти-MDA5 (или IgG изотипна контрола) и IB с анти-ISG15. b, ISGилиране на FLAG-маркирани MDA5–2CARD и MDA5Δ2CARD в временно трансфектирани HEK293T клетки, които също експресират V5–ISG15, HA–Ube1L и FLAG–UbcH8, оценени от FLAG PD и IB с анти-V5 на 40 h след трансфекцията. c, Ендогенно MDA5 ISGилиране в ISG15 KO HeLa клетки, стабилно възстановени с вектор, WT ISG15 или ISG15-AA и ко-трансфектирани с HA–Ube1L и FLAG–UbcH8 след лечение с IFN (1,000 U ml-1) за 24 часа, определено чрез IP с анти-MDA5 и IB с анти-ISG15. d, ISGилиране на GST–MDA5–2CARD WT и Lys23Arg/Lys43Arg в HEK293T клетки, които са ко-трансфектирани с V5–ISG15, HA–Ube1L и FLAG–UbcH8 за 24 часа, определени от GST PD и IB с анти-V5. e, ISGилиране на FLAG–MDA5 WT и Lys23Arg/Lys43Arg в HEK293T клетки, които са ко-трансфектирани с V5–ISG15, HA–Ube1L и FLAG–UbcH8, определени от FLAG PD и IB с анти-V5. f, IFN-луциферазна репортерна активност в HEK293T клетки, които са трансфектирани в продължение на 40 часа с вектор, FLAG-MDA5 WT или мутанти. Стойностите на луциферазата са представени като кратна индукция по отношение на стойностите за векторно-трансфектирани клетки, зададени на 1. WCL се изследват от IB с анти-FLAG и анти-актин. g, RT-qPCR анализ на IFNB1 и CCL5 mRNA в HEK293T клетки, които са били временно трансфектирани с вектор или нарастващи количества FLAG-MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg. h, STAT1 фосфорилиране и изобилие на ISG (IFIT1 и -2) протеин в WCLs на HEK293T клетки, които са били временно трансфектирани с вектор или FLAG-MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, определени от IB. I, RT-qPCR анализ на посочените антивирусни гени в MDA5 KO SVGAs, които бяха временно възстановени или с празен вектор, или с FLAG-маркиран MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg или Ser88Glu. Данните представляват най-малко два независими експеримента с подобни резултати (средно ± sd от n= 3 биологични повторения във f, g и i). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Фиг. 3|CARD ISGylation насърчава образуването на MDA5 сглобки от по-висок порядък. a,b, цитозолно-митохондриално фракциониране на WCLs от NHLFs, които са били трансфектирани в продължение на 30 h с ненасочена контролна siRNA (si. C) или ISG15-специфична siRNA (si.ISG15), и след това фалшиво третирани или трансфектирани с EMCV РНК (0.4 µg ml-1 ) (a) или RABVLe (1 pmol ml-1) (b) за 16 часа. IB се извършва с анти-MDA5 (a), анти-RIG-I (b), анти-ISG15 и анти-актин (a и b). -Тубулин и MAVS служат като маркери за чистота съответно за цитозолната и митохондриалната фракция (а и b). c, Ендогенна олигомеризация на MDA5 в WT и Isg15-/- MEFs, които са трансфектирани с EMCV РНК (0.5 µg ml-1) за 16 часа и оценени чрез SDD-AGE и IB с анти-MDA5. WCL бяха допълнително анализирани чрез SDS-PAGE и изследвани от IB с анти-MDA5 и анти-актин. d, Олигомеризация на FLAG–MDA5–2CARD в HEK293T клетки, които са трансфектирани с посочените siRNAs, със или без HA–Ube1L и FLAG–UbcH8 за 48 часа, определени от NativePAGE и IB с анти-FLAG. WCL бяха допълнително анализирани чрез SDS-PAGE и изследвани от IB с анти-FLAG, анти-HA, анти-ISG15 и анти-актин. e, Олигомеризация на FLAG–MDA5 WT и Lys23Arg/Lys43Arg в временно трансфектирани MDA5 KO HEK293 клетки, оценени чрез SDD–AGE и IB с анти-FLAG. WCL бяха допълнително анализирани чрез SDS-PAGE и IB с анти-FLAG и анти-актин. f, Олигомеризация на FLAG-маркиран MDA5 WT и мутанти в временно трансфектирани MDA5 KO HEK293 клетки, оценени от NativePAGE и IB с анти-MDA5. WCL бяха допълнително анализирани чрез SDS-PAGE и изследвани от IB с анти-MDA5 и анти-актин. g, IFN-луциферазна репортерна активност в MDA5 KO HEK293 клетки, които бяха трансфектирани в продължение на 24 часа или с празен вектор, или с FLAG-маркиран MDA5 WT или мутанти. Луциферазната активност е представена като кратна индукция по отношение на стойностите за векторно-трансфектирани клетки, зададени на 1. Данните представляват поне два независими експеримента с подобни резултати (средно ± sd от n= 3 биологични повторения в g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Зависещото от ISGилиране MDA5 сигнализиране ограничава репликацията на вируса.
След това оценихме дали ISGylation на MDA5 е необходимо за способността му да ограничава репликацията на вируса. FLAG–MDA5 WT, но не и Lys23Arg/Lys43Arg, мощно (с ~ 2log) инхибира репликацията на EMCV (фиг. 4а). По подобен начин, MDA5 KO HEK293 клетки, възстановени с WT MDA5, но не и клетки, допълнени с Lys23Arg/Lys43Arg мутант, ефективно ограничават DENV репликацията (Фиг. 4b). Ние също възстановихме MDA5 KO астроцитни SVGAs, физиологично релевантен клетъчен тип за ZIKV инфекция, с вектор, или MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, и след това оценихме ZIKV репликацията в продължение на 40-h времеви курс. Репликацията на ZIKV беше атенюирана с ~100-кратно в клетки, възстановени с WT MDA5, в сравнение с клетки, експресиращи вектор. Обратно, клетките, допълнени с MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, не ограничават ZIKV, подобно на клетките, експресиращи MDA5 Ser88Glu (фиг. 4с). WT MDA5, но не и Lys23Arg/Lys43Arg, също ограничава репликацията на SCoV2, макар и в по-малка степен от тази, наблюдавана при другите тествани вируси (фиг. 4d).
Фиг. 4|ISGилирането е необходимо за вирусна рестрикция от MDA5. EMCV титри в супернатанта на HEK293T клетки, които са трансфектирани за 40 h с вектор, или FLAG–MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, и след това инфектирани с EMCV (MOI=0.001) за 24 h, определено чрез TCID50 анализ. b, Процент на DENV-инфектирани MDA5 KO HEK293 клетки, които са били трансфектирани за 24 часа с вектор, или FLAG–MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, и след това фалшиво третирани или заразени с DENV (MOI=5) за 48 часа , оценен от FACS с помощта на анти-флавивирус Е (4G2). SSC, страничен скатер. c, ZIKV титри в супернатанта на MDA5 KO SVGAs, които са трансфектирани за 30 часа с вектор или FLAG-маркиран MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg или Ser88Glu и след това инфектирани с ZIKV (MOI=0.1) за посочените времена , определено чрез анализ на плака. pfu, образуващи плака единици; hpi, часове след заразяването. d, SCoV2 титри в супернатантата на HEK293T–hACE2 клетки, които са трансфектирани за 24 часа или с празен вектор, или FLAG–MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, и след това заразени със SCoV2 (MOI=0.5) за 24 h, определено чрез анализ на плака. e, Схема на експерименталния подход за „отделяне“ на ролята на ISG15 в MDA5-медиираната индукция на IFN от ролята му в потискането на IFNAR сигнализирането. Sup., супернатант. f, NHLF „донорни“ клетки бяха трансфектирани в продължение на 40 часа с посочените siPHK и след това инфектирани с mutEMCV (MOI=0.1) в продължение на 16 часа. Клетъчните супернатанти бяха UV-инактивирани и прехвърлени върху Vero "реципиентни" клетки. След 24 часа клетките бяха заразени с ZIKV (MOI=0.002–2) за 72 часа и ZIKV-позитивните клетки бяха определени чрез имунооцветяване с анти-флавивирус Е (4G2) и TrueBlue пероксидазен субстрат. g, RIG-I KO HEK293 "донорни" клетки бяха трансфектирани със si. C или si.ISG15 заедно с вектор или FLAG–MDA5 WT или Lys23Arg/Lys43Arg, за 24 часа, последвано от EMCV инфекция (MOI=0.001) за 16 часа. UV-инактивираните клетъчни супернатанти се прехвърлят върху Vero „реципиентни“ клетки за 24 часа, последвано от инфекция с EMCV (MOI=0.001–0.1) за 40 часа. Индуцираните от EMCV цитопатични ефекти се визуализират чрез оцветяване с Coomassie Blue. Данните представляват поне два независими експеримента с подобни резултати (средно ± sd от n= 3 биологични повторения в a–d). *П< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
След това определихме ефекта от заглушаването на ISG15 върху способността на MDA5 да инхибира репликацията на вируса. Въпреки че MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg не успя да потисне репликацията на EMCV независимо от заглушаването на ISG15, WT MDA5 ефективно ограничи репликацията на EMCV в si. С-трансфектирани клетки и, неочаквано, също и в ISG15-изчерпани клетки (разширени данни Фиг. 5а). При изследване на основния механизъм на тези неочаквани резултати открихме, че EMCV-инфектираните клетки, които експресират WT MDA5, имат значително повишени нива на експресия на ISG протеин, когато ISG15 е заглушен в сравнение със заразени клетки, трансфектирани с WT MDA5 и si. C (Разширени данни Фиг. 5b). По подобен начин, повишен ISG транскрипт и експресия на протеин са наблюдавани в ISG15-дефицитни клетки, които са били трансфектирани с EMCV РНК или инфектирани с mutEMCV, въпреки отмяната на IFN-индукцията (Разширени данни Фиг. 5c,d). За разлика от това, нокдаунът на MDA5 анулира както IFN-, така и ISG протеиновата експресия, както се очакваше (разширени данни Фиг. 5d). Забелязахме, че протеиновото изобилие на USP18, деубиквитиниращ ензим, който негативно регулира IFNAR сигнализирането31, е значително намалено в ISG15-изчерпаните клетки след EMCV инфекция в сравнение със заразените клетки, които са били трансфектирани със si. C или MDA5-специфична siRNA (разширени данни Фиг. 5b,d), което е в съответствие с докладваната роля на ISG15 за предотвратяване на разграждането на USP1832. Заедно тези данни предполагат, че в експериментални настройки на насочване на ISG15-ген (т.е. заглушаване или KO) антивирусният ефект на MDA5 ISGylation е маскиран от аберантна ISG регулация поради премахването на инхибиторния ефект на ISG15 върху IFNAR сигнализирането.
Фиг. 5|SCoV2 PLpro се свързва с и де-ISGилира MDA5–2CARD. Лентово представяне на кристалната структура на SCoV2 PLpro: ISG15 комплекс (Protein Data Bank, номер на достъп 6YVA). Показани са ключови остатъци, които медиират взаимодействието на място 1 (Asn156 и Arg166/Glu167) или взаимодействието на място 2 (Phe69) в PLpro, както и неговото каталитично активно място (Cys111). b, ISGилиране на GST–MDA5–2CARD в HEK293T клетки, които са котрансфектирани за 20 часа с вектор или V5-маркиран SCoV2 PLpro WT или мутанти, заедно с FLAG–ISG15, HA–Ube1L и FLAG–UbcH8, определен от GST PD и IB с анти-FLAG и анти-GST. WCL бяха изследвани от IB с анти-V5, анти-НА, анти-FLAG и анти-актин. c, Свързване на HA-маркиран MDA5 или RIG-I към V5-маркиран SCoV2– PLpro или FLAG-маркиран MeV-V (положителна контрола) в временно трансфектирани HEK293T клетки, определено от HA PD и IB с анти-V5 или анти-FLAG и анти-НА. WCL бяха изследвани от IB с анти-V5 и анти-FLAG. d, Олигомеризация на FLAG–MDA5–2CARD в HEK293T клетки, които са били котрансфектирани с вектор или V5-маркирани SCoV2 PLpro WT или Cys111Ala за 24 часа, оценени от NativePAGE и IB с анти-FLAG. WCL бяха допълнително анализирани чрез SDS-PAGE и изследвани от IB с анти-FLAG, анти-V5 и анти-актин. e, ISGилиране на GST–MDA5–2CARD в HEK293T клетки, които също експресират FLAG–ISG15, HA–Ube1L и FLAG–UbcH8 и са котрансфектирани за 40 часа с вектор или посочения V5-маркиран коронавирусен PLpro протеини, определени чрез GST PD и IB с анти-FLAG, анти-V5 и анти-GST. Данните представляват поне два независими експеримента с подобни резултати.
След това използвахме анализ за защита от вируси, който експериментално разделя сигнализирането на MDA5 в инфектирани с вирус клетки от сигнализирането на IFNAR надолу по веригата в същите клетки (фиг. 4е). Супернатанти от инфектирани с mutEMCV „донорни“ клетки, които са били или si. С трансфектирани или изчерпани или от ISG15, или от MDA5, бяха ултравиолетови (UV) инактивирани и след това прехвърлени към неинфектирани клетки „реципиент“. „Праймираните“ реципиентни клетки след това бяха заразени със ZIKV за директно проследяване на антивирусния ефект на MDA5-медиираното производство на IFN от донорни клетки. Докато супернатантите от si. С-трансфектирани „донорни“ клетки мощно инхибират ZIKV репликацията, а супернатантите от ISG15 или MDA5 нокдаун клетки минимално ограничават ZIKV инфекцията (фиг. 4f). По подобен начин, супернатантите на културата от EMCV-инфектирани донорни клетки, трансфектирани с WT MDA5 заедно със si. C доведе до по-голяма защита на реципиентните клетки от вирусното предизвикателство, отколкото от клетките, експресиращи WT MDA5 и изчерпани от ISG15 (фиг. 4g). Взети заедно, тези данни показват, че ISGилирането е важно за MDA5-медиираната рестрикция на редица РНК вируси.
Фиг. 6|SCoV2 PLpro инхибира медиираното от ISG15- MDA5 сигнализиране чрез неговата де-ISGylase активност. a, RT-qPCR анализ на IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 и RIG-I транскрипти в NHLF, които са трансфектирани с посочените siPHK за 40 h и след това трансфектирани с макет РНК или SCoV2 РНК (0,4 µg ml -1 ) за 24 часа. b, Свързване на SCoV2 Nsp3 към ендогенен MDA5 в A549–hACE2 клетки, които са били инфектирани с SCoV2 (MOI=0.5) за 24 часа, определено чрез IP с анти-MDA5 (или контрола на IgG изотип), последвано от IB с анти-Nsp3 и анти-MDA5. WCL бяха изследвани от IB с анти-Nsp3 и анти-актин. c, Ендогенно MDA5 ISGилиране в A549–hACE2 клетки, които са били фалшиво инфектирани или инфектирани с SCoV2 (MOI=0.5) в продължение на 40 часа в присъствието на PLpro инхибитор (GRL-0617; 50 µM) или носител контрола (диметилсулфоксид), определена чрез IP с анти-MDA5 (или IgG изотипна контрола), последвано от IB с анти-ISG15 и анти-MDA5. Изобилието на протеини на IFIT1, RSAD2, ISG15 и актин в WCLs беше изследвано от IB. Ефективната вирусна репликация беше потвърдена от IB с анти-Nsp3 и анти-Spike (S). d, RT–qPCR анализ на IFNB1, CCL5 и IFIT1 транскрипти и EMCV геномна РНК (gRNA), в HeLa клетки, които са били временно трансфектирани за 24 часа с вектор или V5–SCoV2 PLpro WT или мутанти и след това са заразени с mutEMCV (MOI=0.5) за 12 часа. e, EMCV титри в супернатантата на RIG-I KO HEK293 клетки, които са били временно трансфектирани за 24 часа с вектор или FLAG–MDA5, заедно с V5-маркиран SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala или Arg166Ser/Glu167Arg, и след това инфектирани с EMCV (MOI=0.001) за 16 часа, определено чрез анализ на плака. f, Изобилие на протеин на посочените ISG в WCL от експеримента в e, определено от IB с посочените антитела. Данните представляват поне два независими експеримента с подобни резултати (средно ± sd от n= 3 биологични повторения в a, d и e). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro е насочен към MDA5 за де-ISGилиране.
Коронавируси като SARS-CoV (SCoV), MERS–CoV и наскоро появилият се SCoV2 кодират PLpro, който медиира разцепването на вирусен полипротеин33. В допълнение, PLpro има деубиквитиниращи и де-ISGилиращи дейности. Наскоро беше показано, че SCoV2 PLpro модулира антивирусните отговори предимно чрез своята де-ISGylase активност15. Тъй като е известно, че MDA5 е основен сензор за откриване на коронавируси34,35, и тъй като нашите данни показват, че ISGylation е необходима за MDA5-медиирана вирусна рестрикция, ние проучихме дали SCoV2 PLpro ензимно премахва MDA5 ISGylation, за да антагонизира вродения имунитет. SCoV2 PLpro WT, но не и неговият каталитично неактивен мутант (PLpro Cys111Ala)15, премахна ISGилирането на GST–MDA5–2CARD и FLAG–MDA5 (Фиг. 5a, b и Разширени данни Фиг. 6a). Мутантите PLpro Asn156Glu и Arg166Ser/Glu167Arg, които са незначително и силно увредени в свързването на ISG15 в интерфейса на „сайт 1“, съответно 14, 36, повлияха леко или не повлияха ISGylation. За разлика от това, PLpro Phe69Ala, в който интерфейсът „сайт 2“, който преференциално определя свързването с убиквитин, но не и ISG15, е нарушен14,36, намалява MDA5 ISGylation толкова мощно, колкото WT PLpro (фиг. 5a, b и разширени данни, фиг. 6a ). SCoV2 PLpro обаче не потиска убиквитинирането на RIG-I–2CARD (разширени данни Фиг. 6b). Ние открихме, че PLpro взаимодейства специфично с MDA5, но не и с RIG-I, както направи MeV-V, който свързва MDA5 и служи като контрола37 (фиг. 5c). Ниски количества PLpro инхибират сигнализирането от MDA5, но не и RIG-I, докато по-високите количества PLpro потискат антивирусното сигнализиране от двата RLRs (разширени данни Фиг. 6c). Това укрепва MDA5 като директна цел на PLpro. Де-ISGилирането на IRF3 вероятно обяснява инхибиторния ефект, който по-високите дози PLpro имат върху RLR сигнализирането 15,38. При изследване на ефекта на PLpro върху олигомеризацията на MDA5–2CARD, PLpro WT, но не и Cys111Ala, ефективно блокира олигомеризацията на MDA5–2CARD (фиг. 5d), което показва, че SCoV2 PLpro инхибира образуването на зависим от ISGилиране MDA5 олигомер чрез неговата ензимна активност. Ензимите PLpro на свързаните -коронавируси, SCoV, MERS–CoV и вируса на миши хепатит (MHV), както и на -коронавируса HCoV-NL63 (NL63) също се свързват и ефективно намаляват MDA5–2CARD ISGylation (фиг. 5e) , което предполага, че антагонизмът на MDA5 от PLpro може да бъде широко запазен сред коронавирусите.
растение цистанче, повишаващо имунната система
SCoV2 PLpro антагонизира ISG15-зависимото MDA5 сигнализиране.
След това определихме уместността на зависимата от ISG15- MDA5 сигнализация за индукция на антивирусни цитокини, предизвикана от SCoV2. Тъй като е известно, че инфекцията с SCoV2 минимално индуцира IFN от тип I поради ефективни вирусни антагонизми39, ние изолирахме обща РНК от заразени с SCoV2- клетки и след това я трансфектирахме повторно в клетки, за да стимулираме вроденото имунно сигнализиране. SCoV2 РНК, но не РНК от фалшиво третирани клетки, силно индуцирани IFN транскрипти; обаче, тази индукция беше значително намалена, когато ISG15 или MDA5 бяха заглушени (фиг. 6а). Нокдаунът на RIG-I не повлиява неблагоприятно експресията на антивирусен ген, предизвикана от SCoV2 РНК, което показва, че SCoV2 РНК-PAMPs се усещат предимно от оста ISG15-MDA5 (фиг. 6а).
Ние открихме, че SCoV2 неструктурният протеин 3 (Nsp3), в който се намира PLpro, лесно взаимодейства с ендогенния MDA5 по време на автентична SCoV2 инфекция (фиг. 6b). Ендогенното MDA5 ISGилиране беше неоткриваемо в SCoV2-инфектирани клетки, въпреки че вирусът задейства експресията на ISG15; въпреки това, в заразени клетки, третирани със специфичен PLpro инхибитор15, MDA5 ISGилиране и индуциране на ISG надолу по веригата са силно засилени (Фиг. 6c), подкрепяйки предложението, че PLpro ефективно потиска MDA5 ISGилирането и сигнализирането по време на жива SCoV2 инфекция. След това изследвахме ефекта на WT и мутантния PLpro върху активирането на ендогенен MDA5 по време на mutEMCV инфекция. В съответствие с техния ефект върху MDA5 ISGylation (фиг. 5b и разширени данни, фиг. 6a), SCoV2 PLpro WT и Phe69Ala предотвратяват индукцията на антивирусен транскрипт, докато MDA5 Arg166Ser/ Glu167Arg, подобно на мутанта Cys111Ala, не повлиява експресията на антивирусен ген (фиг. 6г). В съгласие с това, репликацията на mutEMCV се засилва в клетки, експресиращи PLpro WT или Phe69Ala, но не и в клетки, експресиращи PLpro Cys111Ala или Arg166Ser/Glu167Arg (фиг. 6d). По същия начин, WT PLpro, но не и мутантът Arg166Ser/Glu167Arg или Cys111Ala, блокира EMCV ограничението от FLAG-MDA5 (фиг. 6e); ефектът върху репликацията на вируса корелира с индуцирани ISG протеини (фиг. 6f). Взети заедно, това установява SCoV2 PLpro като IFN антагонист, който активно де-ISGилира MDA5.
Дискусия
Известно е, че конюгацията с ISG15 придава антивирусна активност на множество вируси; обаче са идентифицирани само няколко истински субстрата12. От друга страна, ISG15 в своята неконюгирана форма действа провирусно чрез укрепване на USP18-медиираното инхибиране на IFNAR-сигнала31,32,40. Настоящото проучване идентифицира ключова роля за ISGylation в MDA5-медиирана IFN индукция. Нашата работа също така подчертава важността на експерименталния дизайн, при който отделянето на ролята на ISG15 в активирането на MDA5 от тази в потискането на IFNAR сигнализирането е от съществено значение за разкриване на мощната антивирусна активност на ISG15. В заразен организъм вероятно сумата от множество събития на ISGylation (засягащи както протеините на гостоприемника, така и вирусните) определя резултата от инфекцията и патогенезата, което може да зависи от контекста12.
Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система
Нашите открития показват, че ISGилирането на MDA5 действа аналогично на Lys63-свързаното убиквитиниране на RIG-I5: и двата PTMs (1) се регулират от PP1-индуцирано дефосфорилиране и (2) насърчават CARD олигомеризацията и RLR по-високи -поръчкови монтажи. Въпреки това, докато убиквитинът е изобилен както в неинфектираните, така и в инфектираните клетки, експресията на ISG15 е силно повишена чрез IFN стимулация. Независимо от това, дори на базални нива, ISG15 е конюгиран с много протеини на гостоприемника20, включително MDA5, както показа нашата работа, което може да е достатъчно за първоначално активиране на MDA5. По време на вирусни инфекции, които се усещат от множество PRRs, MDA5 ISGylation може да бъде механизъм за „зареждане“, чрез който регулирането на ISG15 нагоре от непосредствен вроден сензор (например RIG-I)41 задейства MDA5, за да влезе в режим на „kick-start“. Тъй като ISG15 регулира отрицателно RIG-I16,17, ISGylation може да задейства „превключване на сензора“, където активирането на MDA5 се насърчава, когато нивата на ISG15 се повишат, докато активността на RIG-I се потиска. Ние идентифицирахме, че SCoV2 PLpro антагонизира MDA5 ISGylation чрез неговата ензимна активност след свързване със сензора; тази стратегия вероятно е запазена сред коронавирусите, което налага допълнително разследване. Анализите с криоелектронна микроскопия разкриха, че коронавирусният Nsp3 е част от комплекс от пори, който обхваща двумембранни везикули, получени от ендоплазмен ретикулум, и изнася новосинтезирана вирусна РНК42. По този начин, MDA5 може да се позиционира в непосредствена близост до мястото на износ на вирусна РНК, за да улесни откриването на PAMP; обаче PLpro домейнът на Nsp3 (който е от цитоплазмената страна) блокира сигнализирането на MDA5 чрез директно де-ISGилиране. Някои вируси могат също така да инхибират MDA5 ISGилирането чрез дисрегулация на MDA5 фосфорилирането, както е показано за MeV-V. В обобщение, нашето проучване разкрива важна роля на ISGylation в активирането на MDA5-медиирания имунитет, както и неговото инхибиране от SCoV2, разкривайки потенциална молекулярна цел за проектиране на терапевтични средства срещу COVID-19.
Препратки
1. Liu, G. & Gack, MU Различни и оркестрирани функции на РНК сензори при вродени. Имунитет 53, 26–42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Вродено имунно усещане и сигнализиране на цитозолни нуклеинови киселини. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I и други РНК сензори в антивирусния имунитет. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).
4. Schlee, M. Главни сензори на патогенни РНК-RIG-I подобни рецептори. Имунобиология 218, 1322–1335 (2013).
5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-подобни рецептори: тяхното регулиране и роли в РНК усещането. Нац. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).
6. Wies, E. et al. Дефосфорилирането на РНК сензорите RIG-I и MDA5 от фосфатазата РР1 е от съществено значение за вроденото имунно сигнализиране. Имунитет 38, 437–449 (2013).
7. Gack, MU et al. TRIM25 RING-finger E3 убиквитин лигаза е от съществено значение за RIG-I-медиирана антивирусна активност. Nature 446, 916–920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Посттранслационен контрол на вътреклетъчните патогенни сензорни пътища. Тенденции Immunol. 38, 39–52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Споделени и различни функции на интерферони тип I и тип III. Имунитет 50, 907–923 (2019).
10. Schoggins, JW Интерферон-стимулирани гени: какво правят всички те? Annu. Вирол. 6, 567–584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE Интерферон-стимулиран ген 15 и системата за ISGилиране на протеин. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 в антивирусния имунитет и извън него. Нац. Rev. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Нарушена активност на интерферон тип I и възпалителни реакции при тежки пациенти с COVID-19. Science 369, 718–724 (2020).
14. Klemm, T. et al. Механизъм и инхибиране на папаиноподобната протеаза, PLpro, на SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Шин, Д. и др. Папаиноподобната протеаза регулира разпространението на вируса на SARS-CoV-2 и вродения имунитет. Nature 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Регулиране на отрицателна обратна връзка на RIG-I-медиирано антивирусно сигнализиране чрез индуцирано от интерферон ISG15 конюгиране. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).
17. Du, Y. et al. LRRC25 инхибира тип I IFN сигнализиране чрез насочване към ISG15-свързан RIG-I за автофагично разграждане. EMBO J. 37, 351–366 (2018).
18. Hato, SV и др. Водещият протеин на менговируса блокира генната транскрипция на интерферон-алфа/бета и инхибира активирането на регулаторния фактор 3 на интерферона. Cell Microbiol. 9, 2921–2930 (2007).
19. Deddouche, S. et al. Идентифициране на LGP2-свързан MDA5 агонист в инфектирани с пикорнавирус клетки. eLife 3, e01535 (2014).
20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Системата за конюгиране на ISG15 широко е насочена към новосинтезирани протеини: последици за антивирусната функция на ISG15. Mol. Клетка 38, 722–732 (2010).
21. Lenschow, DJ и др. Идентифициране на интерферон-стимулиран ген 15 като антивирусна молекула по време на инфекция с вируса Sindbis in vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Отрицателна регулация, медиирана от фосфорилиране на антивирусната активност на RIG-I. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. et al. Отрицателна роля на фосфорилирането на RIG-I серин 8 в регулирането на производството на интерферон-бета. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Конвенционалната протеин киназа С-алфа (PKC-алфа) и PKC-бета регулират негативно RIG-I антивирусната сигнална трансдукция. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).
25. Davis, ME et al. Антагонизмът на фосфатазата РР1 от V протеина на вируса на морбили е необходим за вродено имунно освобождаване на MDA5. Микроб клетъчен гостоприемник 16, 19–30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone protein насърчава антивирусния вроден имунитет чрез улесняване на олигомеризацията на MDA5 и вътреклетъчното преразпределение. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. et al. Структурна основа за разпознаване на dsRNA, образуване на нишки и активиране на антивирусен сигнал от MDA5. Клетка 152, 276–289 (2013).
28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM структури на MDA5-dsRNA филаменти на различни етапи на хидролиза на ATP. Mol. Клетка 72, 999–1012 (2018).
29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Вроденият имунен сензор LGP2 активира антивирусно сигнализиране чрез регулиране на взаимодействието MDA5-RNA и сглобяването на нишките. Mol. Клетка 55, 771–781 (2014).
30. Uchikawa, E. et al. Структурен анализ на свързването на dsRNA с антивирусни рецептори за разпознаване на образи LGP2 и MDA5. Mol. Клетка 62, 586–602 (2016).
31. Малахова, OA и др. UBP43 е нов регулатор на интерфероновото сигнализиране, независимо от неговата ISG15 изопептидазна активност. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).
32. Zhang, X. et al. Човешкият вътреклетъчен ISG15 предотвратява свръхамплификацията на интерферон-алфа/бета и автовъзпалението. Nature 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH et al. Идентифициране на коронавирусни репликазни продукти на тежък остър респираторен синдром и характеризиране на папаиноподобна протеазна активност. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).
34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Вирусът на миши коронавирусен хепатит се разпознава от MDA5 и индуцира тип I интерферон в мозъчните макрофаги/микроглия. J. Virol. 82, 9829–9838 (2008).
35. Menachery, VD и др. Атенюация и възстановяване на коронавирусен мутант на тежък остър респираторен синдром без 2′-O-метилтрансферазна активност. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).
36. Bekes, M. et al. Разпознаване на Lys48-свързани ди-убиквитин и деубиквитиниращи активности на SARS коронавирусна папаиноподобна протеаза. Mol. Клетка 62, 572–585 (2016).
37. Childs, K. et al. mda-5, но не и RIG-I, е обичайна цел за парамиксовирусни V протеини. Вирусология 359, 190–200 (2007).
38. Shi, HX et al. Положителна регулация на активиране на регулаторен фактор 3 на интерферон от Herc5 чрез модификация на ISG15. Mol. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. et al. Небалансираният отговор на гостоприемника към SARS-CoV-2 стимулира развитието на COVID-19. Клетка 181, 1036–1045 (2020).
40. Speer, SD и др. Дефицит на ISG15 и повишена вирусна резистентност при хора, но не и при мишки. Нац. Общ. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Основните, ненужни роли на RIG-I и MDA5 при откриване и контролиране на инфекция с вируса на Западен Нил. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).
42. Wolf, G. et al. Молекулярна пора обхваща двойната мембрана на органела за репликация на коронавирус. Наука 369, 1395–1398 (2020).
43. Майор, EO и др. Създаване на линия от човешки фетални глиални клетки, която поддържа размножаването на JC вируса. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 82, 1257–1261 (1985).
44. Hertzog, J. et al. Инфекцията с бразилски изолат на вируса Zika генерира RIG-I стимулираща РНК и вирусният NS5 протеин блокира индукцията и сигнализирането на IFN тип I. Евро. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).
45. Cerikan, B. et al. Клетъчно присъща адаптация, произтичаща от хронична аблация на ключов rho GTPase регулатор. Dev. Клетка 39, 28–43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU Фосфомиметичен механизъм на вируса на денга за антагонизиране на вродения имунитет. Нац. Immunol. 17, 523–530 (2016).
47. Riedl, W. et al. Вирусът Zika NS3 имитира клетъчен 14-3-3-свързващ мотив, за да антагонизира RIG-I- и MDA5-медиирания вроден имунитет. Клетъчен гостоприемник микроб 26, 493–503 (2019).
48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 повсеместно разграждане и разграждане от вируса на паротит потиска цитокинова и онкогенна сигнализация. J. Virol. 77, 6385–6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. et al. HERC6 е основната E3 лигаза за глобално ISG15 конюгиране в миши клетки. PLoS ONE 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK et al. Изчерпателна, гъвкава колекция от региони за кодиране на SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).
51. Chiang, C. et al. Онкопротеинът E6 на човешкия папиломен вирус е насочен към USP15 и TRIM25, за да потисне RIG-I-медиираната вродена имунна сигнализация. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU et al. Роли на RIG-I N-терминален тандем CARD и вариант на снаждане в TRIM25-медиирана антивирусна сигнална трансдукция. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 105, 16743–16748 (2008).
53. Chiang, JJ et al. Вирусното демаскиране на клетъчни 5S rRNA псевдогенни транскрипти индуцира RIG-I-медииран имунитет. Нац. Immunol. 19, 53–62 (2018).
54. Sparrer, KMJ et al. TRIM23 медиира индуцираната от вирус аутофагия чрез активиране на TBK1. Нац. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).