bgезик
Начало / знание / Съдържание

знание

Ishophloroglucin A, изолиран от Ishige Okamurae, потиска меланогенезата, индуцирана от -MSH: In Vitro и In Vivo Част 2

Apr 03, 2023

3. Дискусия

sdasdad

Съединението DPHC, изолирано от IOE, вече съобщава за инхибиране на тирозиназатаактивност и защитен ефектсрещу увреждане на клетките, причинено от UV-B радиацияинвитро[8]; въпреки това,антимеланогенен ефектна компонентите, получени от IOE in silico чрез взаимодействие стирозиназа,in vivoв проучвания на фенотипа в животински модели и техните основни молекулярни механизми,все още не са прегледани. В настоящото изследване ние определихме анти-меланогенезата и тирозиназатаинхибиторни активности на IPA, флоротанин, изолиран от IO и IOE, в гръбначен модел на рибка зебраin vivo и в B16F10 меланомни клетки in vitro, след индукция с -МСХ.


Лечение със Известно е, че MSH индуцира синтеза на меланин и тирозиназната активност [20]. Освен това е доказано, че тирозиназата е от съществено значение за меланогенезата [29]. Предишни проучванияса показали, че молекулярният докинг може да се използва за оценка на инхибиторната активност на тирозиназата [30,31]. По този начин бяха извършени молекулярни докинг изчисления, за да се разбере моделът на свързване на IPAи DPHC, известен полифенол, изолиран от IO, който е разкрил по-висока енергия на свързване вантимеланогенна активност от арбутин, като положителна контрола. Според резултатите (Фигура1), IPA разкри най-ниските резултати за докинг, което показва, че взаимодействието на IPA с целтапротеиновата тирозиназа е по-силна от другите две съединения, DPHC и арбутин. Въпреки това,има ограничение в корелирането на инхибирането на активността на тирозиназата на гъбите с тази на клетъчнатапроизводство на тирозиназа или меланин в култивирани меланоцити [32]. По този начин инхибиторните ефектина IPA наактивността на тирозиназата и меланогенезата са изследвани в риба зебраin vivoмодел и миши B16F10меланомни клетки.


Меланиновите пигменти се натрупват на повърхността на рибата зебра, което позволява микроскопско наблюдение напроцес на пигментация без сложни експериментални процедури, което ги прави подходящ моделза скрининг на инхибитори на меланогенезата [33,34]. Ние оценихме инхибиторните ефекти на меланинана IPAи IOE в модел на ларва на риба зебра, стимулиран от -MSH чрез определяне на съдържанието на меланин.Всички тествани проби оказаха дълбоки инхибиращи ефективърху пигментацията на зебрата без значителнатоксичност (Фигура S2). Инхибиторните ефектина пигментацията са наблюдавани чрез морфологичен анализ наларви на риба зебра, свързани с различнилечения (Фигура2). В допълнение, използването на ларви в ранен стадийотколкото възрастен стадий осигурява друго предимство при тестване на перкутанните ефектина лекарствениили козметични съединения [33,35]. В този случай ние избрахме -MSH като индуктор както при рибки зебра in vivoи в B16F10 меланомни клеткиинвитро. Според двата резултата в ембриони на риба зебра и B16F10меланомни клетки, съдържанието на меланин се увеличава с -MSH стимулация.


Съдържанието на меланин корелира пряко с активността и протеиновите нива на тирозиназата [36]. Следователно,ние определихме инхибиторните ефектина IPA и IOE върху тирозиназната активност, индуцирана от -MSH включенB16F10 клетки. Установихме, че групата, лекувана с IPA, има намалена тирозиназна активност и меланинсъдържание, стимулирано от -MSH, с намаление от приблизително 35 процента тирозиназна активност и 40 процентасъдържание на меланин (Фигура4А, В). IOE инхибира активността на тирозиназата по дозозависим начин изначително намалена меланогенеза в B16F10 клетки (Фигура4Б, Г). В сравнение с арбутин, IPA иIOE имат значителни инхибиращи ефективърху производството на меланин и активността на тирозиназата, което трябваше дарезултатите от предишни молекулярни докинг изследвания.


Да се ​​изследва механизмът на инхибиторните ефектиНа -MSH-индуциран синтез на меланин вклетки, беше извършен Western blotting. Нивата на експресия на протеини, свързани с меланин, включителноERK, JNK и p38, след лечение с IPA или IOE, бяха оценени. Активирано фосфорилиранена ERK може да насърчи разграждането на MITF чрез зависимия от убиквитин-протеазома път [28]. Това предполага, че потенциалните инхибитори на меланогенезата могат да потиснат синтеза на меланин чрез насърчаванепротеазомното разграждане на MITF, което е свързано с активирането на сигнализирането на ERKпътища [37]. ERK, JNK и p38 MAPK принадлежат към семейството MAPK [38–40]. В допълнение,активиране на p38 MAPK пътя, индуциран от MITF експресия [41]. В това изследване, Western blotанализът разкри, че IPA насърчава p-JNK и p-p38 (Фигура5B, C). За разлика от тях нивата на p-ERKне се промени с лечението на IPA и IOE (Фигура5А). Тези резултати предполагат, че инхибиторните ефектина IPA и IOE върху тирозиназната активност и меланогенезата може да са свързани с JNK и p38сигнални пътища.

4. Материали и методи

4.1. Химикали и реактиви

Диметилсулфоксид (DMSO), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT),L-DOPA, алфа-меланоцит стимулиращ хормон ( -MSH) и фосфатно буфериранфизиологичен разтвор (PBS)са закупени от Sigma–Aldrich Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Модифициран на DulbeccoСредата на Eagle (DMEM) и фетален говежди серум (FBS) са получени от Invitrogen–Gibco(Гранд Айлънд, Ню Йорк, САЩ). Извънклетъчната сигнално-регулирана киназа (ERK1/2), фосфорилиран ERK1/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-терминална киназа (JNK), фосфорилиран JNK (p-JNK), p38, фосфорилиранp38 (p-p38), cAMP отговор елемент-свързващ протеин (CREB), фосфорилиран CREB (p-CREB),транскрипционен фактор, свързан с микрофталмия (MITF), протеин, свързан с тирозиназа-1 (Trp-2),протеин, свързан с тирозиназа-1 (Trp-1), тирозиназа (TYR), анти-миши и анти-заешки IgG антителаса закупени от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Всички други реагенти, включително -MSH, са закупени от Sigma–Aldrich Chemical Co.

4.2. Молекулярно свързване на тирозиназа

За докинг изследването кристалната структура на тирозиназата (PDB: 3NM8) е получена отБанка данни за протеини. Проучванията за докинг бяха извършени с помощта на CDOCKERв Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Когато цял нуклеотидпоследователността е покрита от рецепторната решетка, се предполага, че лигандите избират най-добрата докинг позиция [42]. Процедурата за докинг беше спомената в предишното проучване. Накратко бяха последвани три стъпки: (1)преобразуване на 2D структурата в 3D структура; (2) изчисляване на таксите; и (3) добавяне наводородни атоми с помощта на гъвкавата докинг програма [31,43]. 

4.3. Изготвяне на IOE и изолиране на IPA

IO е събран през юни 2018 г. по източното крайбрежие на остров Джеджу, Корея. Водораслото се измива два пътис чешмяна вода, за да отстраните солта, епифитите и пясъка, полепнали по повърхността. След това беше внимателноизплаква се с прясна вода и се съхранява в медицински хладилник при−20 ◦C. След това замразенитеводораслите се лиофилизират и хомогенизират с мелница преди екстракция. IOE е извлечен в 50 процентаетанол (v/v, във вода) при разбъркване в продължение на 24 часа при стайна температура, след което се филтрува. Филтратътекстракт се концентрира при декомпресия и се лиофилизира до прах (IOE). 50 процента етанолекстракт от IO беше проведено от Shinwoo Co. Ltd. (Партида № SW9E29SA, Gyeonggi-do, Корея). IPA бешеизолиран от IOE, както е описано по-горе [9]. Накратко, IOE беше фракциониран с помощта на центрофугаразделителна хроматография. Всички фракции бяха събрани и IPA в крайна сметка беше пречистен от aполупрепаративна HPLC колона (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA беше определен като aполифенолът и неговата химична структура (Фигура S1, Допълнителни материали) бяха идентифицирани чрез LC/Г-ЦАанализ с масm/z от 992.1315, което показва молекулна формула на C96H66O48 (1986.26 гизчислено молекулно тегло,∆0.6, [M − 2H] 2−). 

4.4. Произход и поддържане на родителските рибки зебра

Възрастни риби зебра бяха получени от търговски дилър (Аквариум в Сеул, Сеул, Корея) и 10рибите бяха консервирани в 3-L акрилен резервоар при 28,5◦C, с цикъл 14:10 часа светлина: тъмно. Рибките зебра бяхахранят два пъти на ден, в продължение на 6 дни⁄седмица, с допълнителна храна на люспи Tetramin (SEWHAPET Food Co.,Сеул, Корея). Ембрионите бяха събрани в рамките на 30 минути чрез естествено хвърляне на хайвера и индуцирани сутринкато включите светлината. Експериментът с риба зебра получи одобрение от Animal Care and UseКомитет на Националния университет Джеджу (Одобрение № 2017-0001).

4.5. Измерване на съдържанието на меланин в ларви на зебра

IPA и IOE и стимулатор Концентрациите -MSH бяха използвани за изследване на ефектитенаконцентрация върху развитието на ембриона. Петнадесет ембриона на риба зебра (3–4 hpf) бяха посяти във всякаямка, съдържаща 1,9 mL ембрионална среда, в 12-плака за посяване на ямки. Тестовите проби бяха разтворенив 1 процент DMSO с 1× PBS и се смесва добре. Всяка сутрин за първите 5 pdf бяха жизнеспособни ембриониизброени, за да се получи мярка за оцеляване. За да се определи съдържанието на меланин, ембриони при7–9 hpf бяха посяти в 6-плака с ямки с 30 ембриона във всяка ямка в 2.7-mL ембрионална среда.След 3 дни ларвите се изплакват два пъти с 1× PBS за отстраняване на всички остатъчни реагенти иличастици и подобни количества ларви бяха поставени в е-тръбите. Преди да измерите меланинасъдържание, няколко ларви от всяка група бяха уловени с микроскоп, а останалите бяха центрофугирани.


След центрофугиране, утайката се разтваря в 1 mL 1 N NaOH при 90°С.◦C за 60 минути. Сместаслед това беше енергично завихрен, за да се разтвори пигментът меланин. Абсорбцията на супернатанта бешеизмерено при 490 nm. Резултатът беше сравнен с контролата, която се считаше за представляваща такавасто. Съдържанието на меланин се калибрира според количеството протеин и наблюденията се повтарятв три екземпляра.

4.6. Цитотоксичност на IPA и IOE в B16F10 клетки

B16F10 миши меланомни клетки бяха получени от ATCC (American Type Culture Collection,Манасас, Вирджиния, САЩ). B16F10 клетки се култивират в DMEM, допълнен със 100 U/мл пеницилин,100 µg/mL стрептомицин и 10 процента FBS. След това клетките се инкубират в атмосфера от 5 процента CO2 при37 ◦C и след това се субкултивират на всеки 3–5 дни. Цитотоксичността на IPA и IOE срещу B16F10клетки се изследват чрез колориметричен МТТ анализ. Накратко, клетките бяха посяти в 24-ямкови плаки при a

концентрация на 2× 104клетки/mL. Около 16 часа след посяването, клетките се инкубират с IPA и IOEпри различниконцентрации за 72 часа и се определя тяхната жизнеспособност.

4.7. Определяне на съдържанието на клетъчен меланин

Съдържанието на клетъчен меланин се измерва с помощта на описан по-горе метод [33]. Клетките(2 × 104 клетки/mL) се инкубират с различни концентрации на IPA и IOE в продължение на 72 часа; Следователно,те бяха промити в ледено студен PBS. Накратко, клетките се инкубират при 80°С◦С за 1 час в 1 mL от 1 NNaOH/10 процента DMSO и след това се разбъркват на вортекс, за да се разтвори меланинът: абсорбцията се измерва при450 nm. Оптичната плътност на инхибирането в контролата се счита за 100 процента. Данните сапредставени под формата на средни проценти и резултатите бяха повторени в три екземпляра.

















Може да харесаш също