Кемпферолът облекчава LD-митохондриалното увреждане чрез насърчаване на автофагията: Последици при болестта на Паркинсон, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Появяващите се доказателства показват, че неочаквано отлагане на липидни капчици (LD) и пероксидация могат да ускорят стреса на органелите и играят решаваща роля в патогенезата на невродегенеративните заболявания (NDD). В нашето предишно проучване ние потвърдихме, че кемпферол (Ka), малка естествена флавоноидна молекула, проявява невропротективни ефекти върху мишки с LPS-индуцирана болест на Паркинсон (PD). В допълнение, предишни проучвания показват, че автофагията играе важна роля в регулирането на клетъчното отлагане на LD. В настоящото проучване ние показахме, че Ka защитава срещу загуба на неврони и поведенчески дефицити в MPTP/p-индуцирани PD мишки, придружени от намален липиден оксидативен стрес в substantia nigra pars compacta (SNpc). В култивираните невронни клетки Ka показва относително безопасен диапазон на концентрация и значително потиска натрупването на LD и клетъчната апоптоза, индуцирана от MPP plus. По-нататъшно проучване показва, че защитният ефект на Ка зависи от аутофагията, по-специално липофагията. Критично, Ka насърчава аутофагията, за да медиира разграждането на LD в лизозомите, което след това облекчава отлагането на липиди и пероксидацията и произтичащото от това увреждане на митохондриите, като впоследствие намалява невронната смърт. Освен това, AAV-shAtg5-медиираният нокдаун на Atg5 премахва невропротективните ефекти на Ka срещу липидното окисление при PD мишки. Тази работа демонстрира, че Ka предотвратява допаминергичната невронална дегенерация при PD чрез инхибиране на митохондриално увреждане, медиирано от липидна пероксидация, чрез насърчаване на липофагия и осигурява потенциална нова терапевтична стратегия за PD и свързани с него NDD.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Болестта на Паркинсон (PD) е често срещано невродегенеративно заболяване (NDD), което се характеризира патологично с прогресивна загуба на допаминергични (DA) неврони в substantia nigra pars compacta (SNpc). Въпреки че точната етиология и естественият ход на това заболяване все още не са напълно изяснени,многобройнипроцеси и дисфункции на системно ниво, включително митохондриални функции, допаминова хомеостаза, невровъзпаление и автофагия, са замесени в патогенезата на PD [1,2]. Последните доклади разкриха, че липидните капчици (LD) са свързани слипотоксичностможе да участва в патологията на PD [3,4]. LD са силно динамични органели, които излизат от мембраната на ендоплазмения ретикулум (ER) и обикновено служат като вътреклетъчни места за съхранение на неутрални липиди [5]. Наскоро беше показано, че LDs играят много по-широка роля от съхранението на мастни киселини (FA) и участват в много заболявания. Например миелоидните клетки, включително макрофаги, левкоцити и еозинофили, образуват LDs в отговор на възпаление и стрес, а LDs са места за производство и съхранение на възпалителни цитокини и допълнително участват в представянето на антигена и изчистването на патогена [6]. Важно е, че при атеросклерозата е доказано, че богатите на LD пенести клетки са вредни във всички стадии на заболяването [7].

Cistanche може да подобри имунитета

Въпреки това, LDs не са широко проучени в централната нервна система (ЦНС), като малко статии съобщават за хистологично присъствие на LDs в човешката мозъчна тъкан [8,9]. Дори и така, LD могат да имат важни функции в мозъка, тъй като последните проучвания потвърждават, че агрегираните LD в глията ускоряват невродегенерацията в модел на Drosophila [10]. Наскоро беше съобщено, че при мишки масленочервени О-позитивни натоварени с липиди клетки, включително неврони, глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP) плюс астроцити и йонизирана калций-свързваща адапторна молекула-1 (IBA{{7} }) плюс микроглия, присъстват в много области на мозъка и е доказано, че участват в процесите, свързани с възрастта [1]. Нашата предишна работа също демонстрира повишено натрупване на LD в мозъка в модел на PD мишка [12]. Взети заедно, тези проучвания предполагат, че LDs могат да бъдат включени в патогенезата на PD, както и други NDDs.

Обикновено вътреклетъчните LD се разграждатлизозомии доставят ФК на митохондриите за тяхната консумация като алтернативен източник на енергия по време на периоди на изчерпване на хранителни вещества [13]. Въпреки това, невроните имат нисък капацитет за потребление на митохондриална FA за производство на енергия [14]. Тази характеристика прави невроните особено чувствителни към натрупване и пероксидация на LD. Освен това, натрупването на LDs повишава скоростта на окисление на FA и налага постоянен натиск върху митохондриалната верига за транспортиране на електрони, което увеличава производството на реактивни кислородни видове (ROS) от комплексите I и II на транспортната верига на електрони [15] за усилване на оксидативния стрес. Липидното претоварване също води до производство на ROS от екстрамитохондриални източници като никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидази и други окислителниензими. В комбинация с намалената експресия на антиоксидантни ензими и ниския капацитет за консумация на FA в невроните, натрупването на LD медиира оксидативния стрес и може допълнително да доведе до увреждане на митохондриите,лизозомна дисфункция, дефектна аутофагия и активиране на възпалителни реакции [6,17]. Освен ако натрупаните LDs не могат да бъдат инхибирани или отстранени, силно активните неврони претърпяват патофизиология, което води до невродегенерация [17]. Доказателствата показват, че лизозомно-медиираният катаболен процес, наречен аутофагия, играе ключова роля в поддържането на клетъчната LD хомеостаза в множество тъкани [17,18]. В детайли, LD могат да бъдат селективно изолирани в автофагозоми и доставени до лизозоми за разграждане от лизозомни киселинни липази, процес, специално известен като липофагия [19]. Следователно, насочването към LD и техния път на автофагично отстраняване може да представлява нов подход за управление на невродегенерацията.

Изследването на естествени продукти и диетични агенти като източници за потенциални лечения и стратегии за NDD придоби огромен интерес през последните години [20]. Кемпферол (Ka) е естествена полифенолна малка молекула, която може да се намери в редица китайски лечебни билки и хранителни източници [21]. Съобщава се, че Ka упражнява антибактериални, против стареене и имуномодулиращи ефекти, както и антиоксидантни и невропротективни дейности [20,22,23]. По-рано се съобщава, че Ka инхибира възпалението в BV2 микроглиални клетки in vitro [24] и повишава резистентността на DA невроните към невровъзпаление in vivo [25]. Въпреки това, ефектът на Kaon LDs при PD все още не е проучен.

Като се има предвид значението на LDs и интимната връзка между LDs, митохондриите и аутофагията [16], които всички участват в PD, ние предполагаме, че Ka инхибира LD пероксидацията и предотвратява DA невродегенерацията при PD. В настоящото изследване ние демонстрирахме, че Ka значително защитава срещу невродегенерация в миши PD модел чрез инхибиране на натрупването на LD. По-нататъшно проучване разкрива, че Ka предизвиква аутофагия и намалява натрупването на окислени LDs, за да облекчи митохондриалната дисфункция и производството на митохондриална ROS (mtROS), като по този начин предотвратява невроналната апоптотична смърт. Констатациите, получени в това проучване, могат да помогнат за насочване на клинични решения относно употребата на естествената молекула Ka при NDDs като PD.

2. Материали и методи

2.1. Опитни животни

C57BL/6J мишки (мъжки, 4-месечни) са получени от Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Мишките са били отглеждани и отглеждани в Центъра за животински ресурси към Факултета по медицина, Медицински университет в Нанкин и в съоръжението за животни в болница Nanjing Drum Tower, Мишките имат свободен достъп до храна и вода в стая с околна температура от 22 градуса ± 2 градуса C и цикъл светлина/тъмнина от 12:12 ч. Всички процедури с животни бяха извършени в строго съответствие с насоките на Ръководството на Националните здравни институти за грижа и използване на лабораторни животни.

2.2. Реактиви

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 процента ,96,353) за in vitro експерименти е получено от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) са закупени от Thermo Fisher Scientific. За експерименти с животни Ka се разтваря в разтвор от 10 процента DMSO в 16 процента SBE- -CD в стерилен физиологичен разтвор. За клетъчни експерименти, Ka се приготвя в DMSO (Sigma-Aldrich) и PBS (крайната концентрация на DMSO е 0,01 процента), рН 7,4.

2.3. Индуциране и лечение на метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (МРТР)-индуциран миши модел на PD

За да се оценят ефектите на Ka в PD модела на MPTP/p-токсичност, мишки (мъжки, на възраст 4-5 месеца) бяха разделени на случаен принцип в група, третирана с физиологичен разтвор, група, третирана с MPTP, MPTP плюс Ka-третирана група и група, лекувана само с Ka. В групата, третирана с MPTP, мишките получават хронично приложение на MPTP с протокол, подобен на описания по-рано [26]: MPTP се разтваря във физиологичен разтвор и се инжектира подкожно при 25 mg/kg, последвано от 250 mg/kg пробенецид (разтворен в диметилсулфоксид) интраперитонеално (ip) инжектиране на интервали от 1 час на всеки 3,5 дни за период от 5 седмици. Контролните мишки получиха инжекция с физиологичен разтвор и пробенецид. В групата, лекувана с MPTP плюс Ka, мишките получават Ka (50 mg/kg, единична инжекция/ден по време на експерименти, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Китай) интраперитонеално (ip) дневно 3 дни преди лечението с MPTP и над 5 MPTP инжекционни седмици. Една седмица след последната MPTP инжекция, мишките бяха подложени на поведенчески тестове, заслепени за групи. След това всички мишки бяха анестезирани с 40 mg/kg натриев пентобарбитал и умъртвени за откриване на мозъчни протеини и имунохистохимия или qPCR анализ.

2.4. In vivo стереотаксична хирургия и експериментални лечения

Стереотаксичната хирургия под анестезия с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip) се извършва, както е описано [25]. Миши Atg5 и контролна shRNA бяха трансфектирани с опаковъчни вектори (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP), за да се генерира AAV. За микроинжектиране, анестезирани мишки се поставят в стереотаксичен апарат. Те бяха инжектирани с 1μL AAV чрез стъклен електрод, насочен към DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:-0.45 mm） при скорост от 0,25 μL/min След това иглата се задържа за допълнителни 2- минути 2 седмици след микроинжектирането на вируса, мишките се подлагат на МРТР-индуцирано PD моделно провеждане и (или) Ka лечение.

Atg5 shRNA беше получена от Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. За мълчанието на Atg5, праймерите бяха показани в допълнителна таблица 1.

2.5. Поведенчески анализ

Една седмица след последното инжектиране на MPTP или физиологичен разтвор, тестът с въртяща се пръчка и полюсният тест бяха извършени, както е описано по-горе [27]. За теста с ротарод, мишките бяха аклиматизирани към ротарод в два опита (6 минути с ускорена скорост от 12-20 rpm) на ден в продължение на 2 последователни дни преди началото на експеримента. След това мишките бяха тествани при 20 rpm за 300 s за други 3 последователни дни. Закъснението до падане се записва с помощта на Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, China). За теста с стълб мишките се поставят с главата нагоре върху върха на вертикален дървен стълб (с груба повърхност, височина 50 cm, диаметър 1 cm). Всички мишки бяха свикнали с апарата 2 дни преди тестването и след това бяха тествани три пъти на третия ден. Бяха записани общото време (T-общо, докато мишката достигне пода с четирите си лапи) и времето за завъртане (T-завъртане, за да се обърне напълно главата надолу на мишката). Експериментът беше заслепен за групи мишки за всяко поведенческо тестване и тестът беше извършен три пъти.

2.6. Събиране на мозъчни проби

След окончателните поведенчески тестове, мишките бяха анестезирани с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip). За qPCR, Western blotting и анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC), целите мозъци бяха бързо извлечени от животни, след което тъканите на средния мозък и стриатума бяха бързо дисектирани, предварително замразени с течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 градуса до анализа.

За имунохистохимичен анализ мишките се перфузират транскардиално с 4% параформалдехид (PFA). Мозъците бяха екстрахирани, постфиксирани, дехидратирани, вградени в OCT (Tissue-Tek) и серийни срезове на мозъците бяха криосекционирани （30 μm на срез） през всеки цял стратум и среден мозък с помощта на замразяващ микротом (Leica CM1950, Nussloch, Германия ). Всички срезове бяха събрани в шест отделни серии и срезовете на мозъка бяха съхранени в 50 процента глицерин и замразени при -20 градуса до анализа.

За ТЕМ мишките се перфузират с 2,5 процента глутаралдехид и 2 процента параформалдехид, както е описано 【12】. Малка порция (<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Имунохистохимичен анализ

Мозъчните резени се промиват в PBS, последвано от 3 процента H2O, за 10 min, след което се инкубират с 0.3 процента Triton X-100 в PBS, допълнен с 5 процента BSA за 1 час. След това слайдовете се инкубират с първичните антитела при 4 градуса за една нощ в PBS, съдържащ 5 процента BSA при 4 градуса за една нощ, след това се промиват и инкубират във вторични антитела за 1 час при стайна температура, последвано от инкубиране с диаминобензидин (DAB) или монтиране в DAPI (Life Technologies, Cat P36931) като имунофлуоресцентно оцветяване за 5 минути. За оцветяване с Nissl предметните стъкла се смесват в разтвор на крезил виолет (CV) (0,1 g крезил виолет, 99 ml вода и 1% оцетна киселина 1 ml) за 30 минути при стайна температура, след което се дехидратира с алкохол и ксилен. Изображенията бяха наблюдавани и снимките бяха заснети под микроскоп Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Съединени щати). Общият брой на TH-позитивните и Nissl-позитивните неврони в SNpc беше получен серологично чрез използване на метода на оптичния фракционатор със софтуер MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC).

Пробите от стриатума на мишки се хомогенизират с {{0}}.1 М перхлорна киселина （1 mg тъкани в 100 μL перхлорна киселина） и 0,1 mM EDTA, третирани с ултразвук и центрофугирани при 20,000 rpm за 30 минути, както е докладвано [27]. След това супернатантните течности бяха събрани за измерване. Подвижната фаза е смесен разтвор, състоящ се от 90 mM моноосновен натриев фосфат, 1,7 mM 1-октансулфонова киселина, 50 mM цитрат, 50 μM EDTA, 10 процента ацетонитрил със скорост на потока 0,2 ml/min. Успоредно с това, за изчисляване на количествена стандартна крива, изходен стандартен разтвор за допамин и дихидрокси-фенил оцетна киселина (DOPAC) (Sigma-Aldrich, САЩ) се приготвя в 0,1 М HClO4. Количество от 10 ul от приготвения супернатант или стандартен разтвор се инжектира в мобилната фаза и тестван от ESA Coulochem ⅢI електрохимичен детектор (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Пробите бяха измерени и пиковете бяха количествено определени. Концентрациите на моноамини бяха количествено определени чрез сравняване със стандарта с помощта на софтуер ClarityChrom (Knauer, Германия) и след това съдържанието в стратума беше преобразувано според съотношението на разреждане Стандартната крива на DA и DOPAC беше показана на допълнителна фигура 1а и b.

2.8. Клетъчни култури и лечения

Мезенцефалните първични невронни култури бяха проведени, както е описано по-рано [12]. Накратко, мезенцефалните тъкани на C57BL/6 мишки на ембрионален ден 14/15 (E14/15) бяха внимателно отстранени, механично дисоциирани за отстраняване на мембраните и големите кръвоносни съдове, и след това разчленен. След това те се усвояват с трипсин-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) и след това се филтруват през 100-μm филтър, за да се получи едноклетъчна суспензия. Впоследствие клетките се поставят върху поли-L-лизин -предварително покрити 12-/24-ямкови плаки при 2,5×10 градуса клетки/ml, съдържащи невробазална среда (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, САЩ), допълнена с B27 (2 процента v:v, Cat 17504044, GibcoTM) и пеницилин/стрептомицин (0,5 процента v:v) Културите се поддържат във влажна камера (37 градуса, 5 процента CO2 инкубатор). Културалната среда се сменя на всеки 3 дни и клетките могат да се използват на 7-10 дни.

Клетъчни линии: Клетъчните линии SH-SY5Y се култивират в 10 процента FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин в овлажнен инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. В експериментите клетките SH-SY5Y бяха третирани с MPP（200 μM） или различни дози от Ka（0,3,30,60,100,300,600 μM） за 24 часа. Ka （3,10,30,60 µM, 3 h） праймирани-SH-SY5Y клетки бяха стимулирани с MPp плюс （400 µM） за 24 часа. Ka （30 μM, 3 h） с （или без） 3-MA （3 mM, 1 h） или -токоферол（50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783） праймирани-SH-SH5Y клетки бяха стимулирани с MPP плюс （200 μM） за 24 часа.

2.9. Клетъчна жизнеспособност CCK8 анализ

Променената клетъчна жизнеспособност при третиране с Ka беше открита от комплект за броене на клетки-8(CCK-8 комплект, Selleck, Хюстън, Тексас, САЩ). Накратко, клетките SHSY5Y бяха посяти в 96- ямкова плака и след това се третира с различни концентрации на Ka（3,30,60,100,300,600 μM） за 24 часа. След това 10 ulof CCK-8 реагент се добавя към всяка ямка за 4 часа. Накрая, абсорбцията беше открита от Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) при 450 nm.

2.10. Анализ на АТФ

Нивата на клетъчния АТФ бяха открити с комплект за анализ на биолуминесценция на АТФ (Beyotime Biotechnology Co., Китай〕съгласно инструкциите на производителя. След третиране клетките бяха лизирани и центрофугирани при 12,000 rpm за 5 минути при 4 градуса и супернатантите бяха събрани. Работен разтвор (100 μL) беше добавен към 20 μL проба в 96-плаката с ямки и луминесценцията беше измерена незабавно на автоматичен четец на микроплаки. Измерванията от всички проби бяха нормализирани до концентрация на протеин.

2.11. Na плюс -K -ATPase анализ

За измерване на Na плюс -K плюс -ATPase (A 070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Китай), клетките се обработват с ултразвук и се центрофугират при 6000 rpm за 10 минути, за да се получи супернатант. Реакционни разтвори на Na плюс -K плюс -ATPase откриване бяха добавени и инкубирани съгласно инструкциите на производителя. След това беше открита абсорбцията при 660 nm. Измерванията на всички проби се нормализират до концентрацията на протеин.

2.12. Western blotting анализ

Клетки или мозъчни тъкани бяха лизирани в RIPA буфер (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP-40(FNNO021,Thermo),0,5% натрий дезоксихолат (D6750, Sigma), 0,1 процента SDS (74255, Sigma), допълнен с протеазни и фосфатазни инхибитори (Roche, Шанхай, Китай) Концентрациите на протеин се определят с Micro BCA Kit (Beyotime, Шанхай, Китай). A {{13 }}ug протеин от всяка проба бяха разделени чрез SDS-PAGE с помощта на полиакриламидни TGX гелове (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ) и след това прехвърлени към мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). След блокиране, PVDF мембраните се инкубират с различни специфични първични антитела в TBST при 4 градуса за една нощ, след което се промиват и инкубират в съответните вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (HRP), за 1 час при стайна температура. (Пиърс, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Илинойс) и анализирани с помощта на ImageQuantM LAS 4000 система за изображения (GE Healthcare, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ).

2.13. Количествена (Q) и обратна транскрипция (RT) PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира от мозъчни тъкани и култивирани клетки с помощта на Trizol реагент (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Обратната транскрипция се извършва с помощта на комплект реагент TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Япония). qPCR в реално време се провежда с помощта на SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) в инструмент StepOnePlus (Applied Bio-systems). Праймерите са закупени и валидирани от General (Шанхай, Китай). Праймерите, използвани за qPCR, са показани в допълнителна таблица 2.

2.14. Анализ на лактат дехидрогеназа (LDH).

Съгласно инструкциите на производителя, клетките се поставят в 96-ямкова плака при 5000 клетки/ямка и се събира културална среда за измерване на нивата на LDH с тестов комплект (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). След това абсорбцията на пробите беше открита от Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) при 450 nm.

2.15.BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 и MitoTracker наситено червено оцветяване

Живите клетки се промиват с PBS и се инкубират с 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) или BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）（2.0 μM , InvitrogenTM, Cat D3861）в PBS за 15 минути при 37 градуса. За оцветяване с MitoTracker Deep Red живите клетки се инкубират с 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) в PBS за 30 минути при 37 градуса. След това клетките бяха промити два пъти в PBS и фиксирани в 3,5 процента PFA за 10 минути, последвано от промиване и обратно оцветяване с Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) за 10 минути, преди да бъдат покрити върху предметни стъкла за изобразяване. Изображенията бяха наблюдавани и снимките бяха заснети чрез флуоресцентна микроскопия (Олимп, Токио, Япония).

2.16. Оцветяване по Hoechst и PI

Клетките се оцветяват с Hoechst 33,342 (1 ul, разреден в 500 ul PBS, Sigma, Cat B2261) и (или) PI (0,1 ul, разреден в 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) за 10 минути и след това се фиксират и наблюдавани чрез флуоресцентна микроскопия (Olympus, Токио, Япония).

2.17. Поточна цитометрия

Клетките се усвояват и се изплакват с D-hank, след което се оцветяват с Анексин V-FITC（5 ul, разредени в 500ul PBS）/PI（0,1 ul, разредени в 500 ul PBS) набор за апоптоза (CA1020, Solarbio, Пекин, Chian) съгласно протокола на производителя. След това апоптотичните клетки бяха анализирани с помощта на поточна цитометрия (guava easyCyteTM 8, Millipore, САЩ). Митохондриалните ROS и измерванията на потенциала на митохондриалната мембрана бяха извършени, както е публикувано 【12】. Клетките SH-SY5Y бяха оцветени с MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, САЩ) или с Jul (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, САЩ) при 37 градуса за 30 минути. След промиване с PBS два пъти, клетките бяха ресуспендирани в студен PBS, съдържащ 1 процент FBS за поточни цитометрични анализи. Данните бяха анализирани със софтуер FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Тестове за дишане на морско конче

Митохондриалната респираторна функция в живи SH-SY5Y клетки се измерва с помощта на анализатора на екстрацелуларен поток Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Санта Клара, САЩ) чрез промени в скоростта на потребление на кислород (OCR). SH-SY5Y клетките се посяват при 3 × 103 клетки/ямка бяха оставени да прилепнат към плаките с клетъчна култура Seahorse и да достигнат приблизително 80 процента сливане по време на експеримента. На следващия ден клетките се третират предварително с Ka и след това се излагат на MPp плюс за още 24 часа. OCR се открива при базални условия, последвано от последователно добавяне на 1 μM олигомицин, 1 μM FCCP, както и 1 μM ротенон и антимицин А.

2.19. Статистически анализ

Данните бяха представени като средно ± SEM. Значимостта на разликата се определя чрез t-теста на Student, двупосочен анализ на дисперсията или еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от post hoc теста на Tukey. Разликата се счита за значителна при P<>

3. Резултати

Резултат 1. Ka възстановява двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума на MPTP/p PD модел мишки

За да се изследва невропротективният ефект на патогенезата на Kaon PD, 4-месечни мъжки мишки C57BL/6 бяха инжектирани с невротоксина MPTP, за да се установи моделът на MPTP/p PD и бяха третирани с Ka (фиг. la). След индукция на модела, тестът с ротарод и полюсният тест бяха използвани за оценка на двигателните и поведенческите характеристики на мишките в различните групи. Както е показано, времето за изпълнение на ротарод е значително намалено при мишки, третирани с MPTP, и този ефект е предотвратен от Ka (фиг. 1b). Ka също така възстановява поведенческите дефицити, предизвикани от MPTP, както е посочено от намаляването на времето за завъртане и общото време в полюсния тест (Фиг. lc и d), без да се засяга телесното тегло на мишките (Фиг. le). Освен това, HPLC анализът показа, че нивото на допамин в стриатума е значително намалено при MPTP/p-провокирани мишки и това ниво е възстановено чрез лечение с Ka (фиг. 1f. Лечението с Ka също облекчава MPTP/p-индуцираната редукция на дихидрокси -фенил оцетна киселина (DOPAC, метаболит на допамин) в стриатума (Фигура 1g). Тези резултати предполагат, че Ka възстановява двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума при MPTP-индуцирани PD мишки.

Резултат 2. Ka облекчава загубата на DA неврони в SNpc на MPTP/p PD модел мишки

След това, за по-нататъшна оценка на невропротективния ефект на Kaon MPTP/p-индуцирано DA невронно увреждане, ние изследвахме тирозин хидроксилаза (THD плюс неврони в миши SNpc чрез имунооцветяване. Както е показано на Фиг.2a и b, MPTP/p индуцира значително намаление в броя на TH плюс невроните, което беше облекчено от лечението с Ka.Освен това, стереологичното преброяване на общите неврони в SNpc, както е определено от Nissl

Фиг. 1. Лечението с Ka облекчава двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума на MPTP/p PD моделни мишки.

( а ) Схематична диаграма на експерименталния дизайн. (b) Времето на пръта беше измерено за теста с въртяща се пръчка в три последователни дни. (cd) Времето, необходимо за обръщане (време на завъртане) и спускане на стълб (време на катерене) бяха записани за теста с прът. (e) Телесното тегло на мишката се измерва в края на изследването. (fg) Допамин (DA) и дихидрокси-фенил оцетна киселина (DOPAC) в стриатума бяха анализирани чрез високоефективна течна хроматография. Данните са изразени като средна стойност ± SEM.n =9-10 за всяка група в (b,c,d); n =6-8 за всяка група в (f, g).ns, незначително, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

оцветяване, потвърди, че загубата на TH клетки отразява клетъчната смърт, но не и понижаването на експресията на TH и показа, че лечението с Ka възстановява намаляването на броя на Nissl-позитивните неврони в SNpc на MPTP-третирани мишки от 43,3 процента на 25,4 процента ( Фиг. 2c и d). В допълнение, Ka значително подобрява MPTP-индуцираното намаление в експресията на TH и DAT протеин, както е измерено чрез Western blotting (Фиг. 2e-g). Това доказателство потвърждава невропротективния ефект на Ka върху PD миши модел.

Резултат 3. Ka намалява натрупването на LD вакуоли и оксидативния стрес в SNpc на MPTP/p-третирани мишки

Все повече доказателства показват участието на LDs в NDD [10], последователно нашата предишна работа идентифицира повишени LDs в SNpc на MPTP-индуцирани PD мишки [12]. LD могат лесно да бъдат идентифицирани и да показват кръгли структури с ниска плътност с хомогенно аморфно съдържание [28]. Обикновено LDs могат да бъдат разградени чрез автофагия, за да се избегне натрупването [29]. За да се изследва дали Ka може да регулира LDs в PD, натрупването на LDs беше анализирано чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) в SNpc на контрола, MPTP/p и MPTP/p плюс Ka мишки. Както е показано в предишната ни работа [12], броят и размерът на LDs са увеличени при MPTP/p мишки в сравнение с третираните с физиологичен разтвор контроли (Фиг. 3a и b) и са значително намалени при Ka-третирани мишки (Фиг. 3c- д). Освен това, при мишки, третирани с Ka, LDs се наблюдават по-често в близост до, затворени или разградени от автолизозоми, които се определят като електронно-плътни липофусцинови гранули. Допълнително хистологично оцветяване на TH* неврони с BODIPY, багрило, което специфично маркира неутрални липиди и обикновено се използва за откриване на LDs [30], показа, че както броят, така и размерът на BODIPY LDs в SNpc са по-високи при PD мишки, отколкото при контролите, и бяха значително намалени от третиране с Ka (фиг. 3f-h).

Ако LDs не могат да бъдат разградени своевременно, натрупаните LDs могат да претърпят пероксидация и да допринесат за митохондриален ROS-медииран стрес [4], което усилва невротоксичността и прогресията на заболяването. Следователно, ние допълнително изследвахме профилите на експресия на гени, свързани със защита срещу свободна FA токсичност (Gpx8), неутрализиране на окислителни видове, супероксидни радикали (Sod3) и водороден пероксид (Cat) и FA метаболизъм (Acsbg1 и Dbi), както се съобщава [31] , всички от които бяха поразително намалени в SNpc на MPTP-третирани мишки в сравнение с контролите и тези ефекти бяха подобрени при Ka-третирани PD мишки (Фигура 3i). По подобен начин MPTP/p също повишава нивата на експресия на иРНК

Фиг.2. Ka подобрява загубата на DA неврони в SNpc на MPTP/p PD модел мишки.

(ab) Микроснимки на тирозин хидроксилаза(TH)-позитивни неврони (a) и стереологичен брой на TH-положителни неврони в substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Скалите са както е посочено. (cd) Микроснимки на крезил виолет -положителни клетки (c) и стереологичен брой на положителни за крезил виолетови клетки в SNpc (d). Скала, 120 μm.（напр.） Western blot анализ на експресията на TH и DAT протеин в SNpc（e） и количествен анализ（f,g）. Количествено определените данни се нормализират към контролната група с физиологичен разтвор. Данните са изразени като средна стойност ± SEM.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Резултат 4. Ka защитава SH-SY5Y клетки срещу индуцирана от MPP плюс апоптоза

MPP plus, активният метаболит на MPTP, инхибира ензимите на митохондриалния комплекс и причинява клетъчна смърт, която е пряко свързана с PD[32]. След това проучихме дали Ka може да предотврати индуцирана от MPP плюс невронална апоптоза in vitro. Както е показано на Фиг. 4a и b, MPPt (400 μM, 24 h) индуцира освобождаването на LDH от SH-SY5Y клетки, а Ka (30 и 60 μM) значително намалява освобождаването на LDH, без да повлиява оцеляването на клетките (Фиг. 4a). Тъй като Ka индуцира значителен защитен ефект при концентрация от 30 μM（Фигура 4b）, ние използвахме тази концентрация в следващите експерименти.Резултатите от оцветяването на Hoechst/PI също показаха, че Ka значително намалява процента на клетките с индуцирана от MPP плюс кондензация на хроматин (Фигура 4c и d) и клетъчна апоптоза, както се вижда от повишения интензитет на флуоресценция на Hoechst (Фигура 4c) и процента на Hoechst/PI-оцветени клетки (Hoechst plus /PI plus ) (Фигура 4e). открита чрез поточна цитометрия, индуцирана от MPPt клетъчна апоптоза, доказана от увеличения процент на оцветени с анексин V клетки (AV плюс /PI- и AV плюс /Prt) е защитена от Ka (фиг. 4f и g). Освен това, Ka значително се обърна MPP плюс-индуцирани промени в свързаната с апоптоза протеинова експресия, както се вижда от повишената регулация на B cl-2, регулиране надолу на Bax (Фиг.4hi-j) и намалено разцепване на каспаза-3(Фиг.4h, k). Тези данни предполагат, че Ka може да премахне вредните ефекти на MPp plus върху клетъчното оцеляване.

Резултат 5. Ka потиска индуцираното от MPp плюс натрупване на LD и липидна пероксидация, които медиират митохондриалното увреждане в SH-SY5Y клетки

Последните проучвания показват, че неочакваното натрупване на LD може да доведе до повишен стрес, медииран от липидна пероксидация, и да ускори митохондриалната дисфункция, което насърчава невродегенерацията [10]. Предишната ни работа също показа, че повишените LDs в SNpc са свързани с патология на PD при мишки [12]. За да изследваме дали защитният ефект на Ka е свързан с натрупването на LD in vitro, първо извършихме LD-специфично оцветяване в SH-SY5Y клетки, използвайки BODIPY 493/503 и наблюдавахме повишено отлагане на LD (повишени нива на неутрални липиди)

Фиг. 3. Ka намалява натрупването на електронно-плътни LD вакуоли и липидното окисление в SNpc на MPTP/p-третирани мишки.

(ac) Представителни ЕМ изображения, показващи електронно-ярки вакуоли (липидни капчици), електронно-плътни автофагични вакуоли, съдържащи автолизозоми (ALS) или липофусцин-съдържащи лизозоми (Lys) в SNpc на мишки, третирани с физиологичен разтвор (a), MPTP/p (b) и MPTP/p плюс Ka (c). Скала, 500 nm. С (a, b), както е посочено в предишната ни работа (PMID: 29967574). (de) Количествено определяне на електронно-ярки LD вакуоли на неврон в SNpc в посочените мишки. n =3 мишки, 10-12 неврони на група. (fh) Срезове на среден мозък от физиологичен разтвор, MPTP/p- и MPTP/p плюс Ka-третирани мишки бяха оцветени за BODIPY (LDs) и TH (DA неврони). Най-десните панели показват увеличения на BODIPY плюс TH плюс неврони. Стрелките показват LDs.(gh), количествено определяне на BODIPY плюс LD номер и размер. (ii) mRNA експресия на гени, свързани с FFA токсичност (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 и Dbi) (i) и гени за оксидативен стрес (Nox1, Nox2 и Nox4) (j) в SNpc на посочените мишки беше анализирана чрез qPCR в реално време.n=4-5 на група, три независими експеримента. Данните са изразени като средна стойност ± SEM; ns, незначителен, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Тази статия е извлечена отhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Получено на 23 ноември 2020 г