Триизмерна архитектура на нефроните в нормалния и кистозния бъбрек

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Томас Блан1,2,7, Николас Гуден3,7, Мохамад Зайдан1,4,7, Мерием Гарфа Траоре3, Франк Биенаме1,5, Лиза Турински1, Серж Гарбай1, Клемент Нгуен1, Мартин Буртин1, Джерард Фридландер1,6, Фабиола Терци1,8 и Марко Понтолио1,8

Цистанче е полезно за бъбреците

КЛЮЧОВИ ДУМИ: кистозна бъбречна болест; бъбрек; нефрон; нефронофтиза;изчистване на тъкани

Функцията на бъбреците е изключително зависима от сложната триизмерна структура на нефроните. Всяко изкривяване на формата им може да доведе добъбречна дисфункция. Традиционните хистологични методи представляват големи ограничения за триизмерна тъканна реконструкция. Тук комбинирахме изчистване на тъкани, многофотонна микроскопия и цифрово проследяване за реконструкция на единични нефрони при физиологични и патологични състояния. Комплекти отнефрониразлични по местоположение, форма и размер според тяхната функция бяха идентифицирани. Интересното е, че нефроните са склонни да лежат в равнини. Когато тази техника беше приложена към модел накистозна бъбречна болесте установено, че кистите се развиват само в специфични сегменти на нефрона. По протежение на същия сегмент кистите са съседни в нормалните неразширени тубули. Освен това, формите на кистите варират в зависимост от сегмента на нефрона. По този начин нашите открития осигуряват ценна стратегия за визуализиране на сложната структура на бъбреците на ниво единичен нефрон и, което е по-важно, предоставят основа за разбиране на патологични процеси като цистогенеза.

Преводна декларация

Методите за изчистване предоставят уникален инструмент за разбиране как морфологичните промени водят до патологични последствия. Бъбреците са критични органи, които поддържат хомеостазата на тялото чрез работа с вода, метаболити и електролити, които са изключително зависими от сложната 3-измерна структура на нефроните. Когато тази структурна организация се промени, възниква бъбречна патофизиология. В настоящото изследване ние разработихме мощен метод, базиран на оптично изчистване,

многофотонна микроскопия и дигитално проследяване за изследване на бъбрека на ниво един нефрон при физиологични и патологични състояния. По-специално, ние предоставяме първата 3-измерна реконструкция на поликистозен бъбрек в мащаба на единични нефрони. Този метод може да се приложи към няколко патологични контекста, което ни позволява да разберем по-добре сложния процес на влошаване на бъбреците и, следователно, да разработим по-целенасочени терапевтични стратегии.

Бъбрекът поддържа телесната хомеостаза чрез своята сложна 3-измерна (3D) структура на нефрона. Когато тази структурна организация се промени, възниква бъбречна патофизиология.Хронични бъбречни заболяваниясе характеризират с развитие на бъбречни лезии. Интересно е, че патолозите съобщават за широка хетерогенност в разпределението на лезиите по време на хронични бъбречни заболявания.1,2 Дали това отразява факта, че специфични сегменти на нефрона могат да бъдат различно увредени или алтернативно, че някои нефрони имат различна чувствителност към увреждане като цяло , не е известно. За да се реши този проблем, е задължително да се реконструира 3D формата на нефроните в патологични контексти.

Доколкото ни е известно,нефрониса били напълно реконструирани само с помощта на серийни 2D срезове.3–5 Въпреки че стандартното хистологично срязване осигурява висока резолюция, 3D реконструкциите са трудоемки и трудни за получаване. Това се дължи предимно на механични изкривявания, които са неизбежен ефект от процедурата по нарязване. Освен това, 3D реконструкцията от 2D изображения не позволява директно изобразяване на 3D структури в цели монтирани тъкани.

Многофотонната микроскопия подобри способността ни да откриваме морфологични промени в дебели срезове. Значително ограничение обаче е малката достъпна дълбочина поради разсейване на светлината. Чрез минимизиране на разликите в индекса на пречупване, изчистващите агенти драматично подобриха способността за изобразяване на дълбочини.6,7 Въпреки факта, че първият изчистващ агент беше въведен преди век,8 едва наскоро бяха разработени няколко изчистващи протокола, най-вече за мозъка .9–17 Последните проучвания демонстрират техния потенциал за изобразяване на други твърди органи, като черен дроб, панкреас или бъбрек.18–26

цистанче за бъбречно заболяване

Поликистоза на бъбреците, генетично хетерогенно разстройство, включващо мутации в няколко цилиарни гена, е най-често срещаното наследствено бъбречно заболяване.27,28 Поликистозното бъбречно заболяване се характеризира с развитието на кисти, които водят до пълното унищожаване на бъбрека.28 Проучванията с микродисекция предполагат, че кистите могат се развива или като "изтласкване" на нефронов сегмент, както при автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците; като ектатично разширение на събирателните канали (CD), както при автозомно-рецесивна поликистозазаболяване на бъбреците; или изключително в медуларните тубули, както при нефронофтизата (NPHP).27,29 Все още обаче не е известно как кистите се развиват в 3D и се организират помежду си и с нормални съседни тубули.

Тук комбинирахме оптично изчистване с многофотонна микроскопия, за да предоставим нови прозрения за това какнефрониса оформени и организирани във физиологични условия и как се модифицират по време на заболяване, като цистогенеза. Нашите резултати показват, че има 3 вида нефрони и че съдовете могат да повлияят на пространствената организация на нефроните. Интересното е, че наблюдаваме, че нефроните са склонни да лежат в специфични равнини. Неочаквано, когато приложихме тази техника към jck мишки, наблюдавахме, че кистите се развиват само в специфични нефронни сегменти с вретеновидни кисти, смесени с нормални тубули.

РЕЗУЛТАТИ

Експериментална настройка

За изучаване на формата на цялотонефронивъв връзка с тяхната среда, ние приехме техника, базирана на оптично изчистване и многофотонна микроскопия (допълнителна фигура S1A). Чрез сравняване на различни протоколи за оптично изчистване, ние установихме, че за бъбрека бензилов алкохол/бензил бензоат (BABB) е най-подходящият по отношение на ефикасността (допълнителна фигура S1B и C и допълнителна таблица S1).

3D реконструкцията и цифровото проследяване изискват висококачествени изображения с висока разделителна способност и високо съотношение сигнал/фон. Наблюдавахме, че оптичният сигнал, осигурен от нативната флуоресценция, не е еднакъв върху бъбречните участъци. По-специално, изображенията от медулата бяха слабо контрастирани с ниско съотношение сигнал към фон (допълнителна фигура S2). За да подобрим съотношението сигнал към фон, ние оцветихме секции с периодична киселина-Шиф (допълнителна фигура S1D), тъй като емпирично отбелязахме, че това оцветяване води до висок контраст в тънки секции по време на 2-фотонна флуоресценция. Въпреки това, сигналът не беше еднакъв в дебели периодични киселинно-шифови срезове на бъбреците (допълнителна фигура S1E). Затова оцветихме бъбречни срезове с флуорохром-свързани лектини: аглутинин от фъстъци и аглутинин от пшеничен зародиш, които оцветяват гломерулите и тубулите, и аглутинин от Griffonia simplicifolia, който маркира кръвоносните съдове.30 Забележително е, че с комбинацията от тези лектини, сигналът към- съотношението на фона беше драматично увеличено като цялобъбречни участъци, със значително подобрение както в равнината xy, така и в оста z (допълнителна фигура S1E и допълнителен филм S1).

3D визуализация на нефронния сегмент

За да визуализираме формата на цели нефрони, ние проследихме техните пътища, започвайки от пикочния полюс на гломерула и завършвайки при кръстовището на CD (допълнителен филм S2). Въпреки факта, че използваните лектини глобално свързват всички сегменти на нефрона, ние забелязахме, че при внимателна проверка тези лектини се характеризират със специфичен модел в начина, по който оцветяват базалните или луминалните мембрани в различните сегменти на нефрона. С други думи, ние се възползвахме от стереотипния модел на оцветяване с лектин, за да идентифицираме различните сегменти на нефрона. По този начин бихме могли лесно да идентифицираме 6 единици: проксимален тубул (PT), тънък край (TL) на бримката на Хенле (HL), дебел възходящ край (TAL) на HL, дистален извит тубул (DCT), свързващ тубул (CNT) ) и CD. Преходът между PT и TL се характеризира с внезапна загуба на типичния сигнал на границата на PT четката и с намаляване на ширината на лумена, което почти практически липсваше в TL (Фигура 1а). Обратно, преходът между TL и TAL се характеризира със значително увеличение на външния тубуларен диаметър и относително постоянна ширина на лумена (Фигура 1b). Във всичконефрони, преходът на TAL към DCT систематично се открива в съдовия полюс на гломерула. Този преход се характеризира с внезапно увеличаване на външния тръбен диаметър, което се дължи предимно на значително увеличение на диаметъра на лумена (Фигура 1с). Преходът между DCT и CNT се характеризира с намаляване както на тубулния диаметър, така и на лумена (Фигура 1d). И накрая, връзката между CNT и кортикалния CD се характеризира с внезапно увеличение както на тубуларния диаметър, така и на лумена (Фигура 1е). Количественото определяне на тези морфологични преходи беше статистически значимо (Фигура 1f) и неговата уместност беше потвърдена с оцветяване със специфични тубулни маркери (допълнителни фигури S3–S5 и допълнителен филм S3–S5).

Формата и размерът на PTs се различават според тяхната дълбочина

Оцветяването на дебелибъбречни участъцини позволи да проследим координатите на пространствената еволюция на цели PT сегменти. Интересното е, че открихме, че тяхната форма е изключително променлива и се определя от позицията на техните гломерули в кората. В световен мащаб идентифицирахме 3 модела. Първият отговаря на най-повърхностните нефрони (SN) (Фигура 2а; Допълнителен филм S6), които заемат най-външната част на кората (най-външните 30 процента близо до бъбречната капсула). Техните извити части образуваха компактни структури само с 6 до 7 извивки около собствения им гломерул, заемащи много малки и плътно опаковани пространства. Извивката на тези SN завършва с дълги и прави pars recta, които се спускат в медулата. В противоположния край на този спектър наблюдавахме втори модел нанефрониразположен в най-дълбоката част на кората (40 процента повече вътрешна дълбочина), до медулата (юкстамедуларни нефрони [JNs]) (Фигура 2а; Допълнителна фигура S6 и Допълнителен филм S6). Техните PTs се характеризираха с първоначална къса примка, която систематично се спускаше към папилата и след това U се обърна, за да се изкачи към бъбречната капсула. За разлика от SNs, JN проксималните извити тубули се характеризират с големи намотки, които се развиват около техния собствен гломерул и заемат големи, хлабаво опаковани домени в юкстамедуларния кортекс. Свитата част от PT на JN има 10 до 15 навивки, образувайки големи домейни. И накрая, третият модел включва нефрони, разположени в средната част на кората (средни нефрони [MNs]) (Фигура 2а; Допълнителен филм S6). Интересното е, че тези тубули имат форма и пространствена ориентация, които представляват преход между SNs и JNs. Всъщност те съдържаха 8 до 9 намотки с намотки, които бяха по-големи от SN, но по-малки от JN. В допълнение, MNs имат по-дълги pars recta от JNs. Интересно е, че глобалното сравнение на формите на PTs показа, че SNs и MNs имат хомогенен модел, докато JNs са изключително хетерогенни (допълнителна фигура S6). В допълнение, пространствената реконструкция на няколко нефрона разкри, че PT никога не се смесват (допълнителен филм S6), което показва, че всеки нефрон заема свое собствено индивидуално пространство в кората.

Морфометричните анализи потвърдиха големите разлики в размера и формата на SNs и JNs, с междинен аспект за MNs. PT на JN е повече от 2-кратно по-дълъг от PT на SN (Фигура 2b); въпреки това правотата е по-голяма в SNs, отколкото в JNs (Фигура 2c), в съответствие с наблюдението, че JN тубулите са много по-криволичещи (Фигура 2a; Допълнителна фигура S6).

Фигура 1|Морфологични критерии, използвани за идентифициране на нефронни сегменти. ( a – e ) Морфология на различните сегменти на нефрона при контролни мишки. Нефроните бяха проследени от пикочния полюс на гломерула до събирателния канал (проксимален тубул [PT]: тюркоазен; тънък край [TL] на примката на Хенле: светло сив; дебел възходящ край [TAL] на примката на Хенле: тъмно сив; дистален извит тубул [DCT]: розов; свързващ тубул [CNT]: жълт; кортикален събирателен канал [CCD]: оранжев). Стрелките показват диаметъра на различните сегменти на нефрона. (Продължение)

Фигура 1|(Продължение) (f) Количествено определяне на външния тубулен диаметър на различните сегменти на нефрона. Данните са изразени като средна SEM. Анализ на дисперсията, последван от теста на Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Фигура 3|Триизмерната (3D) реконструкция на нефрони разкрива 3 различни типа нефрони. ( а ) Представителни 3D изображения на цял нефрон (леви панели) от гломерули до събирателен канал в повърхностния кортекс (син), среден кортекс (зелен) и юкстамедуларна област (червен) при контролни мишки. Сегментиране на нефрони (десни панели) за 3 различни типа нефрони. Ширина ¼ 150 мм. (b) Количествено определяне на разстоянието между двата крайника на бримката на Хенле за трите вида нефрони. (c) Количествено определяне на дължината на нефрона за (продължение)

Фигура 3|(продължение) 3 вида нефрони. (d) Количествено определяне на дължината на различните сегменти на нефрона според вида на нефрона. Данните са изразени като средна стойност -SEM. Анализ на дисперсията, последван от теста на Tukey-Kramer: юкстамедуларен нефрон (JN) спрямо повърхностен нефрон (SN): ###P < 0.001;="" jn="" спрямо="" среден="" нефрон="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" свързващ="" тубул;="" dct,="" дистален="" извит="" тубул;="" pt,="" проксимален="" тубул;="" tal,="" дебел="" възходящ="" крайник="" на="" бримката="" на="" хенле;="" tl,="" тънък="" крайник="" на="" бримката="" на="">

Размерът на гломерулите варира в зависимост от дълбочината

След това анализирахме дълбочината и диаметъра на гломерулите, произволно избрани от всяка от 3-те зони. Морфометричните анализи показват, че гломерулите са разположени средно на 783 и 355 mm от бъбречната капсула съответно в JNs и SNs. Както беше съобщено по-рано, наблюдавахме, че размерът на гломерулите варира в зависимост от тяхната дълбочина. По-специално, гломерулният обем на JNs е 3 пъти по-голям от този на SNs и MNs (Фигура 2d).

3D реконструкция на нефрон

След това проследихме пространствената еволюция на цели нефрони от PT до CNT. Глобалният изглед на тяхната 3D реконструкция потвърди, че формата на нефрона се различава между SNs, MNs и JNs (Фигура 3a; Допълнителен филм S7). Тази разлика се дължи главно на структурата на PT. Освен това забелязахме, че HL има различна 3D пространствена организация. По-специално, TL и TAL бяха по-отдалечени разделени в JN, отколкото в SN и MN (Фигура 3b). Морфометричните анализи разкриват, че JN са глобално 2-кратно по-дълги от SN (Фигура 3в). Увеличената дължина беше пропорционално разпределена във всички сегменти, с изключение на TAL и DCT, които имаха тенденция да имат подобна абсолютна дължина във всички типове нефрони (Фигура 3d). Това предполага, че удължаването на нефрона е изненадващо хомогенен процес.

Аркуатните съдове влияят върху юкстамедуларната PT извивка

За да получите по-цялостна гледна точка наструктура на бъбреците, ние се възползвахме от оцветяването с аглутинин на Griffonia simplicifolia, което ни позволи да проследим дъгообразните съдове и техните разклонения в кортикалните радиационни съдове (Фигура 4а; Допълнителен филм S8). Интересното е, че съпътстващата 3D реконструкция на нефрони и съдове показа, че дъговидните съдове са склонни да бъдат в изненадваща паралелна пространствена организация с близки тубули. По-специално, ние забелязахме, че пътят, последван от специфични JNs (ограничени JNs), има тенденция да следва пътя на близкия кораб (Фигура 4b; Допълнителен филм S9). Забележително е, че това отклонение (наблюдавано само в подгрупа от JN нефрони) обяснява голямата хетерогенност във формите на PT (допълнителна фигура S6). Морфометричните анализи разкриват, че „ограничените“ PTs са значително по-дълги и по-криволичещи (намалена праволинейност) от „неограничените“ (Фигура 4c и d). Заслужава да се отбележи, че извитите части както на SN, така и на MNs бяха разположени над дъговидните съдове и не бяха ограничени.

Тубулите са склонни да лежат в равнини

Интересното е, че проверката на 3D формите на нефроните показва, че те са склонни да лежат в равнини (Фигура 5а; Допълнителен филм S10). За да определим количествено този параметър и да оценим възможното статистическо отклонение на тази конформация, ние измерихме общата тенденция на тубулите да се огъват извън равнината, дефинирана от техните бримки. Нашите измервания показаха, че в сравнение със симулиран модел на произволно ходене, генериран със същия набор от последователни измерени ъгли и дължина между последователни точки (Фигура 5b), тубулите са склонни да се развиват с по-малко отклонение от равнина (Фигура 5c). Това показва, че тубулите са склонни да ограничават пътя си по равнина. Наблюдаваните разлики са силно статистически значими (P <>

Cistanche може да подобри бъбречната функция

3D реконструкцията на нефрон разкрива специфичен модел за развитие на кисти

За да определим дали нашият протокол позволява проследяване на нефрони в дезорганизирани патологични тъкани, ние характеризирахме формите и пространственото разпределение на кистите в jck мишки, широко използван модел на NPHP и кистозна болест.31–33 3D изображения показаха, че въпреки на появата на видни кисти, общият 3D ход на нефроните не се различава значително от този на контролните мишки (допълнителен филм S11). По същия начин, морфометричните анализи потвърждават, че глобалната дължина на нефроните, гломерулният обем и дължината на всекинефронсегмент са сравними с тези на контролните мишки (допълнителна фигура S7). Трябва да се отбележи, че поради развитието на кисти не успяхме да разграничим TL от TAL в HL. Всички нефрони развиха веретенообразни кисти (допълнителни филми S11 и S12). Една от най-поразителните характеристики беше наблюдението, че веретенообразни кистозни разширения се появяват на множество места по едно и същонефронсегмент (допълнителни филми S12 и S13). Интересно е, че ние забелязахме, че кисти никога не са се развили в PTs и HL низходящи крайници (Фигура 6a; Допълнителен филм S12). За разлика от това, те бяха открити предимно в HL възходящи крайници, DCTs, CNTs и в горната част на CD-та, в продължение на CNT (Фигура 6а; Допълнителен филм S12). По-специално, ние наблюдавахме, че DCT, както и CNT сегментите, имат особено повишена вероятност да развият кисти в съответните им по-дистални части (Фигура 6b). Количествените морфометрични анализи на 3D реконструктивни изображения показват, че общият обем на кистата нанефронбеше особено високо в CNT (Фигура 7а). В допълнение, ние наблюдавахме, че увеличенията на кистата в HL и DCT са по-големи в JNs, отколкото в SNs и MNs (Фигура 7а; Допълнителен филм S12). Освен това, честотата на кисти е значително по-висока при JNs, отколкото при другите видове нефрони (Фигура 7b). Ние също така наблюдавахме, че средното гломерулно междуразстояние (изчислено на най-близките 5 гломерула) има тенденция да бъде особено увеличено при кистозни мишки, особено в по-повърхностния кортекс (допълнителна фигура S8).

3D реконструкцията на множество кисти разкри, че те са изключително променливи по форма и обем (Фигура 6c; Допълнителни филми S11 и S13). В HL възходящия крайник кистите имат веретенообразна форма с малък диаметър. При DCT кистите имат по-скоро сферична и по-голяма форма и са разпръснати сред неразширени тубули. Интересното е, че преходът между DCT и CNT систематично се характеризира с нормална неразширена структура. За разлика от това, при CNT систематично наблюдавахме съседна разширена кистозна структура директно в контакт с CD. Интересното е, че при CD тази структура прогресивно се свива до нормален размер на тубула. По-дистално не могат да бъдат открити други кисти в съседната част на CD. Друга последователна характеристика е особената пространствена организация на кистите в HL възходящия крайник. Всъщност, въпреки че кистите са по-дълбоки и по-близо до бримката в SNs, те са по-повърхностни и по-близо до DCT в JNs (Фигура 6в). Отново, кистите заемат междинна позиция в MNs (Фигура 6в).

Фигура 5|Тубулите на нефрона са склонни да се развиват като плоска структура. ( а ) Типичен път на проксималния тубул на нефрона. Този път илюстрира тенденцията му да лежи в равнина. Планарността на еволюцията на пътя може да се види по-добре, когато е правилно завъртян и подравнен с гледната точка на наблюдателя (вижте дясното представяне на същия тръбен сегмент, който от лявата страна е представен на различен ъгъл). (b) Схематично представяне на тръбен път, съставен от 4 сегмента (между 5 точки, определящи даден тръбен път, показан като пример). Степента, до която пътеките са склонни да излизат "извън своята равнина", може да бъде представена от ъгъла, посочен тук като "бета". (Продължение)

Фигура 5|(Продължение) Този ъгъл се измерва между сегмента p3-p4 по отношение на равнината (дефинирана от непосредствено предходните точки p3, p2 и p1) и представен от тъмносив правоъгълник в схемата. След това изчисляването на бета ъглите беше рекурсивно изчислено по целия набор от точки в тръбен път. За да оценим степента на отклонение на тези бета ъгли, ние симулирахме произволно ходене (симулация на Монте Карло [MCs]), като използвахме същия набор от последователни алфа ъгли на всеки тръбен път (измерен между всички последователни сегменти). Тази произволно генерирана пътека с идентичен набор от алфа ъгли и рандомизирани бета ъгли. (c) Графики на цигулка на глобалното разпределение на бета ъглите и резултата от MCs в проксималния тубул (PT), тънък край (TL) на примката на Хенле, дебел възходящ край (TAL) на примката на Хенле, дистален извит тубул ( DCT) и съединителен тубул (CNT). MCs, P <>

ДИСКУСИЯ

Традиционните хистологични методи са ограничени в способността си да откриват патологични промени, които засягат общата форма на нефроните. Тук представяме мощен подход, базиран на изчистване на тъкани, който има потенциала да адресира решаващи въпроси относно архитектурата на бъбреците с безпрецедентни пространствени детайли при нормални и патологични условия. Нашите резултати потвърдиха съществуването на 3 вида нефрони, които се различават по своето местоположение, форма и размер, в съответствие с техните функционални специфики. Освен това, ние показахме, че нефроните са склонни да лежат в равнини и да се адаптират към пространствената организация на съдовете. Интригуващо, когато приложихме тази техника към модел накистозна бъбречна болест, наблюдавахме, че кистите се развиват във всички

нефрони, но само в определени сегменти. Интересно е, че ние показахме, че формата на кистата варира в зависимост от сегмента на нефрона и че по протежение на същия нефрон кистите се интеркалират с нормални неразширени тубули. Като цяло, тези резултати предоставят първата 3D характеристика на пространственото разположение на нефроните и съдовете и, което е важно, предоставят основата за разбиране на патологичен процес, като цистогенеза.

Оптичното изчистване на бъбреците е предизвикателство поради високите нива на автофлуоресценция и клетъчна плътност. Чрез сравняване на различни протоколи за изчистване, ние идентифицирахме в BABB мощна техника за реализиране на визуализация и реконструкция на структури, разположени в най-дълбоката част набъбрек, тоест медулата. Освен това BABB е бърз и мащабируем и след изчистване пробите могат да се съхраняват месеци преди получаване на изображение. Друго основно предимство на тази техника е ниската цена. Изчистващите агенти могат да доведат до свиване или уголемяване на структурите.9–17 Въпреки това, тъй като тези модификации на размера на бъбрека са изотропни, не се очаква относителните измервания да бъдат засегнати или да променят интерпретацията им. Едно от най-важните ограничения е анотирането на структури, което отнема много време. Въпреки това, има нарастващ брой техники, базирани на дълбоко обучение, които трябва бързо да преодолеят това ограничение.

В съответствие с резултатите, получени чрез класически техники, нашето изследване показа, че нефроните се различават по своята форма и дължина според позицията си. По-специално, ние наблюдавахме, че JN имат по-развити извити PT и по-големи гломерули и са 2 пъти по-дълги от SN. Увеличената дължина е резултат от хармоничен процес, тъй като удължаването засяга пропорционално всички сегменти на нефрона. Ние също така наблюдавахме, че JN имат по-голям HL. Като цяло тези данни ясно показват, че микроанатомията на SNs и JNs е значително различна и че MNs показват междинни характеристики. Интересното е, че физиологичните изследвания показват, че нефроните също са функционално различни.2 Морфогенетичните събития, които са в основата на тези различия, все още не са известни. Следователно е изкушаващо да се спекулира, че конкретната структура на JNs може да обясни спецификата на техните функции.

Интересното е, че като предоставихме за първи път 3D реконструкция на нефрони и заобикалящите ги съдове, ние открихме пространствено ограничение между дъговидните съдове и подгрупа от нефрони. Следователно е възможно да се мисли, че съдовете могат да диктуват пътянефронисе удължават по време на развитието.34,35 Проверката на 3D формите на нефроните, съчетана с изчислителни симулации, също разкри, че нефроните никога не се смесват и че всеки нефрон има тенденция да лежи в равнина. Функционалното значение на това наблюдение остава да бъде изяснено.

Развитие на кисти по време наполикистоза на бъбрецитевсе още е интригуващ процес. NPHP, патологично състояние, характеризиращо се с развитие на кисти, е най-честото генетично заболяване, причиняващо краен стадий на бъбречно заболяване при деца и юноши. Досега са идентифицирани двадесет NPHP гена.36 Сред тях NEK8 кодира член на фамилията кинази, свързани никога с митоза А, която играе роля във функцията на ресничките и прогресията на клетъчния цикъл.37 Nek8 първоначално се характеризира като ген, мутирал в jck мишки.32 Трябва да се отбележи, че е доказано, че мутация в същия протеинов домейн води до NPHP9 при хора.38 2D проучвания показват, че развитието на кисти драстично се различава при различните форми на поликистозно бъбречно заболяване.27,29 По-специално , при NPHP изглежда, че кистите произлизат изключително от CD и DCT.31 Въпреки че са информативни, тези имунохистохимични изследвания не могат да оспорят възможността, че загубата на специфични тубулни маркери39 изкуствено обяснява това наблюдение. По този начин нашето 3D изследване предоставя първото ясно доказателство, че развитието на кистата е процес, който може да включва само специфични сегменти на нефрона. Интересно е, че въпреки че свързаната с NIMA (Никога в митоза ген А) киназа 8 (NEK8) се експресира в цитоплазмата на всички сегменти на нефрона, нейната експресия в ресничките е ограничена до DCT и CD. Тъй като само тези сегменти са склонни да развиват кисти,31 можем да приемем, че нарушаването на цилиарната функция на NEK8 е решаващото събитие за образуването на кисти. Интересно е, че също така наблюдавахме, че фузиформените кисти са в непрекъснатост с нормалните неразширени тубули. Фактът, че рецесивна мутация на зародишната линия води до патологичен фенотип само в подгрупа от клетки, предполага, че второ събитие може да предизвика развитие на кисти в тези клетки, както се предполага за автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците.40,41

Ние също така наблюдавахме, че разширяването на кистата е по-доминиращо в JNs, отколкото в SNs, поне като се имат предвид кистите, които се намират между PT и CNT. Последователно се съобщава, че в контекста на гломерулосклерозата гломерулните лезии се откриват по-често при JNs, отколкото при SNs.1,21,42 Дали прекомерна работа поради увеличенотонефронскоростта на гломерулна фифилтрация и транспортните/ензимните активности обясняват повишената чувствителност на JNs към влошаване е интересна хипотеза, която заслужава допълнително изследване.

В обобщение, ние описваме нова техника за изобразяване на бъбреците в 3D с достатъчна молекулярна специфичност и разделителна способност за директно записване на пространственото и количествено разпределение на специфично маркирани вътрешни структури (нефрони, съдове и кисти). Като се има предвид удобството, скоростта и способността за директно количествено определяне, ние очакваме, че тази техника ще се превърне в мощен инструмент за разбиране на патофизиологията на бъбреците.

Фигура 6|Триизмерната (3D) реконструкция на нефрона разкрива, че кистите се развиват само в специфични сегменти на нефрона. ( а ) Представителни 3D изображения с изобразяване на обема на кистата на цял нефрон (леви панели) от гломерули до събирателен канал в повърхностния кортекс (син), средния кортекс (зелен) и юкстамедуларна област (червен) в jck мишки. Сегментиране на нефрони (десни панели) за 3 различни типа нефрони. Ширина ¼ 150 мм. ( b ) Вероятност за развитие на кисти в различните сегменти на нефрона при jck мишки. (Продължение)

Фигура 6|(Продължение) Хоризонталната ос е нормализирана дължина на нефроните, съответстваща на 50 бина (проксимален тубул [PT], тюркоазен; бримка на Хенле [HL], бял; дистален извит тубул [DCT], розов; свързващ тубул [CNT], жълт) . (c) Представителни 3D изображения на реконструкция на кисти с изобразяване на обема на кистата на възходящия крайник на HL (леви панели), DCT (средни панели) и CNT и кортикални събирателни канали (CCD) (десни панели) в повърхностни (горни панели), средни (средни панели) и юкстамедуларни (долни панели) нефрони в jck мишки. Ширина ¼ 50 мм.

МЕТОДИ

Животни

Всички процедури за животни бяха одобрени от "Ветеринарните служби на Префектурата на полицията в Париж" и от етичния комитет на Université Paris Descartes. Двумесечни FVB/N мишки (n=20) бяха използвани за създаване на експериментални условия за изчистване на бъбреците. След това изследването е проведено в 2-седмични jck мъжки мишки (n=4) и контролни котила (n=3).

Подготовка на бъбречни тъкани

Преди умъртвяването мишките се перфузират чрез интракардиална катетеризация с 25 ml хепаринизиран физиологичен разтвор (1000 IU/l), последван от 75 ml 4 процента параформалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Експериментите бяха проведени под анестезия с ксилазин (Rompun 2 процента, Bayer, Leverkusen, Германия, 6 mg/g телесно тегло) и кетамин (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Франция, 120 mg/g телесно тегло).

За проучвания за изчистване, бъбреците се фиксират в 4 процента параформалдехид за 4 часа и се поставят в 4 процента агароза и срезове с дебелина 1 5- mm, заобикалящи бъбречния хилус, се нарязват и съхраняват в PBS при 4 °C.Бъбречни секциипърво бяха оцветени и след това изчистени.

За имунохистохимични изследвания на тънки срезове,бъбрецибяха фиксирани в 4 процента параформалдехид за една нощ и бяха изрязани вградени в парафин и 4- mm срезове.

Оцветяване

Периодна киселина – оцветяване по Шиф. 15-mm бъбречни срезове се инкубират в чиста или 1:100 PBS-разредена периодична киселина-Шиф за 5 минути при стайна температура преди избистряне.

Имунохистохимия върху тънки парафинови срезове. Четири микрометрови срезове от вградени в парафин бъбреци се нагряват за извличане на антиген и се инкубират за една нощ при 4 °C с флуорохром-свързани лектини за проследяване на тубулите (родамин фъстъчен аглутинин [RL-1072-5] и родамин аглутинин от пшеничен зародиш [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Бърлингейм, Калифорния, разредено в съотношение 1:200) и специфично за сегмент първично антитяло за изобразяване на отделни тубулни сегменти (биотинилиран Lotus tetragonolobus лектин [B-1325], Vector Laboratories, разреден в 1: 100; миши анти-Calbindin D28K [D-4], Санта Круз, Хайделберг, Германия, разреден при 1:200; кози анти AQP2 [C-17], Санта Круз, разреден при 1:200) . На следващия ден срезовете се инкубират с вторичното антитяло за 1 час при стайна температура (Alexa Fluor 488 конюгат [S32354], Invitrogen; антикози Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; анти-миши Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Карлсбад, Калифорния; всички разредени при 1:500) преди да бъдат оцветени с 40,6-диамидино-2-фенилиндол. Всички изображения са получени с микроскоп Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Франция) и са подготвени с помощта на софтуер FiJi (версия 1.50).

Оцветяване с лектин върху дебели срезове. Бъбречните срезове с дебелина 1.5-mm се инкубират при 4°C в продължение на 1 месец в Texas Red или свързани с лектини с флуоресцеин изотиоцианат: фъстъчен аглутинин (RL-1072-5) и аглутинин от пшеничен зародиш (RL{{6} }), разреден при 1:100 в 0,1 процента PBS азид и 0,1 процента Triton-X. След това срезовете се промиват всеки ден в продължение на 2 седмици с PBS преди изчистване.

Оптично изчистване

За изчистване на котлен камък, 15-mm бъбречни срезове се инкубират в ScaleA2 (4 M урея, 0.1 процента Triton X-100, 10 процента глицерол) или ScaleB4 (8 M урея, 0,1 процента Triton X -100) за 2 седмици, до 1 година, при 4 C.

За изчистване на BABB, 15-mm бъбречни срезове се дехидратират в последователни изплаквания с етанол при стайна температура. След това пробите се инкубират в BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) в съотношение 1:2 за най-малко 2 дни при 4 °C.

Получаване на изображения с двуфотонна микроскопия

Тъканите се изобразяват с воден гел върху обърнат мултифотонен микроскоп (LaVision BioTec), оборудван с Mai Tai HP титаниево-сапфирен лазер (Spectra-Physics, Санта Клара, Калифорния) (допълнителна фигура S1A). Дължината на вълната на възбуждане е 815 nm при 8 процента мощност. Използвахме 20 обектив за потапяне във вода (XLUMPLFL20XW, Olympus [Токио, Япония]; цифрова апертура, 0,95; работно разстояние, 2,0 mm). За получаване на флуоресценция използвахме детектор без десканиране при 80 процента с лентов филтър 593/40 nm.

Първата стъпка се състоеше от придобиване на 2D мозаечно изображение в средния z стек чрез използване на неоптимални параметри за придобиване (400 mm 400 mm и 1011 1011 пиксела, с 10 процента припокриване и осредняване на линия при 2), за да ръководи избора на най-подходящите централни полета (Допълнителна фигура S9A). След като xy решетката и z полетата, представляващи интерес, бяха дефинирани, параметрите бяха коригирани за получаване на висококачествени изображения. Такъв подход намали интересния регион до 5 12 fifields на z стек. След това получихме 850 z купчини/оптични срезове (1- mm размер на стъпката), заобикалящи бъбречния хилус в средната част набъбречна секция.

Сшиване на изображения, обработка и проследяване

Всеки стек беше подреден според метода, разработен от Preibisch et al., 43 който позволява свързването на голяма колекция от изображения чрез използване на приставката „Grid/Collection stitching“ на софтуера на Фиджи (http://fifiji.sc/Fiji) . Тъй като наблюдавахме важна промяна между 2 съседни изображения след съшиването, ние написахме програма за персонализирано съвпадение на Python. Тази програма компенсира изместването на изображението, което ни позволява да подравним правилно изображенията (допълнителна фигура S9B). Свързани-коригирани изображения бяха анализирани с помощта на Imaris версия 8.4.2 (Bitplane, Цюрих, Швейцария). Тубулите и съдовете бяха проследени с помощта на ръчния режим на пакета за проследяване на нишки на Imaris и обединени от Imaris Xtension, който разработихме с MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Присъединете се{{12 }} Нишка_Tool.zip?dl¼0) (допълнителна фигура S9C). Гломерулите и кистите бяха 3D реконструирани с помощта на ръчния режим на повърхностния пакет на Imaris. 3D пространствената организация на гломерулите беше показана с помощта на ръчния режим на пакета за петна на Imaris.

Морфометрия

Дължината на тубуларния сегмент, дължината на нефрона и правотата бяха определени с помощта на пакета за проследяване на филамент на Imaris. Според софтуера Imaris праволинейността се определя количествено като съотношението между разстоянието между 2 точки и дължината на пътя на сегмента на нефрона. Тридесет и един PTs и 12 цели нефрона бяха реконструирани и измерени в 3 мишки от див тип, докато 37 PTs и 17 цели нефрони бяха реконструирани и измерени в 4 jck мишки. Киста и

гломерулните обеми се определят с помощта на "повърхностния пакет" на Imaris. Тридесет и един и 34 гломерули бяха измерени съответно в див тип и jck мишки. Измерени са общо седемдесет и четири кисти.

Ъглите "извън равнината" на тръбните завои (означени като "бета") бяха измерени между равнината (дефинирана от 3 последователни точки) и посоката със следващата последователна четвърта точка в пространството (Фигура 5b). За да оценим статистическата значимост на наблюдаваното отклонение, ние симулирахме разпределението на бета ъгли с произволна ротация на бета ъгли (симулация на Монте Карло) в структури, които бяха съставени от едни и същи сегменти със същия набор от алфа ъгли.

За изчисляване на вероятността да се развие кистозна лезиянефронсегменти, представихме всеки нефрон чрез набор от точки в пространството. Всяка точка беше анотирана по отношение на наличието на киста спрямо нормалната структура и вида на сегмента. Вероятността за всяка стандартизирана дължина (настроена на 50 контейнера) се изчислява като съотношението между броя на точките с кистозна анотация и общия брой точки в контейнера.

За изчисляване на средното гломерулно междуразстояние, ние взехме предвид за всеки гломерул средното гломерулно междуразстояние, изчислено на най-близките 5 гломерула.

Анализи на данни и статистика

Данните са изразени като средна SEM. Разликите между експерименталните групи бяха оценени с помощта на дисперсионен анализ, последван, когато са значими (P < {{0}}.05),="" от="" теста="" на="" tukey-kramer.="" когато="" са="" сравнени="" само="" 2="" групи,="" е="" използван="" тестът="" на="" ман-уитни.="" статистическите="" анализи="" бяха="" извършени="" с="" помощта="" на="" софтуер="" graph="" prism="" (сан="" диего,="" калифорния,="" версия="">

РАЗКРИВАНЕ

Всички автори декларираха, че нямат конкуриращи се интереси.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим на Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker за техническа помощ. Благодарим на Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler и Nicolas Kuperwasser за критичното четене на ръкописа. Тази работа беше подкрепена от Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Базел) , Швейцария) и Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Париж, Франция).

АВТОРСКИ ПРИНОС

TB, NG и MZ проектираха и проведоха експериментите и анализираха данните. FB, LT, MGT и SG също извършиха някои експерименти и анализираха данните. MB и CN извършиха експериментите с мишки. TB и MZ също допринесоха за написването на ръкописа. GF преработи ръкописа. FT и MP предоставиха концептуалната рамка и проектираха проучването, ръководиха проекта и написаха документа.

Cistanche може да тонизира бъбреците

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителен файл (PDF)

Фигура S1. Експериментална настройка, процедура за получаване и обработка на изображения.

Фигура S2. Граници на автофлуоресцентен сигнал в xy и z резолюции.

Фигура S3. Двуизмерно изображение на прехода между PT и TL върху 4- mm вградени в парафин бъбречни срезове.

Фигура S4. Двуизмерно изображение на прехода между TAL и DCT върху 4- mm вградени в парафин бъбречни срезове.

Фигура S5. Двуизмерно изображение на прехода между DCT и CNT върху 4- mm вградени в парафин бъбречни срезове.

Фигура S6. Триизмерната реконструкция разкрива 3 различни форми на проксималните тубули.

Фигура S7. Триизмерната реконструкция разкрива, че дължината и сегментацията на нефроните не се влияят от кисти.

Фигура S8. Плътност на гломерулите в контролните и кистозни бъбреци.

Фигура S9. Процедура за получаване и последваща обработка на изображения.

Таблица S1. Сравнение на методите за клиринг. Допълнителен файл (филми)

Филм S1. Оцветяването с лектин значително подобрява разделителната способност и съотношението сигнал/фон.

Филм S2. Проследяване на пътя на тубула.

Филм S3. Триизмерна реконструкция на изчистен бъбрек, показваща връзката между проксималния тубул и тънкия крайник на бримката на Хенле.

Филм S4. Триизмерна реконструкция на изчистен бъбрек, показваща връзката между дебелия възходящ край на примката на Хенле и дисталния извит тубул.

Филм S5. Триизмерна реконструкция на изчистен бъбрек, показваща връзката между дисталния извит тубул и свързващия тубул.

Филм S6. Формата и размерът на проксималните тубули се различават в зависимост от тяхната дълбочина.

Филм S7. Триизмерна реконструкция на нефрон в контролни мишки.

Филм S8. Проследяване на пътя на съд от дъгообразен съд до кортикален радиационен съд.

Филм S9. Аркуатните съдове моделират формата на юкстамедуларните проксимални тубули.

Филм S10. Нефроните са склонни да лежат в равнина.

Филм S11. Триизмерната реконструкция на нефрона показва специфичен модел за развитие на кисти.

Филм S12. Триизмерното сегментиране на нефрона разкрива, че кистите се развиват в специфични сегменти на нефрона.

Филм S13. Пространствено разположение и взаимовръзка на нефроните и съдовете при поликистозен бъбрек

ПРЕПРАТКИ

1. Богат AR. Неописана досега уязвимост на юкстамедуларните гломерули при липоидна нефроза. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957; 100: 173-186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Хетерогенност на анатомията на нефрона. Kidney Int Suppl. 1987; 20: S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. Триизмерна реконструкция на нефрона на плъх. Am J Physiol Physiol. 2014; 306: F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB и др. Цифрова триизмерна реконструкция и ултраструктура на проксималния тубул на мишката. J Am Soc Nephrol. 2003; 14: 611-619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Триизмерна реконструкция на нефрона на мишката. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 77-88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Сега можем да видим ясно: оптичен клиринг и бъбречна морфометрия. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017; 26: 179-186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Техники за изчистване и етикетиране на големи биологични тъкани. Mol клетки. 2016; 39: 439-446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Лайпциг, Германия: S. Hierzel; 1914 г.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Мащаб: химичен подход за FL флуоресцентно изобразяване и реконструкция на прозрачен мозък на мишка. Nat Neurosci. 2011; 14: 1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Триизмерно изображение на изчистени от разтворител органи с помощта на 3DISCO. Nat Protoc. 2012; 7: 1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: метод за почистване без детергент и разтворител за невронни и неневронни тъкани. развитие. 2013; 140: 1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Оптично изчистване на фиксирани мозъчни проби с помощта на SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014; 66: 2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY за картографиране на нервната система. Nat методи. 2013; 10: 508-513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY за бързо изобразяване с висока разделителна способност на непокътнати тъкани. Nat Protoc. 2014; 9: 1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP и др. Едноклетъчно фенотипиране в прозрачна непокътната тъкан чрез изчистване на цялото тяло. клетка. 2014; 158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Изобразяване на цял мозък с разделителна способност на една клетка, използвайки химически коктейли и изчислителен анализ. клетка. 2014; 157: 726-739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Томографско молекулярно изобразяване и 3D количествено определяне в органите на възрастни мишки. Nat методи. 2007; 4: 31-33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP и др. Многофотонна микроскопия на изчистени органи на мишка. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ и др. iDISCO: прост, бърз метод за имуномаркиране на големи тъканни проби за обемно изобразяване. клетка. 2014; 159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Подобрено приложение на технологията за електрофоретично изчистване на тъкани, CLARITY, към непокътнати твърди органи, включително мозък, панкреас, черен дроб, бъбрек, бял дроб и черва. BMC Dev Biol. 2014; 14: 1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Повишеното гломерулно капилярно налягане и размер медиират гломерулосклероза в SHR юкстамедуларния кортекс. Am J Physiol Physiol. 1998; 274: F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Изобразяване на бъбрека: от светлина до микроскопия със супер разделителна способност. Трансплантация на Nephrol Dial. 2021; 36: 19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Валидиране на триизмерен метод за преброяване и оразмеряване на подоцити в цели гломерули. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 3093-3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Роля на триизмерната архитектура в механизма за концентриране на урината на бъбречната вътрешна медула на плъх. Am J Physiol Physiol. 2008; 295: F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Оптичното изчистване в бъбрека разкрива медиирано от калий ремоделиране на тубулите. Cell Rep. 2018; 25: 2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Комбинираното структурно и функционално изобразяване на бъбрека разкрива големи аксиални разлики в ендоцитозата на проксималните тубули. J Am Soc Nephrol. 2018; 29: 2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9: a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Поликистоза на бъбреците. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.

29. Wilson PD. Поликистоза на бъбреците. N Engl J Med. 2004; 350: 151-164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Промени в модела на гликозилиране по време на ембрионалното развитие на миши бъбрек, както се разкрива с лектинови конюгати. J Histochem Cytochem. 1987; 35: 55-65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Развитие на поликистозна бъбречна болест при млади мишки с кистозни бъбреци: вникване в патогенезата, цилиарни аномалии и общи характеристики с човешкото заболяване. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 2821-2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Дефект в нова киназа от семейство Nek причинява кистозна бъбречна болест при мишката и рибката зебра. развитие. 2002; 129: 5839-5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. Магнитно резонансно Т2 картографиране и дифузионно претеглено изображение за ранно откриване на цистогенеза и отговор на терапия в миши модел на поликистозна бъбречна болест. Kidney Int. 2017; 92: 1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Молекулярни детерминанти на съдовата специализация на нефрона в бъбрека. Nat Commun. 2019; 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Ендотелно-епителна комуникация при поликистозна бъбречна болест: роля на сигнализирането на васкуларен ендотелен растежен фактор. Клетъчен сигнал. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Много гени - една болест? Генетика на нефронофтизата (NPHP) и свързаните с NPHP нарушения. Front Pediatr. 2017; 5: 287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Регулиране на клетъчния цикъл от NEK семейството на протеин кинази. J Cell Sci. 2012; 125: 4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. NEK8 мутациите засягат цилиарната и центрозомалната локализация и могат да причинят нефронофтиза. J Am Soc Nephrol. 2008; 19: 587-592.

39. Wilson PD. Апико-базалната полярност в епитела на поликистозно бъбречно заболяване. Biochim Biophys Acta. 2011; 1812: 1239-1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Токсичното тубулно увреждане в бъбреците от мишки с Pkd1-делеция ускорява цистогенезата, придружена от нерегулирана полярност на планарни клетки и канонични Wnt сигнални пътища. Хум Мол Генет. 2009; 18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Критичен превключвател на развитието определя кинетиката на образуването на бъбречни кисти след загуба на Pkd1. Nat Med. 2007; 13: 1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Механизъм на уникалната чувствителност на дълбоките кортикални гломерули на зреещи бъбреци към тежка фокална гломерулна склероза. Pediatr Res. 1990; 28: 270-276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Глобално оптимално зашиване на получени триизмерни микроскопични изображения с плочки. Биоинформатика. 2009; 25: 1463–1465.