LIMIT е имуногенна LncRNA в имунитета срещу рака и имунотерапията

Резюме

MHC-I представя туморни антигени на CD8+ Т клетки и задейства антитуморен имунитет. Хората може да имат 30,000-60,000 дълги некодиращи РНК (lncRNA). Въпреки това, остава слабо разбрано дали lncRNA могат да повлияят на туморния имунитет. Тук ние идентифицираме LncRNA, способна да индуцира MHC-I и имуногенност на тумор (LIMIT) при хора и мишки. Установихме, че IFN стимулира LIMIT, LIMIT цис-активиран гуанилат свързващ протеин (GBP) генен клъстер и GBPs нарушават връзката между HSP90 и фактора на топлинен шок -1 (HSF1) - като по този начин водят до активиране на HSF1 и транскрипция на MHC-I машини, но не и PD-L1. РНК-насочвано CRISPR активиране на LIMIT повишава GBPs и MHC-I и потенцира туморната имуногенност и терапията с контролни точки.

Заглушаването на LIMIT, GBPs и/или HSF1 намалява MHC-I, нарушава антитуморния имунитет и намалява ефикасността на имунотерапията. Клинично, LIMIT, GBPs- и HSF1-сигналните транскрипти и протеини корелират с MHC-I, тумор-инфилтриращи Т клетки и отговор на блокада на контролна точка при пациенти с рак. Като цяло, ние демонстрираме, че LIMIT е неизвестна преди това ракова имуногенна lncRNA и оста LIMIT-GBP-HSF1 може да бъде целева за имунотерапия на рак.

Ключови думи 

Дълга некодираща РНК; LIMIT; MHC-I; IFN; БРИТАНСКИ ПАУНД; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; Т клетъчен имунитет; имунотерапия на рак

Въведение

Блокирането на контролни точки отприщва медиираната от CD8+ Т клетки имунна сила срещу рака1. Основен комплекс за хистосъвместимост-I (MHC-I) играе ключова роля в CD8+ Т клетъчното праймиране и активиране2. Въпреки това, MHC-I често се регулира надолу в раковите клетки, което води до избягване на имунната система на тумора и резистентност към имунотерапия 3,4. Важно е да се разбере как да се възстанови експресията на туморен MHC-I и да се съживи антитуморният имунен отговор5. LncRNA се появяват бързо заедно с напредъка в дълбокото секвениране на РНК, покривайки много повече локуси в човешкия геном, отколкото гените, кодиращи протеини6. LncRNAs регулират протеин-кодиращите гени на множество нива7-9 и играят централна роля в геномното отпечатване10, клетъчната диференциация11 и прогресията на рака12. Въпреки това, идентичността, начинът на действие, функцията и клиничното значение на специфични lncRNAs в имунитета срещу рак и имунотерапията остават неизвестни. Тук идентифицираме LIMIT като неизвестна преди това, ракова имуногенна lncRNA. LIMIT засяга механизмите на MHC-I и антитуморния имунитет. Установихме, че LIMIT локално се насочва към GBP, като по този начин образува молекулярна каскада от LIMIT-GBP-HSF1-MHC за промяна на антитуморния имунитет и ефикасността на имунотерапията на тумора. Нашата работа не само разкрива неизвестна досега биология на имуногенна lncRNA, LIMIT, но също така предполага, че оста LIMIT-GBP-HSF1 може да бъде целева за имунотерапия на рак.

LIMIT е имуногенна lncRNA

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

За да изследваме неизвестни регулаторни гени в туморния имунитет, въз основа на инфилтрация на туморни CD8+ Т клетки, ние разделихме човешкия меланом (TCGA, SKCM) на типове горещ и студен тумор и анализирахме имуногенни генни корелации. В допълнение към CD8A, IFN и MHC-I (HLA-ABC) транскрипти, ние открихме, че lncRNA кандидат е обогатен в горещия тумор, сред 3926 lncRNA кандидати, анотирани от GENCODE13 (Фиг. 1а; Допълнителна таблица 1). Въз основа на функционални изследвания в следните експерименти, ние определихме този кандидат за lncRNA като LIMIT: lncRNA, индуциращ MHC-I и имуногенност на тумора (LIMIT). В набора от данни за човешки меланом, нивата на LIMIT корелират положително с тези на IFN, MHC-I и CD8 (фиг. 1b-d). В съответствие с това, анализът на обогатяване на набор от гени (GSEA) разкри, че експресията на LIMIT корелира с гените за отговор на IFN, представянето на антиген чрез MHC-I и имунната активация (фиг. 1e-h). Нещо повече, нивата на LIMIT корелират с повишени нива на имунотерапевтичен отговор на контролна точка 14-17 (Фигура 1i) и са свързани с преживяемостта при пациенти с меланом (Фигура 1j). Освен това, експресията на LIMIT корелира с IFN, MHC-I и CD8 при множество видове рак (разширени данни Фиг. 1a-l). По този начин LIMIT е потенциална имуногенна lncRNA.

Ние потвърдихме дали LIMIT е lncRNA. Northern blotting показа, че LIMIT е с дължина приблизително 2 kb в човешки A375 меланомни клетки (фиг. 1k). Приложихме бърза амплификация на сДНК краищата (RACE) и характеризирахме сДНК краищата на LIMIT както в човешки (А375), така и в миши (В16) меланомни клетки (Фиг. 1l, m). След това клонирахме пълната дължина на LIMIT както при хора, така и при мишки и го подравнихме със съответните последователности на генома (Разширени данни Фиг. 2a, b). Човешкият LIMIT е разположен в хромозома 1, с 1967 нуклеотида и 6 екзона (разширени данни, фиг. 2а), докато мишият лимит е разположен в хромозома 3, с 1634 нуклеотида и 7 екзона (разширени данни, фиг. 2b). LIMIT не съдържа валидна последователност на Kozak. Когато приготвихме РНК от ядрени и цитоплазмени фракции на A375 клетки, LIMIT беше открит главно в ядрената фракция (фиг. 1n). По този начин LIMIT няма потенциал за кодиране на протеини. Като цяло LIMIT отговаря на всички критерии, за да бъде дефиниран като lncRNA. По-специално, в локуса LIMIT, кандидат за lncRNA, псевдоген на GBP1 (GBP1P1) е открит в хепатоцелуларен карцином (HCC)18. Въпреки това, LIMIT показа ниски прилики с GBP1P1 или GBP1 (Разширени данни Фиг. 2c, Допълнителна таблица 2). Следователно LIMIT не е GBP1P1. Висока корелация между LIMIT и IFN чувствителния генен подпис (фиг. 1e) предполага, че IFN може да стимулира експресията на LIMIT. Наистина, лечението с IFN индуцира експресията на LIMIT, както е показано чрез Northern blotting (Фиг. 1k) и RNA-seq в A375, HT29, Meijuso и A549 клетки (Фиг. 1o). Въпреки това, лечението с други цитокини, като IFN и TNF, не успя да индуцира LIMIT експресия (Фиг. 1k). Освен това, IFN не успя да индуцира LIMIT в STAT1 нокаутирани (KO) A375 клетки (фиг. 1p). Следователно, LIMIT е неизвестна досега IFN-отзивчива lncRNA както в човешки, така и в миши клетки.

LIMIT увеличава експресията на MHC-I

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

За да изследваме функцията на LIMIT в туморните клетки, ние първо съборихме LIMIT с малки РНК на фиби (shLIMIT). Използвахме инструмента Blast, за да изберем LIMIT shRNA, които нямат кандидати извън целта (допълнителни таблици 3-6). ShLIMIT не е насочен към GBP кодиращи гени (Разширени данни Фиг. 3а). В A375 клетки, shLIMIT потиска LIMIT експресията (Фиг. 2а), но не повлиява фосфорилирането на STAT1 (Фиг. 2b) в отговор на IFN - което предполага, че LIMIT не повлиява глобалното сигнализиране на IFN гена. MHC-I и PD-L1 са целеви гени на IFN19-21. ShLIMIT води до намаляване на експресията на MHC-I (Фигура 2с), но не и на PD-L1 (Разширени данни Фигура 3b), в отговор на IFN стимулация. В съответствие с тези данни за хора, лимитът на заглушаване в миша меланомна клетка YUMM1.7 или клетка на рак на дебелото черво CT26 доведе до намалена експресия на MHC-I в отговор на IFN (фиг. 2d-g). В A375 клетки, shLIMIT повлиява не само MHC-I експресията (HLA-ABC, HLA-E и HLA-F), но и MHC-II експресията (HLA-DRA и HLA-DMA); докато LIMIT не променя друга експресия на IFN сигнализиращ ген (разширени данни Фиг. 3c). По този начин LIMIT участва в регулирането на индуцираната от IFN експресия на MHC-I и MHC-II, без да променя глобалния сигнален път на IFN.

LIMIT е прекъснат ген с големи интрони, заемащ около 17 kb в генома. Не успяхме да нокаутираме локуса LIMIT със сдвоени sgRNA и Cas9. Като се има предвид, че има 5 предвидени STAT1/IRF1 свързващи места в LIMIT промотора, ние проектирахме 4 сдвоени sgRNAs, за да изтрием тези свързващи места в LIMIT промотора (Разширени данни Фиг. 3d). Ние генерирахме A375 клетки с делеция на LIMIT промотор във всичките 4 комбинации от sgRNA. Открихме, че IFN вече не е ефективен за индуциране на експресията на LIMIT и MHC-I в туморни клетки с делеция на LIMIT промотор в сравнение с клетки от див тип (Фиг. 2h, i). Допълнително използвахме РНК-насочвана система за активиране на CRISPR, за да активираме ограничаване на експресията в туморни клетки22. Установихме 4 водещи РНК, насочени към промоторната област на Limit (sgLimit), и ко-експресирани с dCas9-VPR, тристранен транскрипционен активатор, слят с нуклеазно-нулев Cas9, в B16 клетки (Разширени данни Фиг. 4а). Всички 4 sgLimit засилиха експресията на Limit, както и MHC-I (разширени данни Фиг. 4b, c). Когато трансфектирахме B16 клетки с обединени sgLimit и нецелеви sgRNAs (sgNT), sgLimit индуцира експресията на Limit и MHC-I, но не и PD-L1 (фиг. 2j, k). Следователно, Limit селективно е насочен към MHC-I, но не и към PD-L1. Като цяло, експериментите със загуба и усилване на функцията показват, че LIMIT може да промени експресията на 1.5-3 fold-MHC-I в множество ракови клетки при мишки и хора. След това проучихме дали LIMIT-променената MHC-I експресия влияе върху TAA-специфичното CD8+ Т-клетъчно медиирано убиване на тумор in vitro. За тази цел ние първо генетично повалихме B2M със специфични shRNAs в овалбумин (OVA)--експресиращи B16 клетки. shRNA-B2M доведе до 1.5-кратно намаляване на експресията на OVA-H2Kb (разширени данни Фиг. 4d). Когато B16-OVA клетки, носещи shFluc и shB2M, бяха инкубирани с OT-I клетки, ние наблюдавахме намаляване на OT-I медиираното убиване на shB2M-B16-OVA клетки в сравнение със shFluc-B{{63 }}OVA клетки (разширени данни Фиг. 4e-g). Данните предполагат, че 15-3-кратни промени в експресията на MHC-I, контролирана от LIMIT, могат да бъдат функционално релевантни при повлияване на TAA-специфичните CTL дейности. За да потвърдим това, ние активирахме LIMIT в B16-OVA клетки, експресиращи шеллак и shB2M. Както се очаква, CRISPR активирането на LIMIT индуцира минимална MHC-I експресия в shB2M клетки, в сравнение с контролните клетки (Фиг. 2l). Съответно, OT-I клетките медиират минимално убиване на тумор в shB2M-OVA-B16 клетки в сравнение с контролните клетки (Фиг. 2m, n). Данните предполагат, че индуцираната от LIMIT MHC-I експресия е важна за TAA-специфично активиране и функция на Т клетки. Антиген-представящи клетки (APCs), включително макрофаги и дендритни клетки (DCs), експресират MHC-I, представят антигени и активират TAA-специфични Т клетки. Разширихме нашите проучвания от туморни клетки до APC. IFN мощно стимулира ограничаване на експресията в DCs и макрофаги, получени от костен мозък (разширени данни Фиг. 4h, i). Ние трансфектирахме макрофаги с 5'FAM-маркирана siRNA насочваща граница (siLIMIT). Намаляването на LIMIT доведе до по-ниска експресия на MHC-I в отговор на IFN стимулация, в сравнение с контролата (разширени данни Фиг. 4j, k). По този начин LIMIT е lncRNA, отговаряща на IFN, и може да стимулира експресията на MHC-I както в туморни клетки, така и в APC.

LIMIT повишава противотуморния имунитет

Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен

Недостатъчната експресия на MHC-I придава туморно имунно избягване и имунотерапевтична резистентност3. За да разберем ролята на Limit в антитуморните имунни отговори in vivo, ние инокулирахме контролни (shFluc) и Limit-silencing (shLimit) YUMM1.7 туморни клетки в NOD scid c-дефицитни (NSG, имунен дефицит) и див тип C57BL/6 (имунно компетентни) мишки. В сравнение с контролните тумори, туморите на shLimit YUMM1.7 нарастват сравнително при NSG мишки (Фиг. 3а), докато прогресират по-бързо при мишки от див тип (Фиг. 3b). В допълнение, ние инокулирахме shLimit CT26 тумори в див тип BALB/c мишки. Отново, ограничението на заглушаване доведе до засилен растеж на CT26 тумор в имунокомпетентния модел (Фиг. 3с). Данните предполагат, че лимитът на заглушаване може да наруши антитуморния имунитет и да улесни растежа на тумора по имунозависим начин. В подкрепа на това, ние открихме намаляване на CD3+, IFN + и TNF + Т клетки в shLimit YUMM1.7 тумори (фиг. 3d, e). Заедно заглушаването на Limit уврежда антитуморния имунитет. За да се определи експресията на MHC-I и MHC-I: SIINFEKL in vivo, ние установихме YUMM1.7 клетки, стабилно експресиращи OVA (YUMM1.7-OVA) и трансдуцирани с shRNA, насочена към Limit или Fluc. След третиране с IFN, ние открихме намалена повърхностна експресия на OVA-H2Kb в shLimit-YUMM1.7 клетки (разширени данни Фиг. 5а). Ние инокулирахме shLimit YUMM1.7-OVA клетки и shFluc-YUMM1.7-OVA клетки в C57BL/6 мишки. След това дисектирахме туморни тъкани и открихме експресията на H2Db и OVA-H2Kb в туморни клетки. Наблюдавахме намаление на H2Db и OVA-H2Kb в shLimit-YUMM1.7-OVA клетки в сравнение с контролните клетки (разширени данни Фиг. 5b-f). Данните показват, че Limit може да засегне експресията на MHC-I и MHC-I: антиген in vivo. Ние допълнително инокулирахме контролни (sgNT) и лимит-активиращи (sgLimit) B16 клетки в див тип C57/BL6 мишки. Както се очаква, sgLimit (ограничаване на активирането) драстично намалява растежа на тумора (фиг. 3f). Това беше придружено от увеличен брой на инфилтриращи тумора Т клетки и активиране (Фиг. 3g, h). B16 меланомът е сравнително нечувствителен туморен модел към PD-L1 блокада23. В съответствие с това, блокадата на PD-L1 не успя да контролира растежа на тумора на sgNT B16 при мишки. Интересно е, че ограничаване на активирането в B16 тумор с sgLimit сенсибилизиран туморен отговор към PD-L1 блокада, както е показано чрез намалена туморна прогресия (фиг. 3i). Като цяло, Limit потенцира туморния имунитет и сенсибилизира туморния имунотерапевтичен отговор.

LIMIT цис-активира GBP, за да засили MHC-I и туморния имунитет

След това проучихме как LIMIT влияе на MHC-I и туморния имунитет. LncRNA могат локално да регулират експресията на съседни гени24. LIMIT е локализиран близо до генен клъстер, гуанилат-свързващи протеини (GBPs), както в човешки, така и в миши геноми (Разширени данни Фиг. 2a, b). Попитахме дали LIMIT може да регулира изразяването на GBP. Заглушаването на LIMIT намалява нивата на прекурсорни и зрели GBP иРНК (фиг. 4а) и GBP1-5 протеини (фиг. 4b) в човешки A375 клетки в отговор на лечение с IFN. Данните предполагат, че LIMIT може да насърчи транскрипцията на GBP в cis. В подкрепа на тази възможност, заглушаването на Limit също намалява експресията на Gbp2 в миши YUMM1.7 и CT26 клетки (разширени данни Фиг. 6a, b). Освен това, CRISPR активирането на Limit индуцира експресията на Gbp2 в B16 клетки (фиг. 4с). За да проверим дали LIMIT може да транс-регулира GBP, ние принудихме експресията на LIMIT cDNA в A375 клетки. Ние открихме, че GBP1 и множество имунни фактори (включително IRF1, HLA-ABC и PD-L1) са непроменени от LIMIT свръхекспресия (Разширени данни Фиг. 6c). По този начин LIMIT е цис-действаща lncRNA, способна да индуцира експресия на GBP. Сред членовете на семейството на Gbp, Gbp2 е преобладаващ член на семейството на Gbp в миши клетки (разширени данни Фиг. 6d). За да проверим дали LIMIT може да регулира MHC-I чрез GBP, ние създадохме стабилни YUMM1.7 клетки, носещи шеллак, shLimit, shGbp2 или shLimit плюс shGbp2. Ние открихме, че в отговор на IFN стимулация, shLimit и shGbp2 водят до сравнимо намаляване на експресията на Gbp2 и MHC-I; едновременното заглушаване на Limit и Gbp2 не успя допълнително да промени експресията на Gbp2 и MHC-I (фиг. 4d, e). Освен това се чудехме дали свръхекспресията на GBP може да спаси MHC-I експресията на понижено регулиране на MHC-I при ограничаване на събарянето на туморни клетки. Ние принудихме експресията на GBP1 в shLIMIT A375 клетки (GBP1OE) и третирахме тези клетки с IFN. Ние наблюдавахме, че shLIMIT води до намалена експресия на MHC-I в контролни клетки, но не и в GBP1OE клетки (разширени данни Фиг. 6e). Експресията на PD-L1 и IRF1 не се повлиява от shLIMIT или GBP1OE (разширени данни Фиг. 6e, f). Следователно, Limit може да регулира експресията на MHC-I по начин, зависим от GBP. След това инокулирахме YUMM1.7 клетки с Limit и/или Gbp2-заглушаване в C57BL/6 мишки. Заглушаването на Limit и заглушаването на GBP по подобен начин води до по-бърз растеж на тумора в сравнение с контролната група, докато едновременното заглушаване на LIMIT и GBP не повлиява допълнително прогресията на тумора (фиг. 4f). Освен това, ние открихме намаляване на броя на инфилтриращите тумори Т клетки и активиране в shLimit тумори, shGbp2 тумори и shLimit плюс shGbp2 тумори (фиг. 4g и разширени данни, фиг. 6g). Заедно, LIMIT увеличава експресията на MHC-I и туморния имунитет по GBP-зависим начин. GBPs са IFN-реагиращи гени във фибробласти 25 и макрофаги 26 в контекста на защитата на гостоприемника срещу патогени. Въпреки това, ролята на GBP в имунитета срещу рак не е известна. Като се има предвид, че заглушаването на GBP намалява експресията на MHC-I и CD8+ Т клетъчното активиране (фиг. 4g и разширени данни, фиг. 6g), ние предположихме, че GBP може да повлияе на ефикасността на имунотерапията при рак. За да тестваме тази хипотеза, ние заглушихме Gbp2 в MC38 клетки, туморен модел, чувствителен към имунотерапия23. Както се очакваше, заглушаването на Gbp2 в MC38 клетки намалява експресията на MHC-I при лечение с IFN (Фигура 4h) и до голяма степен отменя ефикасността на блокадата на PD-L1 (Фигура 4i). Това, заедно с гореспоменатите данни, предполага участието на LIMIT и GBP в контролирането на ефикасността на имунотерапията при рак. В подкрепа на тази възможност, анализът на клиничните данни разкрива, че високите нива на експресия на GBP корелират с LIMIT, експресията на MHC-I и имунотерапевтичния отговор (разширени данни Фиг. 6h-j) при пациенти с меланом14-17. Освен това, нивата на експресия на GBP са положително свързани с преживяемостта на пациента (разширени данни Фиг. 6k). За да потвърдим дали GBPs са IFN-реагиращи гени в ракови клетки, ние стимулирахме A375 клетки с IFN и други цитокини. GBPs бяха индуцирани от IFN, но минимално повлияни от други имунни цитокини (фиг. 4j). След това използвахме системата CRISPR-Cas9 за насочване към споделените последователности между GBP1-5 и генерирахме GBP1-5 нокаут (KO) A375 клетки (фиг. 4k). Ние наблюдавахме, че IFN слабо стимулира MHC-I генни транскрипти (Фигура 4l) и повърхностни HLA-ABC протеини в GBP KO A375 клетки (Фигура 4m). Следователно, LIMIT цис-активира GBP, за да засили механизма на MHC-I и туморния имунитет.

GBPs активират HSF1, за да стимулират MHC-I и туморния имунитет

За да демонстрираме как GBPs могат да регулират експресията на MHC-I и туморния имунитет, ние принудихме експресията на GBPs в A375 клетки. Интересно е, че свръхекспресията на GBPs повишава човешката MHC-I експресия - както е показано чрез qRT-PCR (Фиг. 5а), оцветяване на повърхността на мембраната (Фиг. 5b) и Western blotting (Фиг. 5c). Данните предполагат, че GBP могат да активират MHC-I на транскрипционно ниво. Последователно, свръхекспресията на Gbp2 повишава експресията на миши MHC-I в YUMM1.7 и B16 клетки (фиг. 5d). За да идентифицираме транскрипционен(и) фактор(и), който регулира MHC-I чрез GBP в отговор на IFN, ние извършихме биоинформатично прогнозиране с PROMO27. Открихме 8 транскрипционни фактора, променени от IFN в A375 клетки, които могат да са насочени към HLA-ABC, HSPA5, CALR и TAP1. Освен няколко добре известни фактора, активността на HSF1 беше силно индуцирана от IFN (разширени данни Фиг. 7а). Чрез обработка на ChIP-seq набори от данни в ENCODE28, ние открихме, че и STAT1, и HSF1 са обогатени в промоторите на MHC-I-асоциирани гени с различни модели на свързване (Разширени данни Фиг. 7b). Извършихме ChIP анализ с анти-HSF1 антитяло в IFN-стимулирани A375 клетки. HSF1 беше обогатен с промоторите на HLA-ABC, HSPA5, CALR и TAP1, но не и HPRT1, отрицателна контрола (фиг. 5е). Резултатите предполагат, че HSF1 е транскрипционен фактор за MHC-I. HSF1 обикновено се активира чрез прекъсване на протеостазата29. За да проверим дали активирането на HSF1 ще подобри експресията на MHC-I, ние третирахме A375 клетки със списък от стресори30: топлинен шок, оксидативен стрес (Luperox), инхибитори на транслацията (пуромицин), протеазома (MG-132) и придружител (17-AAG). Интересното е, че тези стресови фактори универсално стимулират експресията на MHC-I - докато KRIBB11, инхибитор на HSF1, намалява този ефект (фиг. 5f и разширени данни, фиг. 7c). По този начин, активирането на HSF1 обикновено индуцира MHC-I експресия. След това попитахме дали GBP могат да активират HSF1. Принудителната експресия на GBP индуцира луциферазната активност на HSF1 репортер HSE-Luc (Фиг. 5g), както и фосфорилирането на HSF1 (Фиг. 5h). Това предполага, че GBP могат да активират HSF1. IFN не успя да индуцира експресия на HSPA5 в GBP-KO A375 клетки (фиг. 5i). По този начин IFN активира HSF1 чрез индуциране на GBP експресия. Освен това, лечението с KRIBB11, инхибитор на HSF1, отменя регулирането нагоре на MHC-I, медиирано от свръхекспресия на GBP1 (фиг. 5j). Следователно GBP стимулира експресията на MHC-I по HSF1-зависим начин. За да затвърдим механистичната връзка между GBPs и HSF1, ние заглушихме Gbp2 и/или Hsf1 в MC38 клетки (фиг. 5k). При лечение с IFN, заглушаването на Gbp2 или Hsf1 самостоятелно намалява експресията на MHC-I, но едновременното заглушаване на Gbp2 и Hsf1 не успява допълнително да модулира експресията на MHC-I (фиг. 5l). За да демонстрираме функционалното значение на взаимодействието между GBPs и HSF1 в туморния имунитет, ние инокулирахме MC38 туморни клетки, експресиращи шеллак, shGbp2, shHSF1 или shGbp2 плюс shHSF1 в C57BL/6 мишки. В сравнение с контролите на shFluc, заглушаването на Gbp2 и заглушаването на Hsf1 сравнително ускорява растежа на тумора (Фиг. 5m) и намалява броя и активирането на Т клетки, инфилтриращи тумора (Фиг. 5n и Разширени данни, Фиг. 7d). Освен това, едновременното заглушаване на Gbp2 и Hsf1 не успя да повлияе допълнително върху туморния растеж и тумор-инфилтриращите Т клетки (Фиг. 5m, n и Разширени данни Фиг. 7d). Като цяло, GBPs стимулират експресията на MHC-I и антитуморния имунитет чрез активиране на HSF1.

Оста LIMIT-GBP-HSF1 управлява MHC-I и туморния имунитет

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

След това проучихме как GBPs активират HSF1, за да променят експресията на MHC-I и туморния имунитет. При нормални условия мономерният HSF1 се свързва с и се потиска от шаперони, като HSP9031. Прекъсването на тяхното взаимодействие позволява тримеризация и натрупване на HSF1 в ядрото, което води до транскрипционно активиране на неговите целеви гени32. Ние предположихме, че GBP могат да нарушат връзката между HSP90 и HSF1, което води до активиране на HSF1. За да тестваме тази възможност, ние третирахме A375 клетки с IFN и извършихме Co-IP с HSP90 антитяло. Ние открихме, че индуцираните от IFN ендогенни GBP са свързани с HSP90 (фиг. 6а). Освен това, ние трансфектирахме A375 клетки с екзогенен Flag-GBP1 и проведохме Co-IP експеримента с Flag-антитяло. HSP90 беше открит в IP продукта от клетки, трансфектирани с Flag-GBP1, но не и контролни клетки, трансфектирани с вектор (фиг. 6b). Имунофлуоресцентното оцветяване показва, че GBPs и HSP90 са до голяма степен съвместно локализирани в цитоплазмата (фиг. 6с). Когато трансфектирахме 293Т клетки с нарастващи дози от GBP1 плазмиди, HSP90-свързаният HSF1 беше намален по дозозависим начин (фиг. 6d). Данните предполагат, че GBP са взаимодействали с HSP90 и това взаимодействие е нарушило връзката между HSF1 и HSP90. HSP90 е шаперон за многократно сгъване на протеини и стабилност, ние поставихме под въпрос дали GBP могат да променят шаперонната активност на HSP90. Въпреки че инхибиторът на HSP90 потиска експресията на клиентски протеини на HSP90 (като RAF1, BCL2 и CDK433), свръхекспресията на GBP не успява да направи това (фиг. 6е). По този начин GBP взаимодействат с HSP90 и освобождават HSP90-свързан HSF1, но не променят активността на HSP90. След това директно изследвахме ролята на HSF1 в експресията на MHC-I. Ние третирахме A375 клетки с IFN в присъствието на HSF1 инхибитор KRIBB11. Както се очаква, лечението с KRIBB11 намалява IFN-стимулираната mRNA експресия на MHC-I-свързани гени, включително HLA-ABC, TAP1, HSPA5 и CALR, но не и IRF1 (фиг. 6f). Интересното е, че KRIBB11 намалява индуцираната от IFN MHC-I експресия, но има минимален ефект върху експресията на PD-L1 (фиг. 6g). По този начин, HSF1 може да регулира IFN-индуцираната експресия на MHC-I, без да променя глобалното IFN сигнализиране. За да изследваме дали HSF1-регулираният MHC-I е функционален, ние култивирахме B16-OVA с OT-I клетки в присъствието на KRIBB11 и IFN. KRIBB11 инхибира IFN-индуцираната експресия на OVA-свързан MHC-I (разширени данни Фиг. 8а). В съответствие с това, KRIBB11 също потиска OT-I клетъчно-медиираните цитотоксични ефекти върху B16-OVA (разширени данни Фиг. 8b). За да разширим нашите наблюдения до допълнителни тумори, ние заглушихме Hsf1 с shHsf1 в YUMM1.7 и CT26 клетки. Заглушаването на Hsf1 доведе до намалена експресия на MHC-I в YUMM1.7 (фиг. 6h, i) и CT26 клетки (разширени данни, фиг. 8c) в отговор на IFN стимулация. В YUMM1.7 клетки, заглушаването на HSF1 не успя да повлияе на експресията на Gbp2 в отговор на IFN (фиг. 6h), което показва, че Gbp2 не е целеви ген на HSF1. В shHsf1 YUMM1.7 клетки, KRIBB11 не успя да потисне IFN-стимулираната MHC-I експресия (разширени данни Фиг. 8d). Данните предполагат, че HSF1 засилва експресията на MHC-I в отговор на IFN и Hsf1 е механистичната цел на KRIBB11 за регулиране на MHC-I. Като се има предвид, че HSF1 повлиява експресията на MHC-I, ние предположихме, че HSF1 регулира антитуморния имунитет in vivo. За да тестваме тази хипотеза, ние инокулирахме контролни и shHsf1 YUMM1.7 туморни клетки в NSG и C57BL/6 мишки. Ние наблюдавахме, че заглушаването на HSF1 частично забавя прогресията на YUMM1.7 тумора в NSG мишки (фиг. 6j), подкрепяйки, че Hsf1 спомага за поддържането на протеиновата хомеостаза и прогресията на тумора в модела с имунен дефицит. Въпреки това, заглушаването на Hsf1 драстично ускорява растежа на тумора YUMM1.7 в мишки C57BL/6 от див тип (фиг. 6k). Данните показват, че Hsf1 може изненадващо да стимулира мощен антитуморен имунитет в имунокомпетентния модел. В подкрепа на това открихме намаляване на процентите на инфилтриращите тумора CD3+, Ki67+, IFN + и TNF + Т клетки (фиг. 6l и разширени данни, фиг. 8e) в shHsf1 YUMM1.7 тумори в сравнение с shFluc scramble контроли. В допълнение, ние инокулирахме shHsf1 CT26 клетки в див тип BALB/c мишки. Отново, заглушаването на Hsf1 доведе до засилен растеж на CT26 тумор (разширени данни Фиг. 8f). Това беше придружено от намаляване на процентите на тумор-инфилтриращи CD3+, Ki67+, IFN + и TNF + Т клетки (разширени данни Фиг. 8g, h). Като цяло, данните предполагат, че оста GBP-HSF1 управлява експресията на MHC-I и антитуморния имунитет. За да свържем механично Hsf1 и LIMIT, ние заглушихме LIMIT в A375 клетки. Заглушаването на LIMIT намалява транскрипционната активност на HSF1 в отговор на IFN, както е определено чрез луциферазен репортерен анализ (HSE-luc) (Фиг. 6m). Данните предполагат, че LIMIT допринася за активирането на HSF1 в отговор на IFN. За да тестваме потенциално участие на HSF1 в LIMIT-медиирана индукция на MHC-I, ние стимулирахме LIMIT чрез CRISPR активиране в B16 клетки, в присъствието на KRIBB11. Ние наблюдавахме, че регулирането на MHC-I, индуцирано от LIMIT-активиране, беше отменено от инхибитор на HSF1 (фиг. 6n). Данните предполагат, че LIMIT засилва експресията на MHC-I по HSF1-зависим начин. И накрая, анализирахме връзка между LIMIT, GBPs и HSF1 в контекста на експресията на MHC-I, туморния имунитет и имунотерапията при пациенти с рак. Клиничният анализ показа, че HSF1-сигналните гени корелират с експресията на MHC-I, CD8+ Т клетъчна инфилтрация и преживяемостта на пациента (разширени данни Фиг. 9a-c). В проучване за блокада на имунна контролна точка при пациенти с базалноклетъчен карцином34, едноклетъчен РНК-секвениращ анализ разкрива 2 туморни клъстера; един туморен клъстер е по-чувствителен към лечение с анти-PD-1, както се вижда от значително намалена туморна популация (разширени данни Фиг. 9d). Интересното е, че този чувствителен към имунен контролен пункт туморен клъстер експресира по-високи нива на HSF1-сигнални гени, както и MHC-I генен механизъм (Разширени данни Фиг. 9e). Нещо повече, в проучване за блокада на имунна контролна точка при пациенти с меланом35, протеомичният анализ демонстрира, че протеиновата експресия на GBPs, HSF1 сигнални гени и MHC-I е по-висока при клинично отговорилите, отколкото при тези, които не реагират (Разширени данни Фиг. 9f). Освен това, ние наблюдавахме положителна корелация между GBP1 и HSF1-сигналните гени при човешки рак (Разширени данни Фиг. 9g). Данните подкрепят, че оста LIMIT-GBP-HSF1 може да активира експресията на MHC-I и да благоприятства антитуморния имунитет (Разширени данни Фиг. 10).

Дискусия

Китайска билка растение цистанче-Противотуморно

Хората имат 30,000-60,000 lncRNA. Въпреки това, идентичностите и биологичните функции на огромното мнозинство от тези потенциални lncRNA остават слабо разбрани. В областта на биологията на рака, lncRNAs са изследвани до голяма степен в модела с имунен дефицит, оставяйки празнина в знанията за lncRNAs в контекста на имунната система. Съобщава се, че няколко lncRNA засягат функцията на имунните клетки36,37, прогресията на рака и ефикасността на химиотерапията38,39. Въпреки това, дали специфични lncRNAs участват в противотуморния имунитет и имунотерапевтичния отговор остава без отговор. В настоящото изследване ние установихме, че LIMIT е нехарактеризирана преди това IFN-отзивчива lncRNA както в човешки, така и в миши клетки. LIMIT може да индуцира експресия на MHC-I и MHC-II, насърчавайки медиирания от Т клетки туморен имунен отговор и повишавайки ефикасността на имунотерапията. По този начин LIMIT е неизвестна преди това туморна имуногенна lncRNA. IFN сигнализиращият път играе ключова роля в определянето на терапевтичния отговор към имунотерапията на рака40 чрез множество механизми19,20,41,42. Генетичните мутации в сигналните гени за IFN допринасят за резистентност към блокиране на контролни точки при пациенти с рак43-48. Въпреки това, сигнализирането на IFN може да индуцира инхибиторна експресия на PD-L149. Следователно, идеално е да се идентифицира и насочи ключов IFN-сигнален ген, който селективно медиира антитуморния имунитет, а не избягването на туморния имунитет. В съответствие с тази представа, ние демонстрираме, че LIMIT медиира MHC-I и MHC-II регулиране нагоре, но не засяга експресията на PD-L1 в отговор на IFN. По този начин LIMIT може да бъде уникално позициониран да бъде имуногенна цел за имунотерапия на рак. Предложени са няколко стратегии за терапевтично насочване към патогенни lncRNA50. Въпреки това, как да се повишат нивата на полезните lncRNAs остава предизвикателство. Тъй като цис-действащите lncRNAs функционират локално, принудителната експресия на тези lncRNAs може да не е в състояние да локализира точно51. Докато транс-действащите lncRNAs могат да функционират чрез специфични вторични структури, свръхекспресията на тези lncRNAs може да не е в състояние да генерира техните естествени структури поради липсващи подходящи РНК шаперони52. Чрез използване на РНК-насочвана стратегия за активиране на CRISPR22, ние директно активирахме експресията на LIMIT в туморни клетки в предклинични модели. РНК-насочваното активиране на CRISPR LIMIT може да стимулира експресията на MHC-I на тумора и да потенцира терапията с блокада на контролни точки. Като се има предвид, че загубата на MHC-I и IFN генни сигнатури често се случва в човешки тумори, ние предполагаме, че CRISPR активирането на полезни lncRNAs, като LIMIT, може да спаси туморната MHC-I експресия и да бъде потенциален терапевтичен подход. Докато търсихме механизма, чрез който LIMIT засяга туморния имунитет, ние изяснихме, че LIMIT е насочен към GBP по цис начин. GBP играят роля във вродения имунитет26,53,54. Мишки, на които липсва целият клъстер от Gbps, проявяват слаб отговор срещу Toxoplasma gondii55. Въпреки това, преди нашата работа, механистичната връзка между LIMIT и GBP и биологичната функция на GBP в туморния имунитет и имунотерапията бяха неопределени. Ние открихме, че GBPs са необходими за индуцирана от IFN туморна MHC-I експресия, ефективност на убиване на CD8+ Т клетки и ефективна терапия на контролни точки. Данните предполагат, че GBP са потенциални целеви гени за повишаване на имуногенността на тумора. Неочаквано открихме, че GBPs активират HSF1, за да стимулират MHC-I и свързаната с MHC-I генна експресия. Активирането на HSF1, медиирано от инхибитори на HSP90, корелира с контрола на тумора в имунокомпетентни модели. Въпреки това, въпреки многобройните клинични изпитвания с инхибитори на HSP90, досега нито един от оценените инхибитори на HSP90 не е одобрен от FDA за лечение на рак. Този разочароващ факт повдига възможността инхибиторите на HSP90 да са вредни за туморния имунитет. Токсичността на тези инхибитори на HSP90 може да насърчи разрушаването на няколко клиентски протеини на HSP90, като RAF1 и BCL2, които могат да бъдат критични за пролиферацията на ефекторните Т клетки и оцеляването59,60. Като се има предвид, че GBPs взаимодействат с HSP90 и освобождават примамения от HSP90-HSF1, но не променят активността на HSP90, нашите данни предполагат, че насочването към GBPs може да бъде неоценена преди това и безопасна стратегия за активиране на HSF1 за имунотерапия на рак. В обобщение, ние идентифицираме LIMIT като неизвестна преди това ракова имуногенна lncRNA. Нашата работа предполага, че насочването към сигналната ос LIMIT-GBP-HSF1 може да спаси експресията и функцията на MHC-I, представяйки обещаващ имунотерапевтичен подход при рак.

Методи

Експерименти с животни

Женски NSG на възраст от шест до осем седмици (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651) и OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) мишки са получени от Jackson Laboratory. Всички мишки се поддържат при условия без патогени. Стаята за животни има контролирана температура (18-23 градуса), влажност (40-60%) и цикъл 12 светлина/12 тъмнина. YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2.5 × 106) и B16 (1 × 105) клетки бяха инжектирани подкожно в десния хълбок на мишките. За лечение с анти-PD-L1 в модела MC38, 5 mg/kg анти-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) и контролно антитяло (InVivoMAb, LTF-2) бяха приложени интраперитонеално на дни 6, 9, и 12 инокулация след тумор. За лечение с анти-PD-L1 в модел B16, 5 mg/kg анти-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) и контролно антитяло (InVivoMAb, LTF-2) бяха приложени интраперитонеално на ден 0, 3, 6, 9, 12 и 15 инокулация след тумор. Диаметрите на тумора се измерват с помощта на дебеломер. Обемът на тумора се изчислява чрез дължина × ширина × ширина/2. Изследванията върху животни са проведени с одобрението на Комитета за институционална грижа и използване на животните към Университета на Мичиган (PRO00008278). Проучването е в съответствие с всички съответни етични разпоредби относно изследванията върху животни. В нито един от експериментите размерът на ксенотрансплантирания тумор не надвишава 2 cm в което и да е измерение и нито едно животно не е имало силно коремно раздуване (по-голямо или равно на 10% първоначално увеличение на телесното тегло). Размерът на извадката е избран въз основа на предварителни данни. След инокулация на тумор, мишките бяха рандомизирани и разпределени в различни групи за лечение.

Реактиви

KRIBB11 и 17-AAG са закупени от Cayman Chemical. MG-132, Puromycin и Luperox бяха от Sigma-Aldrich. Рекомбинантен човешки IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) и миши IFN (485-MI) са от R&D.

Плазмиди

За генериране на HSE-LUC, ДНК последователностите, съответстващи на елементите на топлинен шок (HSE), бяха синтезирани, закалени и лигирани в PGL3-основен (Promega) плазмид. FLAG-HSF1 беше подарък от Stuart Calderwood (Addgene #32537). За принудителна експресия на човешки GBP1, GBP2, GBP5 и миши Gbp2, съответните кодиращи последователности бяха PCR амплифицирани от cDNA, генерирана от IFN предварително третирани A375 клетки или B16 клетки и впоследствие вмъкнати в PCI-Flag плазмид. PCI-Flag плазмидът се приготвя чрез вмъкване на следната последователност на Kozak плюс Flag tag плюс 5 × глицинова последователност в PCI-neo (Promega) плазмид между NheI и XhoI. За да се съборят човешки LIMIT и миши LIMIT, shRNA бяха проектирани и вмъкнати в PLKO.1 плазмид (Addgene #10879). shRNA, насочена към луцифераза на светулка (shFluc), служи като отрицателна контрола. За насочване към промоторната област на Limit за активиране на CRISPR, sgRNAs (sgLimit) бяха проектирани и вмъкнати в phU6- sgRNA плазмид (Addgene #53188). Ненасочената sgRNA (sgNT) служи като отрицателна контрола. За изтриване на STAT1/IRF1 свързващите места в LIMIT промотора, сдвоени sgRNAs (psgLIMIT) бяха проектирани и вмъкнати в PX459 плазмида (Addgene #48139). За да се унищожат миши Hsf1 и Gbp2, shRNA бяха проектирани и вмъкнати в PLKO.1 плазмид (Addgene #10879). За да нокаутира GBP1-5, sgRNA е проектирана и вмъкната в плазмида PX459 (Addgene #48139). Целевите последователности са изброени в Допълнителна таблица 7. Праймерните последователности са изброени в Допълнителна таблица 8.

Клетъчна култура

Човешка меланомна клетъчна линия A375 (CRL-1619), миши меланомни клетъчни линии, B16-F0 (CRL-6322) и YUMM1.7 (CRL-3362 ), клетъчна линия на миши рак на дебелото черво CT26 (CRL-2638) и 293T (CRL-3216) са закупени от American Type Culture Collection (ATCC). Клетъчна линия MC38 на миши рак на дебелото черво беше използвана преди това в лабораторията Zou 23, 48. B16- OVA клетки бяха установени, както беше съобщено по-рано42. A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO и A375 LIMIT клетъчни линии с делеция на промотор бяха генерирани в това проучване. Всички клетъчни линии бяха тествани рутинно за заразяване с микоплазма и потвърдено отрицателно за микоплазма. Клетките се култивират в RMPI среда (Gibco #11875), допълнена с 10% FBS, с изключение на A375 и 293T клетки, последните 2 линии се култивират в DMEM (Gibco #11965), допълнена с 10% FBS. Всички клетки се поддържат при 37 градуса и 5% CO2. За топлинен шок клетките се поставят в инкубатор при 43 градуса и 5% CO2 за 2 часа. За генериране на нокдаун клетъчни линии, лентивирусни частици бяха произведени чрез трансфекция на PLKO.1 shRNA плазмид с psPAX2 (Addgene #12260) и pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) в 293T клетки и впоследствие трансдуцирани в туморни клетки с полибрен (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) за една нощ. 48 часа след трансфекцията клетките бяха избрани с пуромицин (1-2 ug/ml) за още 2 седмици. За да се установят нокаутирани клетъчни линии, PX459- sgRNA плазмиди бяха трансфектирани в туморни клетки за 2 дни и селектирани чрез пуромицин (1-2 ug/ml) за допълнителни 2 дни. След това клетките се разреждат серийно и се посяват в 96-ямкови плаки. След 2-3 седмици единичните клетъчни колонии се дисоциират и се поставят отново в плочи с 6 ямки. При сливане на клетки, половината от клетките бяха събрани и валидирани за ефективност на нокаут (KO) чрез Western blotting. За да се приложи системата за активиране на CRISPR за активиране на миши Limit, phU6-sgRNAs бяха трансфектирани заедно със SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) в B16 клетки. Всички трансфекции се провеждат с липофектамин 2000 (Thermofisher) в съотношение 1 ug плазмид: 2 ul трансфекционен регент. Трансфекционната доза се определя чрез титруване.

Анализ на луциферазната активност

A375 клетки бяха трансфектирани с HSE-LUC и PRL-SV40P (Addgene #27163) за 24 часа, заедно с PCI-neo (вектор) или GBP1, GBP2 за 48 часа. A375 shFluc или A375 shLIMIT клетки бяха трансфектирани с HSE-LUC и PRL-SV40P (Addgene #27163) за 24 часа и след това третирани с IFN за допълнителни 48 часа. Луциферазната активност за луцифераза на светулка (HSE-LUC) и ренила луцифераза (PRL-SV40P) се измерва с Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Относителната активност на луцифераза на светулка се нормализира с активност на ренила луцифераза.

Повърхностно оцветяване и анализ на поточна цитометрия (FACS)

Клетките се трипсинизират и се промиват с MACS буфер (PBS, 2%FBS, 1 mM EDTA). Повърхностното оцветяване се извършва чрез добавяне на следните антитела към клетъчната суспензия в 50 ul MACS буфер: анти-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), анти-H2-Db (KH95, BD Biosciences), анти-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), анти-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) и анти-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). След инкубиране в продължение на 30 минути, клетките се промиват с MACS буфер и се анализират на поточен цитометър BD Fortessa.

Количествен PCR (qPCR) анализ

Общата РНК се изолира от клетките чрез колонно пречистване (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) с DNase лечение. cDNA се синтезира с помощта на RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) с произволни хексамерни праймери. Количествен PCR (qPCR) се извършва върху cDNA с помощта на Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) на StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Генната експресия се определя количествено, като се използват праймерите, изброени в допълнителна таблица 8. Кратните промени в експресията на mRNA се изчисляват чрез метода ΔΔCt, използвайки ACTB като ендогенна контрола. Резултатите се изразяват като кратна промяна чрез нормализиране спрямо контролите.

Северна попивателна

Анализът на Northern blot беше извършен с 10 ug общи РНК, получени от IFN, IFN и TNF предварително третирани A375 клетки. РНК бяха разделени чрез денатурираща електрофореза в агарозен гел (Ambion) и прехвърлени към Hybond-XL мембрани (GE Healthcare). LIMIT беше открит с помощта на маркирани с дигоксин ДНК сонди с DIG Northern Starter Kit (Roche). Последователностите на сондата, насочени към LIMIT, са изброени в допълнителна таблица 7.

Бърза амплификация на сДНК краища (RACE)

RACE се извършва за идентифициране на cDNA краищата на човешки LIMIT или миши Limit с SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Праймерите за RACE са изброени в допълнителна таблица 8.

Клонинг на LIMIT в цяла дължина

След получаване на cDNA крайните последователности, LIMIT с пълна дължина беше PCR амплифициран и вмъкнат в PCI-neo плазмид между XhoI и NotI. Клонираните праймери за човешки LIMIT и миши Limit са изброени в допълнителна таблица 8.

Клетъчно фракциониране за RT-PCR

Предварително третирани с IFN A375 клетки се събират от 15 cm плаки чрез изстъргване и се промиват веднъж със студен PBS. Клетките се пелетират чрез центрофугиране при 700 g за 5 минути и се лизират с хипотоничен лизисен буфер (10 mM Tris (рН 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3% (обем/обем) NP{{ 12}}, 10% (об/об) глицерол) за събиране на цитоплазмената фракция. Цитоплазмената РНК се получава чрез утаяване с етанол за една нощ при -20 градуса, последвано от повторна екстракция с помощта на TRIZOL реагент. Останалата ядрена пелета се промива три пъти с хипотоничен лизисен буфер, последвано от екстракция с TRIZOL реагент съгласно инструкциите на производителя. РНК, изолирани от ядрени или цитоплазмени фракции, бяха обратно транскрибирани и RT-PCR за LIMIT с посочените праймери. Несплайсираният или зрял ACTB бяха използвани като контроли за ядрена или цитоплазмена РНК. Праймерите за ACTB са изброени в допълнителна таблица 8.

Западно попиване

Клетките се промиват в студен PBS и се лизират в 1 × RIPA лизисен буфер (Pierce) с 1 × протеазен инхибитор (Pierce). Лизатите се инкубират върху лед за 10 минути и се изчистват чрез центрофугиране при 15, 000 g за 15 минути. Концентрацията на протеин се определя количествено с помощта на комплект за анализ на протеин BCA (Thermo Fisher). Тридесет микрограма протеин се смесва с буфер за проба (Thermo Fisher) с -ME и се денатурира при 95 градуса за 5 минути. Пробата се отделя чрез SDS-PAGE и се прехвърля в нитроцелулозна мембрана (Bio-Rad). Мембраните се блокират с 5% w/v обезмаслено сухо мляко и се инкубират с първични антитела за една нощ при 4 градуса и HRP-конюгирани вторични антитела (CST) за 1 час при стайна температура. Сигналът беше открит с помощта на Clarity и Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) и уловен с помощта на ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Антителата бяха както следва: анти-човешки GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), анти-HSF1 (CST, 12972, 1:1,000), анти-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1:1000), анти-GBP1 (Proteintech, 15303, 1:1,000), анти-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1:1,000) , анти-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), анти-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), анти-STAT1 (CST, 9172, 1:1 ,000), анти-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1:1000), анти-RAF1 (CST, 9422, 1:1000), анти-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), анти-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) и анти-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5 000). За човешки MHC-I Western blotting, общите клетъчни лизати бяха денатурирани в буфера на пробата без -ME (нередуциращ), за да се поддържат дисулфидните мостове и конформацията на протеините, които трябва да бъдат открити от анти-HLA-ABC антитяло (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1: 1000).

Ко-имунопреципитация (Co-IP)

Клетките се събират с IP лизисен буфер (Pierce, 87787) плюс протеазен инхибитор. Концентрацията на протеин се определя с BCA комплект за анализ на протеини. 200-500 ug протеинови проби се добавят към 1-3 ug първични антитела анти-HSP90 (Proteintech, 13171) или анти-HSF1 (CST, 12972) и се инкубират с леко разклащане при 4 градуса за една нощ. След това пробите бяха допълнително инкубирани с 20 ul протеин A/G PLUS-агароза (Santa Cruz, sc-2003) за 2 часа при 4 градуса; и се центрофугира при 7500 ×g за 30 секунди при 4 градуса. Клетъчните пелети се промиват 4 пъти с IP лизисен буфер, ресуспендират се с 40 ul 2 × буфер за проба с -ME и се нагряват в продължение на 5 минути при 95 градуса. Денатурираните протеинови проби се анализират чрез Western blot. За Flag IP, клетъчните лизати се инкубират с 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 афинитетен гел (Sigma Aldrich) и се промиват, денатурират и анализират, както е описано по-горе.

Имунофлуоресцентно оцветяване

A375 клетки, монтирани върху покривни стъкла, се третират с IFN в продължение на 24 часа. След промиване 2 пъти с PBS, клетките се фиксират с 4% PFA за 15 минути и се промиват 2 пъти с PBS за 5 минути всяка. След това клетките се пермеабилизират с 0.5% тритон x-100 в PBS за 10 минути и се изплакват 2 пъти с PBS за 5 минути всяка. Антигените бяха блокирани с 10% нормален кози серум в PBS за 30 минути. След това се добавят първични антитела при разреждания 1:50 на мишо анти-човешко GBP1-5 антитяло (Santa Cruz, 166960) или заешко анти-човешко HSP90 антитяло (CST, 4877) и се инкубират при 4 градуса за една нощ. След това клетките бяха промити и инкубирани с 1:500 разреждания на Qdot 605 белязано вторично козе анти-мише антитяло (Thermo Fisher, Q11002) или AF488-маркирано вторично козе анти-заешко антитяло (Thermo Fisher, A11034), и след това се монтира върху предметни стъкла с реактив ProLong Gold, съдържащ DAPI. Конфокални флуоресцентни изображения бяха събрани с помощта на маслен имерсионен обектив 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Имунопреципитация на хроматин (ChIP)

ChIPs бяха извършени с омрежен хроматин от третирани с IFN A375 клетки и HSF1 антитяло (CST, 12972) или нормален заешки IgG (CST, 2729), като се използва Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) (CST, 9005). Обогатената ДНК се определя количествено чрез PCR в реално време, като се използват праймерите, изброени в допълнителна таблица 8. Количеството имунопреципитирана ДНК във всяка проба се представя като сигнал спрямо общото количество входящ хроматин, което е еквивалентно на 1.

Изолиране на OT-I клетки и съвместно култивиране с OVA+ туморни клетки

C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) мишки (JAX stock #003831) са закупени от The Jackson Laboratory. Далакът се хомогенизира и единични клетки се суспендират в 2 ml буфер за лизис на червени кръвни клетки (Sigma-Aldrich) за 1 минута. Спленоцитите се пелетират, промиват и ресуспендират при 2 × 106 клетки на ml в RPMI културална среда, съдържаща 1 ug/ml OVA{11}} пептид, 5 ug/ml миши рекомбинантен IL-2 и 40 μM { {15}} меркаптоетанол. Клетките се инкубират при 37 градуса в продължение на 5 дни. За да се създаде съвместна култура на OT-I и OVA+ туморни клетки, спленоцитите бяха събрани след 5--дневно активиране. OT-I клетки бяха пречистени с помощта на комплект за изолиране на Т клетки EasySep мишка CD8+ (Stemcell). B16-OVA клетки се посяват за една нощ. След това OT-I клетки се добавят към културата в различни съотношения. Всички клетки бяха събрани чрез трипсинизация и анализирани чрез поточна цитометрия (FACS).

Дендритни клетки, получени от костен мозък (BMDC) и макрофаги (BMDM)

Костният мозък се изолира от бедрени кости на мишка C57BL/6 и се култивира в пълна среда RPMI1640 с 20 ng/ml GM-CSF (R&D). Клетките се инкубират при 37 градуса и 5% CO2. Допълнителни 10 ml среда с 20 ng/ml GM-CSF бяха добавени на ден 3. На ден 7 неприлепналите и хлабаво прилепналите клетки в супернатантата на културата бяха събрани чрез внимателно промиване с PBS и се считат за BMDCs. Прилепналите клетки се считат за BMDM.

Профилиране на интратуморни имунни клетки

За количествено определяне на интратуморните Т клетки и експресията на Т клетъчни ефекторни цитокини се приготвят едноклетъчни суспензии от свежи туморни тъкани чрез физическо преминаване през 100 μm клетъчни цедки. Имунните клетки бяха обогатени чрез центрофугиране с градиент на плътност. За оцветяване с цитокини, интратуморните имунни клетки се инкубират в RPMI културална среда, съдържаща PMA (5 ng/ml), йономицин (500 ng/ml), брефелдин А (1: 1, 000) и Monessen (1: 1 ,000) при 37 градуса за 4 часа. 2-3 ul на анти-CD45 (30-F11, BD Biosciences), анти-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), анти-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), анти-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) и анти-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) антитела бяха добавени за 20 минути за повърхностно оцветяване. След това клетките се промиват и ресуспендират в 1 ml прясно приготвен разтвор Fix/Perm (BD Biosciences) при 4 градуса за една нощ. След промиване с буфер Perm/Wash (BD Biosciences), клетките бяха оцветени с 2-3ul анти-Ki67 (B56, BD Biosciences), анти-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), и анти-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) за 30 минути, промити и фиксирани в 4% формалдехид (Sigma Aldrich). Всички проби бяха отчетени на цитометър LSR Fortessa и анализирани с FACS DIVA софтуер v. 8.0 (BD Biosciences).

Изчисляване на оценка на подписа

Използвахме нормализирана експресия на гени, за да дефинираме следните сигнатури: CD8+ Т клетъчна инфилтрация (CD8A, CD8B, PRF1 и GZMB), експресия на MHC-I (HLA-A, HLA-B и HLA-C) и HSF1 сигнализиране (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 и HSP90B1).

Статистически анализ

За клетъчно-базирани експерименти, биологични три екземпляри бяха извършени във всеки отделен експеримент като цяло, освен ако не е посочено друго. За проучвания върху животни са използвани не по-малко от 5 повторения на група. Животните бяха рандомизирани в различни групи след инокулиране на туморни клетки. Изследователите не са били заслепени за разпределението по време на експериментите и оценката на резултатите. Данните са показани като средни стойности със стандартна деривация. Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Използван е двустранен 2--странен t-тест за сравняване на третирани групи с контролни групи; Функцията на оцеляване беше оценена чрез методите на Kaplan-Meier и тестът за логаритмичен ранг беше използван за изчисляване на статистически разлики.

Наличност на данни

Данните за RNA-seq (GSE99299) и обработените данни за една клетка (GSE123814) бяха получени от Gene Expression Omnibus (GEO). MS протеомичните данни (PXD006003) са получени от PRIDE хранилището. Наборите от данни за рак на TCGA са получени от UCSC Xena (//xena.ucsc.edu/). Данните за RNA-seq и клиничната информация за клиничните изпитвания на ICB са предоставени от съответните автори. Всички необработени данни в подкрепа на констатациите от това проучване са достъпни от съответния автор при поискване. Изходните данни са предоставени в този документ.

Наличност на код

Всички анализи, използвани в това проучване, са извършени в съответствие с ръководствата на Prism Graphpad версия 8.0 и онлайн уебсайта на адрес http://xena.ucsc.edu/. По време на това проучване не са разработени нови кодове или алгоритми.

Разширени данни

Разширени данни Фиг. 1:

LIMIT корелира с ефекторни имунни гени при множество видове рак.

Разширени данни Фиг. 2:

Генетични локуси и последователности на човешки LIMIT и миши Limit.

Разширени данни Фигура 3: LIMIT увеличава израза MHC-1

Разширени данни Фиг. 5:

LIMIT увеличава заредената с антиген MHC-1 експресия in vivo.

Разширени данни Фиг. 6:

LIMIT цис-активира GBP за повишаване на MHC-1 и имунитета срещу тумори.

Разширени данни Фиг. 7:

GBP активират HSF1, за да стимулират експресията на MHC-I.

Разширени данни Фиг. 8:

HSF1 управлява експресията на MHC-I и туморния имунитет.

Разширени данни Фиг. 9:

HSF1 сигнализиращи гени корелират с MHC-I и туморен имунитет.

Разширени данни Фиг. 10: Схема, показваща как оста LIMIT-GBP-HSF1 влияе върху MHC-I и туморния имунитет

Допълнителен материал

Обърнете се към уеб версията на PubMed Central за допълнителни материали.

Благодарности

Благодарим на членовете на лабораторията Zou за техния интелектуален принос. Тази работа беше подкрепена отчасти от безвъзмездните средства за научни изследвания от US NIH/NCI R01 грантове (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) и (CA216919, CA213566, CA120458 (MC) и NIH чрез университета на Мичиганския център за ракови заболявания Rogel Grant (CA46592).

Препратки

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) и PD-1 блокада на пътя за терапия на рак: Механизми, биомаркери за реакция и комбинации. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Неоантигени в имунотерапията на рака. Наука 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F MHC клас I антигени, имунно наблюдение и имунно избягване на тумора. J Cell Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC антигени и злокачествено заболяване. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T Спешната нужда от възстановяване на MHC клас I при ракови заболявания за ефективна имунотерапия. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC и др. Атлас на човешки дълги некодиращи РНК с точни 5' краища. Nature 543, 199– 204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Дълги некодиращи РНК: вникване във функциите. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Еволюция и функции на дълги некодиращи РНК. Клетка 136, 629– 641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Дълги некодиращи РНК: функционални изненади от света на РНК. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Дълги некодиращи РНК: минало, настояще и бъдеще. Генетика 193, 651–669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Дълги некодиращи РНК в програмирането и препрограмирането на клетъчната съдба. Клетъчни стволови клетки 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Нововъзникващата роля на lncRNA при рак. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. Референтна анотация на GENCODE за човешки и миши геноми. Нуклеинови киселини Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N et al. Еволюция на тумора и микросредата по време на имунотерапия с ниволумаб. Клетка 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Геномни и транскриптомни характеристики на отговора на анти-PD-1 терапия при метастатичен меланом. Клетка 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM и др. Геномни корелати на отговор на блокада на CTLA-4 при метастатичен меланом. Наука 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Соматични мутации и неоепитопна хомология при меланоми, лекувани с CTLA{1}} блокада. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Систематични анализи на нов lncRNA-свързан подпис като прогностичен биомаркер за хепатоцелуларен карцином. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Демонстрация на интерферон гама-зависима система за наблюдение на тумори при имунокомпетентни мишки. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y Представяне на антиген от MHC клас I и неговото регулиране чрез интерферон-гама. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. Свързаният с тумора B7-H1 насърчава Т-клетъчната апоптоза: потенциален механизъм за избягване на имунитета. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. РНК-насочвано генно активиране чрез CRISPR-Cas9-базирани транскрипционни фактори. Nat Methods 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H et al. Експресията на гостоприемника на PD-L1 определя ефикасността на регресията на тумора, медиирана от блокиране на пътя на PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV Ядрени дълги некодиращи РНК: ключови регулатори на генната експресия. Тенденции Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Индукция на интерферон на фибробластни протеини с активност на свързване на гуанилат. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH et al. Интерферон-индуцирани гуанилат-свързващи протеини при активиране на инфламазома и защита на гостоприемника. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X et al. PROMO: откриване на известни регулаторни елементи на транскрипцията чрез търсене, съобразено с вида. Биоинформатика 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Consortium, EP Интегрирана енциклопедия на ДНК елементи в човешкия геном. Nature 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Пазител на протеостазата при рак. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Малкомолекулярни активатори на реакцията на топлинен шок: химични свойства, молекулярни цели и терапевтични обещания. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Потискане на активирането на транскрипционния фактор HSF1 на топлинен шок от HSP90 (комплекс HSP90), който образува чувствителен на стрес комплекс с HSF1. Клетка 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Регулиране на фактора топлинен шок при бозайници 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 и придружаването на рака. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Клонално заместване на тумор-специфични Т клетки след блокада на PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M et al. Протеомиката на отговора на меланома към имунотерапията разкрива митохондриална зависимост. Клетка 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Дълги некодиращи РНК в регулирането на имунния отговор. Тенденции Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Дълги некодиращи РНК в регулирането на имунния отговор и обучен имунитет. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Дълги некодиращи РНК в раковите пътища. Ракова клетка 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT et al. LncRNA GClnc1 насърчава стомашната карциногенеза и може да действа като модулно скеле на WDR5 и KAT2A комплекси за определяне на модела на модификация на хистони. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas Първична, адаптивна и придобита резистентност към имунотерапия на рак. Клетка 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Епигенетичното заглушаване на хемокините от тип TH1- оформя туморния имунитет и имунотерапията. Nature 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. CD8 (+) Т клетките регулират туморната фероптоза по време на имунотерапия на рак. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Загуба на гени на пътя на IFN-гама в туморни клетки като механизъм на резистентност към анти-CTLA-4 терапия. Клетка 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM и др. Мутации, свързани с придобита резистентност към PD-1 блокада при меланома. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT и др. In vivo CRISPR скринингът идентифицира Ptpn2 като цел за имунотерапия на рак. Nature 547, 413–418, doi: 10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS и др. Първична резистентност към PD-1 блокада, медиирана от JAK1/2 мутации. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. Придобитата резистентност към IFNgamma уврежда антитуморния имунитет и води до устойчиви на Т клетки меланомни лезии. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Епигенетичните драйверни мутации в ARID1A оформят имунния фенотип на рака и имунотерапията. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL и др. Сигнализирането на туморен интерферон регулира програма за мултигенна резистентност към блокада на имунната контролна точка. Клетка 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Терапевтично насочване на дълги некодиращи РНК при рак. Тенденции Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Регулиране на генната експресия чрез цис-действащи дълги некодиращи РНК. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Предизвикателства и перспективи за структурната биология на lncRNAs-примерът на Xist lncRNA A-повторения. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR и др. GBP5 насърчава сглобяването на възпаление на NLRP3 и имунитета при бозайници. Science 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Интерферон-индуцирани гуанилат-свързващи протеини: Пазители на защитата на гостоприемника при здраве и болест. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Клъстер от интерферон-гама-индуцируеми p65 GTPases играе критична роля в защитата на гостоприемника срещу Toxoplasma gondii. Имунитет 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. Инхибирането на HSP90 подобрява имунотерапията на рака чрез регулиране на гените за отговор на интерферон. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Насочване към протеин на топлинен шок 90 (HSP90) като допълнителна стратегия към блокада на имунната контролна точка за терапия на рак. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Юно А и др. Клинична оценка и профилиране на биомаркери на Hsp90 инхибитори. Методи Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. Свръхекспресията на Bcl-2 повишава преживяемостта на тумор-специфичните Т-клетки. Cancer Res 65, 2001–2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Raf-1 е необходим за Т-клетъчното производство на IL2. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]