Базирани на нуклеинови киселини платформи за ваксини срещу коронавирусната болест 19 (COVID‑19)

Резюме

Пандемията от коронавирусната болест 2019 (COVID-19) е заразила 673 010 496 пациенти и е причинила смъртта на 6 854 959 случая в световен мащаб до днес. Бяха положени огромни усилия за разработване на фундаментално различни платформи за ваксина срещу COVID-19. Базираните на нуклеинова киселина ваксини, състоящи се от иРНК и ДНК ваксини (ваксини от трето поколение), са обещаващи по отношение на бързо и удобно производство и ефикасно провокиране на имунни отговори срещу COVID-19. Няколко базирани на ДНК (ZyCoV-D, INO-4800, AG0302-COVID19 и GX-19N) и базирани на иРНК (BNT162b2, иРНК-1273 и ARCoV) одобрени платформи за ваксини са използвани за превенция на COVID-19. иРНК ваксините са в челните редици на всички платформи за превенция на COVID-19. Тези ваксини обаче имат по-ниска стабилност, докато ДНК ваксините са необходими с по-високи дози за стимулиране на имунните отговори. Вътреклетъчното доставяне на ваксини на основата на нуклеинова киселина и техните нежелани реакции се нуждаят от допълнителни изследвания. Като се има предвид повторната поява на тревожни варианти на COVID-19, преоценката на ваксината и разработването на поливалентни ваксини или панкоронавирусни стратегии е от съществено значение за ефективната превенция на инфекциите.

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ключови думи

Коронавирусна болест 19 · Ваксини на основата на нуклеинова киселина · Имунитет · Защита

Заден план

В края на 2019 г. нов бета коронавирус се появи в Ухан, Китай, и бързо се разпространи по целия свят. Коронавирусната болест 2019 (COVID-19) има висок потенциал на пандемия поради високия си процент на заразяване с висока смъртност в световен мащаб (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021). Следователно са необходими значителни усилия за разработване на ефективни ваксини или терапии срещу болестта (Su et al. 2020). Симптомите на заболяването COVID-19 варират, включително леки фу-подобни симптоми, пневмония, синдром на остър респираторен дистрес (ARDS) и фатален изход. Пациенти с рак, диабет, сърдечно-съдови заболявания, по-възрастни хора и дори генетично предразположени индивиди са изложени на най-висок риск от тежестта на COVID-19 (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021; Vakil et al. 2022). Съгласно препоръките на Световната здравна организация (СЗО) носенето на маски, използването на антивирусни лекарства, социалното дистанциране и спазването на процедурите за ваксиниране са жизненоважни поведения за контрол на пандемията от COVID-19 по света (Sharma et al. 2020). Научните усилия за разработване на ефективни ваксини срещу инвазивни патогени датират от много години (Deb et al. 2020; Zhang et al. 2020; Wibawa 2021). Тези платформи за ваксини също са проектирани срещу патогенни бактерии (Farhani et al. 2019; Jafari и Mahmoodi 2021). В това отношение разработването на ефикасна, защитна и безопасна ваксина се счита за основен превантивен подход за предотвратяване на разпространението на коронавирус 2 на тежкия остър респираторен синдром (SARS-CoV-2) (Moore and Klasse 2020). Поради това различни фармацевтични компании и изследователски екипи по света се състезаваха да представят безопасна и ефикасна ваксина срещу COVID-19 за употреба от международната общност. Тези усилия разработиха други платформи за ваксини, които да влязат в предклинични и клинични изпитвания и някои от тях бяха одобрени (Chen et al. 2021), включително традиционни ваксини като живи или инактивирани, субединични и ваксини на базата на нуклеинова киселина като ваксини от следващо поколение (Moore and Klasse 2020). Въз основа на научните доказателства живите атенюирани ваксини стимулират вродените, клетъчните и хуморалните имунни отговори чрез индуциране на Toll-подобни рецептори (TLR) с дългосрочен имунитет и могат да развият свръхчувствителност. Основният недостатък на тези ваксини е тяхната скъпа оценка на безопасността и ефикасността. Инактивираните вирусни ваксини слабо провокират клетъчните имунни отговори, което намалява тяхната ефикасност. През април 2020 г. инактивирана ваксина срещу COVID-19 беше произведена от Sinovac и Института за биологични продукти в Ухан (Sinopharm) (Moore and Klasse 2020; Su et al. 2020). Субединичните ваксини са безопасни, с някои дефекти, включително ниска имуногенност, изискване за бустер или адювант и висока цена (Koirala et al. 2020; Su et al. 2020). Базираните на нуклеинова киселина ваксини са разработени въз основа на информация за последователността. Те включват ДНК или иРНК последователности на антигени, които силно стимулират клетъчни и хуморални имунни отговори в различни дози. Поради предимствата им, като бързо производство и най-ранните ваксини срещу COVID-19 в клинични изпитвания, забележимо предимство на базираните на ДНК ваксини е тяхната стабилност при различни условия на съхранение (Silveira et al. 2020; van Riel and de Wit 2020). Базираните на РНК ваксини получиха повече внимание от фармацевтични компании като Pfizer/Biotech и Moderna. За разлика от ДНК ваксините, те стимулират ефективен хуморален имунен отговор като TLR лиганди без адювант и тяхната последователност е модифицирана, за да предотврати разграждането на иРНК (Moore и Klasse 2020; van Riel и de Wit 2020; Soiza et al. 2021). Този преглед имаше за цел да оцени последните разработки във ваксините на базата на нуклеинова киселина, включително иРНК и ДНК ваксини срещу COVID-19.

Основен текст

Коронавирусен молекулярен механизъм на инфекция и имунен отговор

растение цистанче, повишаващо имунната система

Геномът на COVID-19 е положителна едноверижна РНК, която кодира четири основни структурни протеина, състоящи се от обвивка (E), шип (S), мембрана (M) и нуклеокапсид (N) (Stadler and Rappuoli 2005), както е представено на фиг. 1а. Човешкият SARS-CoV включва шипов (S) гликопротеин като част от обвивката. Инкорпорирането на вируса в клетките гостоприемници се извършва от шипов протеин, който се състои от S1 и S2 субединици. Те играят съществена роля в прикрепването към рецепторите на клетката гостоприемник, известни като ангиотензин-конвертиращ ензим II (ACE2) за започване на инфекцията (фиг. 1b). Централната област на S1 домейна, свързваща се с ACE2 с висок афинитет, е рецептор-свързващ домен (RBD). В това отношение взаимодействието между RBD и ACE2 е необходимо за иницииране на инфекция на човешки клетки (He et al. 2020). В допълнение, съкращаването на S протеина е от съществено значение за навлизането на вируса в клетките гостоприемници; след прикрепване на RBD регион към ACE2, протеаза на гостоприемник, известна като TM протеаза серин 2 (TMPRSS2), разцепва S протеина на S1 и S2 домейни, което води до сливане на S2 домейн с клетката гостоприемник (Huang et al. 2020). Въпреки че силните имунни отговори са ефективни срещу COVID-19, свръхчувствителност и цитокинова буря (най-вече интерлевкин-6-, IL-1b, GM-CSF-, интерферон- /IFN-, некрозисфактор/ TNF -, IL-10-, IL-2- и IL- 7-задвижвани отговори) трябва да бъдат забранени (Chowdhury et al. 2020). След прикрепване на вируса (взаимодействие с шипове-ACE2) и навлизане в респираторните клетки, фагоцитните алвеоларни макрофаги и дендритните клетки (DCs) представят вирусни антигени на Т клетките и активират T CD4+(помощни Т клетки) и T CD{{37 }} (цитотоксични Т клетки). Впоследствие се освобождават провъзпалителни цитокини като IL6, IL12, TNF и IFN и т.н., за да се сблъскат с вируса. Въпреки това високите нива на производство на цитокини, водещи до цитокинова буря, причиняват увреждане на белите дробове (Hosseini et al. 2020). Според научни доказателства помощните Т-клетки са необходими за елиминиране на вирусна инфекция, индуциране на В-клетки да произвеждат антитела и стимулиране на цитотоксични Т-клетки (Sharma et al. 2020). Антигенни мишени на COVID-19 При разработването на безопасна и защитна ваксина срещу патогенен организъм идентифицирането на най-добрите имуногенни мишени е от съществено значение (Lu et al. 2020b). Приемането на потенциални антигенни мишени е от решаващо значение за провокиране на Т-клетъчни и В-клетъчни епитопи за правилно индуциране на клетъчен и хуморален имунитет (Rueckert и Guzmán 2012). Вирусният S протеин взаимодейства с клетките гостоприемници чрез RBD домейна като основен лиганд. Домейнът RBD може да индуцира производството на неутрализиращи антитела и Т-клетъчен имунен отговор срещу COVID-19. Също така, имуногенността на S протеина е потвърдена (Pushparajah et al. 2021). N протеинът има малка и силно запазена последователност в сравнение с други вирусни протеини. N протеинът е силно експресиран по време на вирусна инфекция, със значителен свързан хуморален имунен отговор срещу COVID-19 сред пациентите. Освен това, с клетъчни отговори срещу N протеина, той може да се счита за подходящ кандидат-антиген при проектирането на ваксина (Dutta et al. 2020). В допълнение, М протеинът и Е протеинът стимулират Т CD4+епитопите (Wang et al. 2005; Abdelmageed et al. 2020; Dong et al. 2020). Предизвикването на силни имунни отговори срещу S протеина е определящо и необходимо (Buchholz et al. 2004). S протеинът включва най-имуногенните Т-клетъчни и В-клетъчни епитопи, известни като предпочитани мишени при разработването на ваксина срещу COVID-19. Приложен е във всички разработени ваксини на платформата на иРНК като ваксините на Pfizer/BioNtech и Moderna.

Фиг. 1 a Структурата на вириона на SARS-CoV-2; основните повърхностни протеини на вируса COVID-19 включват Spike (S) гликопротеин, мембранни (M) и протеини на обвивката (E). S протеинът е основната ваксина и терапевтична цел, която взаимодейства с рецептора на ангиотензин-конвертиращия ензим II (ACE2) за иницииране на инфекция. b Домени на шипов протеин; S протеинът включва S1 (NTD или нетранслиран домен и RBD или рецепторно свързващ домен) и S2 субединици

История на лекарства на основата на нуклеинова киселина

Олигонуклеотидите бяха включени в клинични изпитвания преди повече от 30 години. Историята на използването на терапевтични подходи, базирани на нуклеинова киселина, датира от 1977 г., когато Paterson et al. използват нуклеинови киселини за настройване на генната експресия (Paterson et al. 1977). В момента те са получили повече внимание. Лекарствата на базата на нуклеинова киселина се разделят на различни категории, включително антисенс форми, рибозими, иРНК и ваксини на основата на ДНК (Sharma et al. 2014). Синтетичен олигодезоксинуклеотид инхибира репликацията на вируса на саркома на Раус (RSV), който е комплементарен на иРНК на RSV и е известен като антисенс (Zamecnik и Stephenson 1978). Първият антисенс беше въведен в клиниката срещу цитомегаловирус (CMV) (Mulamba et al. 1998). Малката интерферираща РНК (siRNA) притежава потенциала да инхибира генната експресия и за първи път е докладвана през 1998 г. Друга група от малки некодиращи РНК включва микроРНК (miRNA), които имат незаменима роля в регулирането на генната експресия, с функции, подобни на тези на siRNA и терапевтичен потенциал (Usman and Blatt 2000; Sharma et al. 2014). Както бе споменато, рибозимният клас на РНК молекулите действа като ензими, които са насочени към транскрипцията. Рибозимите влизат в клинични изпитвания срещу рак и някои вирусни инфекции като вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) (Usman and Blatt 2000; Abera et al. 2012). В допълнение към ваксините на базата на иРНК и ДНК, те се класифицират като лекарства на базата на нуклеинова киселина, въведени през 1990 г. и получиха повече внимание при разработването на ваксини за борба с COVID-19 (Le et al. 2020; Zhang et al. 2020 г.). Основните предимства на тези групи ваксини включват тяхното бързо производство и висока специфичност срещу съответните целеви антигени (Le et al. 2020).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

иРНК-базирани ваксини

Първоначалното доставяне на mRNA молекули в клетките гостоприемници включва mRNA трансфекция във фибробластни клетки с помощта на катионен липид (Park et al. 2021). mRNA ваксините включват mRNA на патогенни антигени, които произвеждат антигенни протеини от човешки клетки. Няколко предимства на иРНК ваксините включват прост производствен процес, ефективен и защитен имунитет, удобна манипулация и индустриализация и гъвкавост за реагиране на варианти на COVID-19 (Kaufman et al. 2016; Fang et al. 2022). Някои подходи, като добавянето на последователности 5'-cap и Kozak, се прилагат с помощта на последователности 3'-poly-A и модификация на mRNA нуклеозиди (Borah et al. 2021). ИРНК ваксините се транслират в цитозола на гостоприемника. Следователно няма риск от вмъкване на геноми на хост, което е известно като основното им предимство. В това отношение базираните на иРНК ваксини наскоро получиха повече внимание като безопасен превантивен подход срещу рак и инфекциозни заболявания (Kaur and Gupta 2020). Основният механизъм на действие на иРНК ваксините е изобразен на фиг. 2.

ДНК-базирани ваксини

ДНК ваксините съдържат няколко гена, кодиращи вирусни антигенни пептиди, експресирани от плазмидни вектори и предадени на клетките чрез електропорация (ЕР). В сравнение с други платформи за ваксини, ДНК ваксините предлагат гъвкава и бърза платформа за разработване на ваксини, което я прави очарователна технология за борба с развиващите се епидемии като COVID-19. Освен това, производството на антиген на ДНК ваксина се случва в прицелните клетки, което подпомага рекапитулацията на естествената конформация на вирусния антиген и пост-транслационната модификация. Основният недостатък на ДНК ваксините е тяхната ограничена имуногенност. Следователно е важно да се обмислят стратегии като адювант или използването на първичен бустер режим, който може да увеличи потенциала на ДНК ваксината. Също така, интегрирането на нуклеинова киселина в ДНК на гостоприемника е друг проблем за биобезопасността, водещ до онкогенеза и мутагенеза (Rauch et al. 2018). Въпреки че според предишни проучвания рискът от вмъкване на ДНК ваксина е незначителен, СЗО и FDA препоръчват прилагането на безопасност на ДНК ваксината за интегриране (Wang et al. 2004; Schalk et al. 2006). ДНК ваксините прехвърлят коронавирусните гени в човешки клетки. Принципът на ваксинацията зависи от доставката на ДНК в клетъчното ядро, така че транскрипцията на антигена да започне и да бъде последвана от транслация. ДНК ваксините обикновено използват плазмиди като вектори. Въз основа на начина на приложение на ваксината се засягат както миоцитите, така и кератиноцитите. Въпреки това, антиген-представящите клетки в близост до мястото на инжектиране могат също да бъдат трансфектирани директно с помощта на ДНК ваксини. В такива случаи процесът на кръстосано праймиране представлява антигени, използващи и двата основни молекули на комплекса за хистосъвместимост (MHC-I/II) (Hobernik and Bros 2018). Генерираните антигени се освобождават с помощта на апоптотични тела или екзозоми, което води до тяхното разпознаване от антиген-представящи клетки, които от своя страна провокират клетъчни и хуморални имунни отговори. Използват се различни стратегии за доставяне, за да се получи силен имунен отговор (Donnelly et al. 2005; Li and Petrovsky 2016; Strizova et al. 2021). По отношение на имунната регулация по време на инфекция с COVID-19, беше разкрито, че пациентите с риск от перикарден излив с погрешна прогноза показват повишени CD3+CD8+ Т клетки плюс намалени CD{{ 18}}HLA-DR и Т регулаторни (Treg) клетки (Duerr et al. 2020). Тези резултати показват, че тежката инфекция възниква поради дисбалансиран имунен отговор, който изостря болестните състояния (Tay et al. 2020). Напредъкът на ваксината срещу COVID-19 имаше за цел да развие ефективен и подходящ имунен отговор (включително и двете ръце) без напредък към такъв дисбаланс (Hobernik and Bros 2018). Въпреки че клиничните изпитвания на ДНК ваксини при хора предизвикаха тотални реакции, тези реакции често са недостатъчни, за да доведат до приемливи клинични предимства. Освен това основните компоненти на плазмидната ДНК, например неметилирани CpG последователности, могат да причинят активиране на вродени имунни отговори, повишавайки адаптивните имунни отговори срещу експресираните антигени. Следователно ДНК ваксините са по-приложими във ветеринарната медицина (Coban et al. 2013; Silveira et al. 2017; Hobernik and Bros 2018). Поради този недостатък, някои изследователски линии се концентрират върху оптимизирането и доставянето на ДНК ваксини, включително оптимизиране на кодон, дизайн на промотор, молекулярни адюванти, приложение на EP, ваксинация с прайм бууст или "omics" методи за усъвършенстван дизайн на ваксина (Li et al. 2012; Силвейра и др. 2020). Фигура 3 илюстрира основните етапи на механизмите на ДНК ваксината в ефективните имунни отговори.

Фиг. 2 Състав на mRNA ваксина, приложение и механизми на имунна провокация: mRNA формулировка с липидни наночастици (LNP) поддържа и подобрява стабилността на последователността. b Физиологичен разтвор на mRNA-LNP ваксина се прилага интрамускулно. c LNP-съдържащата иРНК се трансфектира в антиген-представящите клетки (APC) чрез ендоцитоза. ИРНК се освобождава в цитоплазмата и се транслира във вирусни протеини, след което те се лизират от протеазомата и се свързват с основния комплекс за хистосъвместимост I (MHC-I) върху повърхността на ендоплазмения ретикулум и се представят на Т цитотоксични (Tc) клетки

Потенциалът на иРНК- и ДНК-базираните ваксини

Структурата на ваксина на ниво mRNA съдържа елементи за възстановяване на стабилността и протеиновата експресия, включително 3' UTR, кодираща последователност, 5'UTR, 5' капачка и поли (A) опашка (Liu 2019). 5' и 3' UTR елементите, обграждащи кодиращата последователност, получена от вирусни или еукариотни гени, повишават структурната стабилност и подобряват транслацията на иРНК, които са основни фактори за ваксините (Ross and Sullivan 1985; Holtkamp et al. 2006). За ефективна протеинова транслация от иРНК е необходима 5' капачка (Martin et al. 1975; Ross and Sullivan 1985). Опашката на иРНК поли (А) също има регулаторна роля в стабилността и транслацията на иРНК (Holtkamp et al. 2006). Също така използването на кодон има жизненоважна роля в транслацията на протеини. В това отношение, за да се увеличи транслацията на протеин от иРНК, редките кодони се заменят с използвани синонимни кодони, които имат изобилие от родствена тРНК в цитозола (Stepinski et al. 2001). Друг подход за оптимизиране на последователността е обогатяването на G:C съдържание. Няколко метода са разработили ефективни и безопасни кандидати за ДНК ваксини през последните години. В платформа за ваксини, базирана на ДНК, плазмидни вектори, получени от бактерии, се прилагат за експресиране на тези желани антигени в клетките гостоприемници. Бактериалните плазмиди трябва да бъдат въведени в еукариотните клетки и преместени в ядрото. След това ДНК се транскрибира и транслира от чужди гени съответно в ядрото и цитоплазмата на клетката гостоприемник. Следователно, проектирането на подходящ плазмид с висока ефективност на трансфекция и протеинова експресия е от съществено значение за достигане на мощна ДНК ваксина (Malone et al. 1989). Последователността на еукариотния регион (в плазмидите на ДНК ваксините), нагоре по веригата на вмъкнатия ген, е съставена от промотор и поли А сигнал (polyA) (AAU AAA), разположен в 3' краищата на антигенната последователност (Shan et al 2011). Промоторите са критични елементи, необходими в плазмидите на ДНК ваксината, за да провокират високи нива на експресия на желаните антигени в клетките гостоприемници (Becker et al. 2008) и да доведат до транскрипция на иРНК от вмъкнатия ген. Най-често използваният промотор в ДНК ваксините включва промотора на човешки цитомегаловирус (CMV). Сигналът на полиА последователността причинява стабилност и трансфер на иРНК и ефективна експресия на еукариотен ген. Друг критичен елемент е последователността на Kozak (ACCATGG), която има жизненоважна роля в транслацията от еукариотната рибозома. Също така, добавянето на една или две последователности на стоп кодон е необходимо, за да се избегне неправилна транслация на вмъкнатия ген в клетката гостоприемник (Becker et al. 2008; Williams 2013). Сравнение на платформи за ДНК и иРНК ваксини Въпреки че ДНК и иРНК ваксините се разработват от 90-те години на миналия век и скорошното разработване и лицензирането на различни ветеринарни ДНК ваксини, значителен ентусиазъм се насочи към иРНК. И двете се нуждаят от усилия за подобряване на тяхната антигенност, стабилност и ефикасност чрез директно манипулиране на плазмидна ДНК и иРНК или добавяне на имуномодулатори или адюванти и формулировки и системи за доставяне (Liu 2019). Продължителността на стабилността на иРНК е по-ниска от тази на плазмидната ДНК. Беше разкрито, че ДНК ваксините генерират кодирания протеин бързо, като са по-големи количества от иРНК ваксините поради по-високата присъща стабилност на плазмидна ДНК. Установено е, че плазмидната ДНК персистира в мускула до 6 месеца в неинтегриран режим (Ledwith et al. 2000). Въпреки че се предполага, че ДНК и иРНК ваксините са експресионна система за любимия протеин, нито една от тях не е имунологично инертна. Освен това ДНК плазмидите, както и иРНК стимулират вродения имунитет (Campbell 2017). Базираната на ДНК и иРНК ваксина технология може да не е съвсем обща. иРНК е по-сложна от плазмидната ДНК поради модифицирани нуклеозиди и формулировки, необходими за доставяне, стабилност и необходимостта да се контролира присъщата имуностимулираща активност на иРНК. Въпреки това, това е от полза за производството, което избягва търсенето на всеки клетъчен или животински продукт. Обещанието е, че клиничните постижения ще бъдат осъществими, след като предизвикателствата, свързани с плазмидната ДНК и иРНК ваксината, бъдат разрешени, особено чрез прилагане на съвременни технологии за предотвратяване и лечение на заболявания (Liu 2019).

Фиг. 3 Процесът на експресия на COVID{1}} ДНК ваксина в антиген-представящите клетки (дендритни клетки или DC). Плазмидната ДНК навлиза в DC ядрото и експресира антигени in vivo (1) След това антигените се представят на Т клетките (Т клетъчни рецептори или TCRs) чрез MHC-I и MHC-II молекули. Представянето на антиген става чрез DC CD80/86 молекулите и CD8+T клетъчните CD28 молекули заедно с MHC-I-TCR и също чрез DC CD40 и CD4+T клетъчните CD40L заедно с MHC-II-TCR взаимодействия (2a, 3 и 4) Активирането и пролиферацията на CD8+T клетките и освобождаването на цитокини води до ефективни имунни отговори като активиране на макрофагите (2b) Освен това, активирането на CD 4+Т-клетките след свързване и цитокинови ефекти от DCs се свързват с активирането на В-клетките, пролиферацията и секрецията на антитела (5)

Напредък в доставката на ДНК и иРНК ваксини

Поемането на чужда ДНК и РНК от еукариотните клетки не е ефективно в сравнение с вирусните вектори. Установени са много подходи за физическо доставяне за увеличаване на капацитета за клетъчно усвояване (Mellott et al. 2013). Физическите методи за генна трансфекция включват системи за доставяне, прехвърлящи генетичен материал чрез механични процедури, включително EP и проекторни устройства (Gulce-Iz и Saglam-Metiner 2019). Устройствата Biojector използват налягането на CO2 за транспортиране на терапевтични средства чрез IM (интрамускулно), ID (интрадермално), а също и SC (подкожно) приложение без изискване за игла (Jorritsma et al. 2016), което дава значителни предимства пред конвенционалното инжектиране с игла, включително смекчаване на неблагоприятни ефекти, кръстосано замърсяване на иглата и щети от убождане с игла (Zhang et al. 2015). Съответно, две ДНК ваксини са оценени срещу вируса Zika във фаза I на изпитването, демонстрирайки повишени клетъчни отговори след прилагане без игла в сравнение с използването на игла (Gaudinski et al. 2018). Освен това платформа за доставяне на иРНК ваксина срещу бяс, използваща проектор, разкри засилени отговори на антитела (Alberer et al. 2017). Повишената ефикасност на ваксината чрез струйно инжектиране може да се припише на по-широкото разпространение на ваксини, което води до по-високо усвояване при използване на APC (Williams et al. 2000; Alberer et al. 2017). Понастоящем ID или IM инжекции, последвани от EP, обикновено се използват за доставяне на ДНК ваксина в клинични проучвания (Sardesai and Weiner 2011). EP включва образуване на пори в клетките на кожата, за да се увеличи клетъчното усвояване на генетичния материал с помощта на електрически импулси (Pushparajah et al. 2021). Методът IM EP е приложен основно през 1998 г. (Aihara 1998) за подобряване на проникването на мускулните клетки за доставяне на ДНК ваксини (Rizzuto et al. 1999; Dupuis et al. 2000; Sokołowska and Błachnio-Zabielska 2019). Многобройни доклади разкриват по-добра експресия на антиген и повишени антиген-специфични имунни отговори in vivo с помощта на EP (Yan et al. 2008; Yan et al. 2009). Съобщава се, че ХИВ ДНК ваксина, ADVAX, повишава имуногенността след трансфера през EP (Vasan et al. 2011), в сравнение с IM приложение (Vasan et al. 2010). Въпреки това подходът на EP страда от риск от клетъчна смърт поради използването на високи напрежения (Gulce-Iz и Saglam-Metiner 2019). Новите подходи за доставка, като EP, все още се изследват за доставка на РНК ваксина.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Ефикасността на EP за доставяне на самоусилваща се ваксина е подобна на тази за плазмидни ДНК ваксини по отношение на генната експресия и имунните отговори при мишки (Cu et al. 2013). ЕП обаче не е повишил ефикасността на доставяне на традиционните нерепликиращи РНК ваксини (Johansson et al. 2012), което вероятно намалява ефективността им при дублиране на РНК вектори. Съответно, ЕР и биоинжекторите са полезни за парентерално инжектиране на COVID-19 ДНК/РНК ваксини. Тези подходи допринасят за по-голямо производство и доставка на кандидати за ДНК ваксина и подобряват забележително резултатите (Pushparajah et al. 2021).

Ползи и ограничения на ваксините на базата на нуклеинова киселина

Като нови и обещаващи методи за имунизация, ваксините на базата на нуклеинова киселина предоставят представа за разработването на безопасна и защитна ваксинация (Choi and Chang 2013), както е демонстрирано от милиони хора по време на пандемията от COVID-19. Базираните на нуклеинова киселина ваксини имат кратки цикли на разработка, което улеснява бързото разпространение по време на пандемия. Използването на рекомбинантни ДНК ваксини изисква ефективно прехвърляне на ДНК вектор в ядрото, транскрипция и след това транслация в желания антиген (Leitner et al. 1999). Благодарение на удобната манипулация и евтиното производство, голата плазмидна ДНК е очарователен вектор за представяне на антигени (Williams 2013). Обикновено плазмидната ДНК включва основни генетични елементи, включително антиген-кодиращия ген, промотор, енхансери и последователности за терминиране на транскрипция/полиаденилиране (Vogel and Sarver 1995). Плазмидната ДНК платформа е обещаваща биофармацевтична конструкция, репликирана във високи нива в рамките на евтини прокариотни клетки, въпреки че изисква пречистване (Prazeres et al. 1999; Ferreira et al. 2000; Suschak et al. 2017). РНК ваксините са съставени от иРНК молекули, съдържащи антигенна РНК, заобиколена от 3', поли-А опашка и 5' краища и нямат изискване за транскрипция. (Zhang et al. 2019). Няколко РНК ваксини се подлагат на самоусилване, известно като нова технология в процес на разработка. Съответно, молекулата на РНК може да бъде репликирана и транслирана в гостоприемника след раждането, въпреки възможността за нестабилност на оголената РНК, като по този начин се увеличава експресията на имуногенни пептиди (Pardi et al. 2018; Zhang et al. 2019; Wadhwa et al. 2020) . ИРНК се разгражда от повсеместните рибонуклеазни ензими (Wadhwa et al. 2020; Xu et al. 2020). Добавянето на 3' поли-А опашка и 5'–7-метилгуанозин капачка е критично за повишаване на стабилността и транслацията на иРНК в цитозола (Gallie 1991; Schlake et al. 2012). Стратегиите за увеличаване на усвояването и експресията на ваксината са оценени предимно за ДНК ваксини, отколкото за РНК ваксини, тъй като ДНК изисква преминаване през две клетъчни мембрани, за да достигне до ядрото. Обратно, РНК прониква в цитоплазмата през една единствена мембрана (Rauch et al. 2018). Структурата на ДНК има сравнително по-висока стабилност. В продължение на 7 години беше установено, че плазмидната ДНК остава непокътната без разлика с новоосигурената ДНК, съхранявана при -20 градуса (Walther et al. 2013; Pushparajah et al. 2021). Ниското рН и температура са критични за поддържане на целостта на ДНК за дълго време. Обратно, РНК е изключително чувствителна към температурата и трябва да се поддържа при -70 градуса в среда без ензими, за да се увеличи нейният полуживот (Jones et al. 2007).

Предизвикателства при разработването на ваксини на базата на нуклеинова киселина

Добре известно е, че ваксините срещу COVID-19 трябва да бъдат ефективни и достатъчно защитни (Graham 2020) и да предизвикват дълготраен имунитет. Въпреки това, годишната ваксинация може да е възможна въз основа на годишен опит с ваксина срещу грип (Randolph and Barreiro 2020; van Riel and de Wit 2020). Разработването на ваксината срещу COVID-19 поставя предизвикателства дори с нови платформи. Въпреки високата имуногенност и защита на коронавирусната шипова протеинова ваксина, появата на мутации предизвиква безпокойство и повторната поява на вируса. Следователно, прогнозата за времето и местоположението на възникване на заболяването, заедно с точното приемане на целевата протеинова последователност, е преден етап от процеса на развитие, който се нуждае от правилно прилагане на клинични изпитвания (Lurie et al. 2020). Основното предизвикателство на ДНК ваксините е предизвикването на относително по-слаби имунни отговори при хора и големи животни, отколкото при малки животински системи (Grunwald и Ulbert 2015; Suschak et al. 2017). Забележимо е, че остават да бъдат разгледани допълнителни предизвикателства по отношение на ваксините срещу COVID-19, като дълготрайност на защитата, ефективност в специфични подгрупи, предотвратяване на предаване на вируси и обществено приемане (Pushparajah et al. 2021). Забавената експресия на антиген в самоусилващите се иРНК ваксини може да ограничи ефикасността на тези ваксини. Тази платформа обаче дава по-високи добиви и по този начин осигурява еквивалентна защита при значително по-ниски дози (Vogel et al. 2018; Strizova et al. 2021).

Последен напредък в ДНК и иРНК ваксините срещу COVID‑19

При разработването на ваксина срещу COVID{{0}} многобройни проучвания са фокусирани върху платформи за иРНК ваксини (Verbeke et al. 2021), което води до одобрението на няколко ваксини (Vitiello и Ferrara 2{{ 94}}21) като тези от компаниите Moderna и Pfizer/BioNtech. Ваксината на Moderna включва цялото кодиране на COVID-19 spike гликопротеинова иРНК, докато Pfizer/BioNtech съдържа RBD иРНК последователността (Brüssow 2020). Нивата на ефикасност на ваксините на Pfizer/BioNTech и Moderna включват съответно 95% и 94,5% (Rauch et al. 2021; Widge et al. 2021). Температурата на съхранение на ваксината на Moderna е между −25 градуса и −15 градуса, докато тази на ваксината на Pfzer е между −80 градуса и −60 градуса (Meo et al. 2021; Rauch et al. 2021). В сравнение с ваксината на Moderna, ваксината на Pfizer/BioNTech има по-ниски разходи и странични ефекти (Rauch et al. 2021). Друга mRNA ваксина срещу COVID-19 е разработена от китайски изследователи и използва термостабилна (поне една седмица при 25 градуса) RBD-кодираща mRNA (Brüssow 2020). В друго проучване CureVac е използван като проектирана S протеинова мРНК платформа с пълна дължина за разработване на ваксина срещу COVID-19 със заместители в два пролинови остатъка за подобряване на протеиновата стабилност (Rauch et al. 2021). Ruklanthi de Alwis и др. (2021) разработиха самотранскрибираща се и репликираща се иРНК ваксина за COVID-19, използваща S протеин с пълна дължина и репликон (de Alwis et al. 2021) с потенциал за приложение като ефективна и безопасна еднодозова ваксина за борба с COVID- 19 (de Alwis et al. 2021). По подобен начин беше използвана самоусилваща се РНК, кодираща COVID-19 S протеина, капсулиран в липидна наночастица (LNP), и очерта високи титри на антитела и клетъчни имунни отговори (McKay et al. 2020). Някои кандидати за ДНК ваксини, като S, N и M протеинови ваксини, са разработени за SARS-CoV. Сред тях базираната на S протеин ДНК ваксина ефективно е предизвикала защитен ефект срещу COVID-19 инфекция, вероятно поради жизненоважната роля на S протеина в рецепторното свързване (Zhao et al. 2020). INO-4800 е кандидат за ДНК ваксина срещу COVID-19, кодираща протеина COVID-19 S (Sarwar et al. 2020; Smith et al. 2020). Предклиничните резултати при мишки и морски свинчета показват хуморален и клетъчен имунен отговор. Във фаза I клинични проучвания две дози INO-4800 бяха инжектирани през ID пътеката, допълнени с EP чрез CELLECTRA®2000 Inovio Pharmaceutical (Diehl et al. 2013; Amante et al. 2015). Пълен имунен отговор беше обяснен въз основа на антитела и клетъчни отговори при 34 от 36-те участници в тяхното клинично изпитване фаза I. Наблюдавани са десет съобщени нежелани реакции (AE) без никакви сериозни нежелани реакции (SAE) (фаза). Беше стартирано клинично изпитване фаза I/II за оценка на имуногенността, безопасността и поносимостта на INO- 4800 (Tebas et al. 2019). INO-4800 има подобни условия на съхранение (Smith et al. 2020), с надеждата за по-лесно разпространение на ваксината. Освен това някои други групи ДНК ваксини срещу COVID-19 започнаха изпитвания. През юни 2020 г. клинично изпитване фаза I и IIa за GX-19 стартира набиране на персонал. ДНК ваксина, AG0301-COVID-19, произведена от съвместните опити на университета в Осака (Япония), Takaro Bio и AnGes, стартира набиране на персонал за фаза I и II клинични изпитвания през юли 2020 г. за оценка на неговата имуногенност и безопасност (Speiser and Bachmann 2020). Бяха проведени клинични изпитвания фаза I и II за оценка на имуногенността и безопасността на три дози ZyCoV-D (Kumar et al. 2021). Тази перорална ваксина кодира шипов протеин в плазмидната ДНК, динамично амплифициран в живата Bifidobacterium longum, добре позната чревна пробиотична бактерия. Беше стартирано друго клинично изпитване фаза I за оценка на CORVax12, ДНК ваксина, кодираща шиповия протеин. Беше изследвана ефективността на електропориран CORVax12 самостоятелно или в комбинация с друг плазмид, кодиращ интерлевкин 12 (IL-12). Разнообразие от COVID-19 иРНК ваксини са в процес на разработка и са разкрили обещаващи резултати (Leitner et al. 1999; Croyle et al. 2001). Разнообразен подход за разработване на RQ3013-VLP (кодиращ S, E и M протеини) е ефективен in vivo с помощта на mRNA коктейл. Тази иРНК ваксина беше интегрирана с променени нуклеозиди и след това опакована в LNP и разкри способността за предизвикване на силни клетъчни и хуморални имунни отговори при мишки (Le et al. 2020; Lu et al. 2020a). Създадена ДНК ваксина с домен на аргинил-глицил-аспарагинова киселина (RGD) в две дози от 60 µg с помощта на електропорация подобри ефектите при BALB/cJ мишки (Guo et al. 2021). IM + струйното инжектиране на ДНК ваксина в единична доза (0,2 mg) може да имунизира сирийските хамстери (Brocato et al. 2021). Друга ДНК ваксина, използваща S протеин, подложен на три дози, защитава резус макаците (Yadav et al. 2021). Сливането на RBD с preS1 амино-терминала на вируса на хепатит B и IM инжектиране за три дози (седмици 0, 2 и 4) в C57BL/6 мишки провокира хуморални и клетъчни имунни отговори (Jeong et al. 2021). Освен това, IM инжектирането на S протеинова плазмидна ДНК и S1 субединица (рекомбинантен протеин) в три дози на седмици 0, 2 и 8 при макаци Rhesus стимулира неутрализиращите антитела (Prompetchara et al. 2021). IM+EP инжектирането на S протеин в три дози (седмици 0, 2 и 4) при ICR мишки стимулира хуморални и клетъчни отговори (Li et al. 2021). Други ДНК ваксини в клинични изпитвания са включили S протеин във фази I/II през юни 2022 г. (NCT04445389, IM път при възрастни на възраст 18–50 години), юли 2021 г. (NCT04463472, IM път при възрастни на възраст 20–60 години), Септември 2021 г. (NCT04527081, IM път при възрастни на възраст 20–65 години) и фаза I (NCT04336410, ID път на 18 години и повече), февруари 2022 г. (NCT04334980, перорално при възрастни на 18 години и повече) и юни 2021 г. ( NCT04591184, IM път при възрастни 18–84 години). Освен това иРНК ваксините в клиничните изпитвания включват тези във фаза II през ноември 2021 г. (NCT04515147, IM, 18–60 години), фаза II-III през декември 2022 г. (NCT04368728, IM при възрастни 18–85 години) и фаза I през юни 2021 г. (NCT04566276, IM при възрастни 18–75 години). COVID-eVax беше базирана на RBD ваксина, която предизвика достатъчен имунен отговор при мишки, порове и плъхове след 38 дни (Conforti et al. 2022). Две (X-19 и GX-19N) ДНК ваксини, кодиращи шипове и нуклеокапсидни протеини, бяха оценени във фаза I изпитвания сред възрастни на възраст 19–49 години и свързващите антитела бяха откриваеми при втората доза от ваксинацията. Безопасността и поносимостта на тези ваксини бяха потвърдени, където GX-19N индуцира по-високи нива на Т клетки и отговори на антитела (Ahn et al. 2022). Xcl1-SARS-CoV-2 шипова фузионна ДНК ваксина предизвиква по-висок процент на антитяло и Т-клетъчно-медиирани отговори в сравнение със съдържащ плазмид шипов ген поотделно in vitro и in vivo (Qi et al. 2022). Скорошна бакуловирусна COVID-19 Делта ДНК ваксина може да защити 100% от мишките срещу COVID-19 (Jang et al. 2023). Линейна ДНК (linDNA), кодираща SARS-CoV-2 RBD (Lin-COVIDeVax), успя да предизвика антитела и Т-клетъчни отговори и да осигури безопасност и липса на неблагоприятни ефекти (Conforti et al. 2023). Таблица 1 представя клинични изпитвания и одобрени ваксини на базата на нуклеинова киселина срещу COVID-19. Според актуализирани данни 229 820 324 лица са получили ваксини срещу COVID-19 по целия свят, сред които тези от африканските страни са имали по-ниски нива на ваксиниране (https://www.usnews.com/news/coronavirus-and -ваксини-новини, https://www.bloomberg.com/graph ics/covid-vaccine-tracker-global-distribution/). Съответно нивото на ваксиниране е свързано с икономическите условия на различните региони/области.

Потенциални опасения за безопасността на ваксините срещу COVID‑19

Мониторингът на безопасността на всяка разработена превантивна или профилактична ваксина е един от съществените аспекти. Използването на токсични химикали или клетъчна култура не се изисква в процесите на производство на иРНК ваксина, поради което е известна като безопасна платформа. Краткото време за производство също намалява риска от замърсяване от микроорганизми (Wang et al. 2020). Най-често съобщаваните ефекти включват главоболие, умора и други системни тежки събития, като температура, втрисане, миалгия, повръщане, коремна болка и редки съобщения за диария. Въпреки това не е наблюдавана смърт при реципиенти на mRNA ваксина (Chapin-Bardales et al. 2021; Skowronski and De Serres 2021). Някои системни нежелани реакции, като анафилаксия, обикновено се съобщават при лица с анамнеза за алергия и се оценяват на 2,5–11,1 случая на милион дози (Shimabukuro et al. 2021). Силният имунен отговор при хора, по-млади от другите, може да доведе до сериозни системни събития и повече странични ефекти се съобщават след инжектирането на втора доза ваксина в сравнение с първата доза (Male 2021; Skowronski and De Serres 2021). В допълнение, болка на мястото на инжектиране, зачервяване и подуване се съобщават като най-локалните странични ефекти (Anand and Stahel 2021). Въз основа на достатъчно доказателства от одобрени иРНК ваксини, включително Pfizer/BioNTech и Moderna, не е демонстриран риск от спонтанни аборти по време на бременност (процент=0%) (мъжки 2021 г.). Забележимо е, че ДНК ваксините са достатъчно безопасни, но не винаги имуногенни; следователно достатъчен имунен отговор се нуждае от допълнителни дози. Хуморалният имунен отговор не е последователен при изпитвания при хора, докато клетъчният имунитет изглежда по-често срещан. Съответно, безопасността на ДНК ваксините сред по-възрастното и по-младото население е по-благоприятна (Ledgerwood et al. 2011; Houser et al. 2018; Carter et al. 2019). Опасенията за безопасността намекват за възможното интегриране на трансфектирана ДНК в зародишната линия и соматичните клетки на гостоприемника. В тези случаи дисрегулацията на генната експресия вероятно се появява заедно с множество значителни мутации. Независимо от това, само екстрахромозомни и дефицитни плазмиди за хромозомна интеграция обикновено се използват при разработването на ДНК ваксина. Освен това повечето плазмиди остават на мястото на приложение (Schalk et al. 2006). Неотдавнашен систематичен преглед и мета-анализ показаха, че иРНК ваксините са свързани с по-високи нежелани реакции в сравнение с други платформи (Kouhpayeh и Ansari 2022). Наскоро беше наблюдаван рядък случай на миозит, свързан с BNT162b2 иРНК ваксина, при 34--годишна жена (Magen et al. 2022). ДНК метилирането и съответните епигенетични промени също нарушават ефикасността на ДНК и иРНК ваксините (Pang et al. 2022). Трябва да се отбележи, че няколко одобрени ваксини с нуклеинова киселина (ZyCoV-D, ДНК плазмидна ваксина, използвана интрадермално, Индия), BNT162b2 (mRNA, 2 дози, Германия), mRNA- 1273 (Moderna, САЩ, 2 дози), ARCoV (WALVAX, Китай) и клинични изпитвания, включително 302-COVID19 (ДНК плазмидна ваксина, фаза II/III мускулно, Япония), INO-4800 (ДНК плазмид, фаза II/III, интрадермално, Китай), GX{{36 }}N (ДНК ваксина, Genexine, фаза II/III), Covigenix VAX-001 (ДНК ваксина, Entos Pharmaceuticals, фаза I/II, интрамускулно), COVID-eVax (ДНК ваксина, фаза I/II, интрамускулно , Рим) и bacTRL-Spike (ДНК ваксина, фаза I, орална, Symvivo) са разработени (Sheridan 2021; Liu и Ye 2022a). Тези ваксини са стимулирали както хуморалния, така и клетъчния имунитет, с изключение на GX-19N и AG0302- COVID-19. Някои неблагоприятни ефекти от ваксини на базата на нуклеинова киселина срещу COVID-19 включват болка, лимфаденопатия, еритема, зачервяване, подуване, гадене, умора, артралгия, миалгия, треска, кардиореспираторен арест, инсулт, реакция на свръхчувствителност, алкохолно чернодробно заболяване, парализа на Бел , пароксизмална вентрикуларна аритмия и смърт (Norquist et al. 2012; McNeil and DeStefano 2018; Baden et al. 2021; Momin et al. 2021; Liu and Ye 2022b, 2022a).

Фенилетанол гликозидът е основният активен компонент на Cistanche deserticola

Заключение

Бързата пандемия от COVID-19 доведе до незадоволена нужда от разработване на ефективни ваксини за предотвратяване на болестта. Въпреки че имуногенността на ДНК ваксините при животни е приемлива, клиничното валидиране е оправдано при хора. РНК ваксините могат да предоставят подходящи имунологични характеристики и значителни предимства пред ДНК ваксините. Проблемите с нестабилната природа на РНК са решени с помощта на подходящи подходи за съхранение и формулировки за спиране на нейното разграждане. Безопасността на ваксината също е важна и не може да бъде компрометирана за по-голяма ефективност. Има одобрени ваксини на основата на нуклеинова киселина за контрол на разпространението на COVID-19. Проследяването на участниците трябва да продължи. Има нужда от обучение относно страничните ефекти на базираната на нуклеинова киселина ваксина срещу COVID-19. Освен това, преоценката на ваксината и разработването на поливалентни ваксини или пан-коронавирусни стратегии е обещаващо, като се има предвид повторната поява на нови варианти, които предизвикват безпокойство.

Таблица 1 Клинични изпитвания и одобрени ваксини срещу COVID-19 и техните характеристики

Препратки

Abdelmageed MI et al (2020) Проектиране на мултиепитопна пептидна ваксина срещу Е протеина на човешки COVID-19: имуноинформатичен подход. Int J Biomed Clin Anal. https://doi.org/ 10.1155/2020/2683286

Abera G, Berhanu G, Tekewe A (2012) Рибозими: ензими на нуклеинова киселина с потенциални фармацевтични приложения: преглед. Pharmacophore 3: 164-178

Ahn JY et al (2022) Безопасност и имуногенност на две рекомбинантни ДНК COVID-19 ваксини, съдържащи кодиращите области на шипа или шипа и нуклеокапсидните протеини: междинен анализ на две отворени, нерандомизирани, фаза 1 изпитвания при здрави възрастни. Lancet Microbe 3:e173–e183. https://doi.org/10.1016/ S2666-5247(21)00358-X

Aihara H (1998) Miyazaki J. Генен трансфер в мускул чрез електропорация in vivo. Nat Biotechnol 16:867–870. https://doi.org/10. 1038/nbt0998-867

Alberer M et al (2017) Безопасност и имуногенност на иРНК ваксина срещу бяс при здрави възрастни: отворено, нерандомизирано, проспективно клинично изпитване за първи път при хора фаза 1. Ланцетът 390:1511–1520.https://doi.org/10.1016/s0140-6736(17)31665-3

Amante DH et al (2015) Модели на трансфекция на кожата и кинетика на експресия на доставяне на плазмид с електропорация, използвайки CELLECTRA-3P, преносимо устройство за дермална електропорация от следващо поколение. Методи за човешка генна терапия 26: 134–146. https:// doi.org/10.1089/hgtb.2015.020

Anand P, Stahel VP (2021) Преглед на безопасността на Covid-19 mRNA ваксини: преглед. Пациент Saf Surg 15:20. https://doi.org/10.1186/ s13037-021-00291-9

Baden LR et al (2021) Ефикасност и безопасност на ваксината mRNA-1273 SARS CoV-2. N Engl J Med 384: 403–416. https://doi.org/10. 1056/NEJMoa2035389

Becker PD, Noerder M, Guzmán CA (2008) Генетична имунизация: бактерии като средства за доставка на ДНК ваксина. Hum Vaccin 4:189–202.https://doi.org/10.4161/hv.4.3.6314

Borah P et al (2021) Гледни точки относно кандидатите за РНК ваксина срещу COVID-19. Front Mol Biosci. https://doi.org/10.3389/fmolb. 2021.635245

Brocato RL et al (2021) Защитна ефикасност на SARS-CoV-2 ДНК ваксина при див тип и имуносупресирани сирийски хамстери. Npj Ваксини 6:1–7.https://doi.org/10.1038/s41541-020-00279-z

Brüssow H (2020) Усилия към ваксина срещу COVID-19. Environ Microbiol 22: 4071–4084. https://doi.org/10.1111/1462-2920. 15225

Buchholz UJ et al (2004) Принос на структурните протеини на коронавирус на тежък остър респираторен синдром към защитния имунитет. Proc Natl Acad Sci 101:9804–9809. https://doi.org/ 10.1073/pnas.0403492101

Campbell JD (2017) Разработване на CpG адювант 1018: казус. Vaccine Adjuv. https://doi.org/10.1007/ 978-1-4939-6445-1-2

Carter C et al (2019) Безопасност и имуногенност на изследвана сезонна противогрипна хемаглутининова ДНК ваксина, последвана от тривалентна инактивирана ваксина, приложена интрадермално или интрамускулно при здрави възрастни: Отворено рандомизирано фаза 1 клинично изпитване. PLoS One 14:e0222178. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0222178

Chapin-Bardales J, Gee J, Myers T (2021) Реактогенност след получаване на базирани на иРНК ваксини срещу COVID-19. ДЖАМА. https://doi. org/10.1001/jama.2021.5374

Chen Y, Cheng L, Lian R, Song Z, Tian J (2021) Изследването на ваксината срещу COVID-19 се фокусира върху безопасността, ефикасността, имуноинформатиката и производството и доставката на ваксина: библиометричен анализ, базиран на VOSviewer. Biosci Trends. https://doi.org/10.5582/bst.2021. 01061

Choi Y, Chang J (2013) Вирусни вектори за приложения на ваксини. Clin Exp Vaccine Res 2:97.https://doi.org/10.7774/cevr.2013.2.2.97

Chowdhury MA, Hossain N, Kashem MA, Shahid MA, Alam A (2020) Имунен отговор при COVID-19: Преглед. J Инфектирайте общественото здраве. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2020.07.001

Coban C, Kobiyama K, Jounai N, Tozuka M, Ishii KJ (2013) ДНК ваксини: проста материя, чувствителна към ДНК? Hum Vaccin Immunother 9: 2216–2221.https://doi.org/10.4161/hv.25893

Conforti A et al (2022) COVID-eVax, кандидат за електропорирана ДНК ваксина, кодираща SARS-CoV-2 RBD, предизвиква защитни реакции при животински модели. Mol Ther 30:311–326. https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2021.09.011

Conforti A, Sanchez E, Salvatori E, Lione L, Compagnone M, Pinto E et al (2023) Линеен кандидат за ДНК ваксина, кодиращ SARS CoV-2 рецепторно свързващ домейн, предизвиква мощен имунен отговор и неутрализиращи антитела при домашни котки. Mol Ther-Metho Clinic Dev 28: 238–248. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022. 12,015

Croyle M, Cheng X, Wilson J (2001) Разработване на формулировки, които подобряват физическата стабилност на вирусни вектори за генна терапия. Gene Ther 8: 1281–1290.https://doi.org/10.1038/sj.gt.3301527

Cu Y et al (2013) Подобрено доставяне и ефективност на самоусилващи се иРНК ваксини чрез електропорация in situ. Ваксини 1:367–383. https://doi.org/10.3390/vaccines1030367