Производство на липаза от Yarrowia Lipolytica при ферментация в твърдо състояние с използване на вторични продукти от амазонски плодове и соево брашно като субстрат, част 1

Резюме: Производството на полиненаситени мастни киселини от рибено масло, което е свързано с различни ползи за здравето, включително ефекти срещу сърдечно-съдови заболявания, антихипертензивни, противоракови, антиоксидантни, антидепресивни, против стареене и антиартритни ефекти, наред с други, може да се извърши успешно чрез приложението на липаза. Въпреки това, високата цена, свързана с производството на ензими, може да направи процеса неосъществим и по този начин трябва да се проучат алтернативни субстрати за решаване на тези проблеми. Това изследване има за цел да произведе липаза от Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 при ферментация в твърдо състояние, използвайки странични продукти от хранително-вкусовата промишленост (кюспе от андироба и соево брашно) и да провери потенциалното приложение в първоначалната хидролиза на рибено масло за допълнително производство на полиненаситени мастни киселини в подходящ процес. Беше извършен скрининг за анализ на комбинации от кюспе и соево брашно от andiroba в различни пропорции (0:1{{20}}0 до 100:0, съответно) на 48 часа от процес на ферментация. След това твърдата матрица, съставена от соев шрот и кюспе от андироба, беше допълнена със соево масло и Tween 80 за подобряване на активността на липазата. Ензимният екстракт се характеризира с протеиновия профил чрез електрофореза. И накрая, ензимният екстракт и полученият твърд биокатализатор бяха приложени за оценка на потенциалната хидролиза на рибеното масло в първоначално проучване. Максимална липолитична активност (63,7 U·g -1) се постига при използване на кюспе от andiroba и соево брашно (50:50) след 24 часа ферментация. Соево масло 1,5 процента и Tween 80 (0,001 процента) в емулсия осигуряват увеличение от 15-пъти (82,52 U·g −1) на ензимната активност. Електрофоретичният анализ демонстрира лента между 37 и 40 kDa, която може да бъде свързана с липаза, и лента от 75 kDa, отнасяща се до субединицата на -конглицинина, присъстваща в соевото брашно. След 48 часа твърдият биокатализатор показа по-висока степен на хидролиза (DH) (71,0 процента) от ензимния екстракт (61,5 процента). Твърдият биокатализатор е стабилен при съхранение при стайна температура в продължение на 7 месеца. Производството на липази, използвайки вторичен продукт от плодовете на Amazon и соево брашно при ферментация в твърдо състояние, е жизнеспособно, както и прилагането на екстракта и твърдия биокатализатор в първоначалното приложение за хидролиза на рибено масло за по-нататъшно производство на полиненаситени мастни киселини в индустриален подходящ процес.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху добавката Cistanche Tubulosa

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключови думи: Carapa guianensis Aublet; производство на липаза; твърда ферментация; устойчивост; Яровия липолитика

1. Въведение

Амазонските плодове имат висок биотехнологичен потенциал за изследване и приложение в различни сектори на икономиката като фармацевтичната и хранително-вкусовата промишленост поради наличието на макро и микроелементи, включително протеини, въглехидрати, фибри, каротеноиди, полиненаситени мастни киселини и витамини, наред с други [1].

Andiroba (Carapa guianensis Aublet) е растение от Амазонка, което произвежда плодове от маслодайни семена с търговски потенциал за извличане на масло с лечебни свойства като аналгетичен, анти-едематогенен и противовъзпалителен ефект [2,3]. В допълнение, той представя интересни технологични свойства за козметичната индустрия, тъй като е богат на омекотяващи съединения, които се доставят като суровина за козметичните индустрии по целия свят [4]. Плодът андироба е капсула, която тежи между 90 и 540 g и се състои от 1 до 16 кафяви семена, тежащи между 1 и 70 g. За да се получи маслото, семената се натрошават на малки парчета и се сушат в пещи, докато достигнат 8% влажност. След това те се пресоват в метални преси тип експелер [5], произвеждайки масло от андироба, което представлява голям промишлен интерес и висока търговска стойност, тъй като този продукт може да надхвърли 50 долара за литър, в зависимост от неговите характеристики [6].

Годишното производство на андироба е около 122,16 тона [7], а производството на масло не надвишава 30 процента от теглото на плода [8]. Тези цифри означават, че годишно се генерират приблизително 36 648 тона масло и 85 512 тона кюспе. Страничният продукт, получен след изследването на тези плодове, все още може да съдържа липиди (20 процента), пепел (4,2 процента), протеини (7,3 процента) и въглехидрати (17 процента) и поради този състав, използването му в биотехнологични процеси е интересно [9]. Един от начините за прилагане на тези странични продукти е чрез ферментация в твърдо състояние (SSF) за получаване на съединения с висока добавена стойност като ензими.

Ферментацията в твърдо състояние се извършва с помощта на твърда матрица в отсъствието на свободна вода, но твърдото вещество трябва да има достатъчно влага за микробен растеж [10]. Съобщава се, че използването на SSF произвежда ароматни съединения [11], антибиотици [12], органични киселини [13], биопестициди [14], биосърфактанти [15], ензими [16] и други съединения. Производството на ензими в SSF изисква използването на микроорганизми като гъбички и бактерии, които растат при условия, обичайно използвани в SSF. Сред микроорганизмите, използвани биотехнологично, дрождите се открояват, особено Yarrowia lipolytica, поради потенциала си да произвежда липази [10].

Yarrowia lipolytica е неконвенционална мая, която има максимална температура на растеж от 32–34 ◦C и не е в състояние да оцелее при анаеробни условия. Y. lipolytica е класифициран като общопризнат като безопасен (GRAS) от Администрацията по храните и лекарствата (FDA) и това позволява безопасното му използване в хранителни и фармацевтични процеси/продукти [9]. Признато е, че тази мая произвежда вътреклетъчни, извънклетъчни и свързани с клетъчната стена липази. Yarrowia lipolytica може да произвежда липази, използвайки различни източници на въглерод, включително масла, метилови естери и мастни киселини [17]. Споменатите характеристики правят Y. lipolytic универсален за биотехнологични приложения, особено при производството на липази.

Липазите (триацилглицерол ацил хидролази EC 3.1.1.3) са ензими, които катализират хидролизата на триглицеридите до свободни мастни киселини и глицерол в присъствието на вода [18]. Липазите могат да се прилагат в много сектори, включително хранително-вкусовата промишленост, между другото. Съобщава се за употребата на липази при хидролизата на мляко, мазнини и зреене на сирене, при модифицирането на маслените мазнини, при подобряването на аромата на напитки и хлебни изделия, при дресинг на храни и в развитието на вкуса на месо и риба [19]. В допълнение, липазите вече са приложени за хидролиза на масло до концентрацията на полиненаситени мастни киселини, които могат да се използват в хранително-вкусовата промишленост като обогатена добавка [20].

Няколко проучвания съобщават за използването на отпадъци и странични продукти при производството на липаза, сред които соеви люспи, кори от диня, брашно от памучно семе, соево брашно и кюспе от андироба [9, 21–26]. Все още обаче не е докладвано за комбинацията от кюспе от andiroba и соево брашно в различни пропорции за производството на липаза от Yarrowia lipolytica. Това изследване имаше за цел да произведе Yarrowia lipolytica липаза чрез ферментация в твърдо състояние (SSF), използвайки странични продукти от хранително-вкусовата промишленост (кюспе от андироба и соево брашно), които да се прилагат при хидролизата на рибено масло за по-нататъшно производство на полиненаситени мастни киселини.

2. Резултати и дискусия

Стратегията, приета за производство на липаза от Yarrowia lipolytica в SSF, използвайки комбинацията от кюспе от andiroba и соево брашно в различни пропорции, се основава на блок-схемата, показана на Фигура 1.

2.1. Характеристика на агропромишлени странични продукти

Физико-химичният състав на кюспета от андироба е показан в таблица 1. Кюспето от андироба съдържа 13,7 процента протеини, 26,9 процента етерен екстракт, 0.4 процента въглехидрати и 45,6 процента неразтворими фибри. От друга страна, соевото брашно съдържа 48,3 процента протеини, 2,4 процента етерен екстракт, 14.{15}} процента въглехидрати и 18.{17}} процента неразтворими фибри. Всяко хранително вещество, присъстващо в тортата, има роля в микробния метаболизъм. Съдържанието на азот е от съществено значение за синтеза на протеини, нуклеотиди и вторични метаболити за растежа и метаболизма на микроорганизмите, както и за биосинтезата на ензими [25]. Остатъчното маслено съдържание (етерен екстракт), присъстващо в кюспета на andiroba, действа като източник на въглерод, участвайки в образуването на биомаса и производството на енергия за изпълнение на клетъчната функция [26]. В допълнение, маслото, присъстващо в тортата andiroba, е хидрофобен субстрат и може да действа като индуктор в производството на липаза, както се съобщава от Brígida et al. [17]. Първоначално липазата, свързана с клетката на микроорганизма, хидролизира липида, присъстващ в средата, и инициира клетъчния растеж. По време на процеса наличността на субстрата намалява, така че организмът секретира извънклетъчни липази [27].

Пепелта, определена количествено в кюспета от андироба (4,5 процента) и соевото брашно (6,3 процента), представлява съдържанието на няколко минерала и може да се използва в метаболизма на микроорганизма; въпреки това, някои минерали като натриеви и манганови йони могат да инхибират растежа на Yarrowia lipolytica [17] и следователно е необходимо правилно да се оценят страничните продукти.

Съдържанието на въглехидрати и фибри в суровините може да се използва в микробното хранене по ограничен начин, тъй като Yarrowia lipolytica не произвежда амилази или целулази и хемицелулази [28,29], което затруднява разграждането на тези полизахариди и освобождаването на богати на въглерод съединения към да се използва в метаболизма на дрождите. По този начин се предполага, че растежът на дрождите се дължи главно на наличието на хидрофобни субстрати в кейка.

Стойностите на порьозността на кюспета andiroba и соевия шрот са показани в таблица 1. Според таблица 1 порьозността на кюквата andiroba и соевия шрот са 0.425 и 0.412 m3 въздух m−3 легло, съответно. По-високите стойности на порьозност са свързани с подобрен трансфер на маса и топлина по време на ферментация, което води до подобрено производство на ензими. В допълнение, порьозността е важен параметър за разбиране на влажността на средата: високите стойности на влага могат да бъдат свързани с ниски стойности на порьозност и това засяга аерирането на средата и следователно производството на липаза [22].

2.2. Производство на липаза от SSF

Използването на странични продукти за производство на липаза чрез ферментация в твърдо състояние и производството на стабилни твърди биокатализатори позволява прилагането на ензима директно в реакционната среда, намалявайки разходите, свързани с екстракцията и пречистването на ензима за последващо приложение. Освен това, използването на странични продукти осигурява хранителни вещества за микробния растеж и развитие, действа като физическа подкрепа за микроорганизма и намалява разходите за хранителна среда за процеса. В допълнение, ферментацията в твърдо състояние позволява използването на остатъци и агропромишлени странични продукти, като алтернатива за намаляване на екологичните проблеми, свързани с неподходящо изхвърляне на отпадъци [30].

След характеризиране, страничните продукти се използват като твърд матричен субстрат при производството на липаза с помощта на SSF, като се наблюдават за липолитични и протеолитични активности, влага и рН по време на процеса на ферментация. Фигура 2 показва измерените променливи профили на отговора за 48 часа ферментация с използване на Y. lipolytica и комбинацията от кюспе от andiroba и соево брашно в различни пропорции като субстрати.

По отношение на използването на субстратите поотделно, максималната липолитична активност от 4,36 U·g −1 беше установена за соево брашно (0:100; Фигура 2A) и 13,48 U·g −1 за кюспе andiroba (100:0; Фигура 2B), съответно след 12 и 24 часа. След достигане на точката на най-голяма липазна активност се наблюдава намаляване на стойностите й, което може да е свързано с повишаване на протеазната активност. Този ензим има афинитет към протеинови структури и поради това може да действа за разграждане на структурата на липазата, намалявайки нейната активност [24,31,32].

Торта Andiroba и соево брашно, използвани в различни пропорции от (25:75), (50:50) и (75:25), дават максималните стойности на липазна активност от 57,21 U·g −1 след 12 часа (Фигура 2C), 63,70 U·g -1 (Фигура 2D) и 40,13 U·g -1 (Фигура 2E) след 24 часа ферментация, съответно, което показва, че сместа от матрици може да подобри активността на липазата. Подобряването на ензимната активност след комбинация от кюспе от andiroba и соев шрот може да се обясни чрез наблюдение на физикохимичния състав на двете суровини, както е показано в таблица 1. Соевият шрот има високо съдържание на протеин, докато кюспето от andiroba има по-високо съдържание на масло . По този начин сместа от маслена кюспе andiroba и соево брашно за производство на липаза се оказа по-интересна от използването на всеки един поотделно и това благоприятства независимостта от един единствен субстрат, както и използването на повече от един страничен продукт.

Първоначалното рН на матриците е кисело поради наличието на свободни мастни киселини, присъстващи в маслената матрица, и това условие благоприятства растежа на Yarrowia lipolytica, тъй като тези дрожди се нуждаят от леко кисела среда за добър растеж [33], като се избягва етап на средно буфериране. Има също така постепенно повишаване на рН по време на процеса в матриците, вариращи от 6,39 до 7,32 (Фигура 2A), 5,69 до 6,82 (Фигура 2C), 5,64 до 7,68 (Фигура 2D) и 5,21 до 6,03 (Фигура 2E). В матрицата, съдържаща само кюспе от andiroba, се наблюдава постепенно понижаване на pH (4,8 до 4,26, Фигура 2B) поради остатъчното съдържание на масло в твърдата среда, тъй като маслото първоначално се хидролизира от липаза, като не се консумира от дрождите в първите часове, като по този начин се поддържа леко кисело pH.

По отношение на съдържанието на влага, не се наблюдават промени по време на ферментацията, което показва, че инкубационната система с наситена влага и матриците са ефективни при задържане на влагата. Ферментационна среда, способна да поддържа оптимално съдържание на влага, е от съществено значение за производството на липаза от Yarrowia lipolytica [24], тъй като този параметър може да повлияе на аерацията на системата. Освен това е необходимо идеалното съдържание на влага, за да се осигури вода, необходима за метаболизма на микроорганизма и за разтваряне на хранителните вещества. Когато съдържанието на влага е над идеалното, може да възникне лоша дифузия на кислород в системата, която е извън идеалния диапазон за микроорганизма [34].

Някои проучвания съобщават за използването на странични продукти като субстрати при ферментация в твърдо състояние. В тези проучвания обаче има включване на чисти източници на въглерод и/или азот като глюкоза, екстракт от дрожди, пептон и урея [35–37] в количества, които могат да увеличат разходите за процеса. Идеалната матрица трябва да има някои характеристики за приложението, което включва действие като опора, осигуряване на необходимите хранителни вещества за растежа на микроорганизма и секрецията на биотехнологичния продукт, който представлява интерес. Намирането на всички тези характеристики в страничен продукт може да бъде трудно, което затруднява намирането на адекватна система за процес на ферментация; следователно търсенето на нови суровини и тяхното комбиниране трябва да бъде непрекъснато [16].

По този начин, съотношението 50:50 между тортата andiroba и соевото брашно беше избрано за по-нататъшни тестове. Изборът на това условие е свързан с валоризирането на неизследвани отпадъци от региона на Амазонка.

2.3. Добавка на ферментационната матрица

Във втората част на тази работа, кюспета и соевото брашно от andiroba в съотношение 50:50 бяха допълнени с 1,5 процента соево масло, както е показано на фигура 3. Добавката беше извършена, за да се провери дали наличността на по-лесно асимилиран източник на въглерод (соево масло) подобрено производство на липаза относно остатъчното съдържание на масло, присъстващо в маслената кюспе Andiroba. Максималната липазна активност от 56,32 U·g -1 се получава след 28 часа ферментация, а протеазната активност варира от 2,71 до 7,60 U·g -1. pH варира от 5,63 до 7,63 и влагата остава без големи колебания през целия период (53 до 58 процента). Както беше представено по-рано, липолитичната активност, получена след добавки, беше по-ниска от стойността, установена без добавки. Матричната добавка за производството на липаза е изследвана от Farias et al. [38] и Souza et al. [24]. Авторите откриват липазна активност от 139 U·g −1 и 93,9 U·g −1, използвайки съответно утайка и соево масло. Въпреки това, когато Souza et al. [24] извършват ферментация, използвайки само соево брашно (без добавки), авторите откриват 9,4 ± 0,3 U·g -1 липазна активност след 10 часа ферментация, демонстрирайки, че добавките повишават активността на липазата в изследваната ферментационна матрица.

Друг компонент, който обикновено се съобщава за добавка на среда, е Tween 80. Това постоянно се съобщава в литературата, тъй като този компонент може да повиши активността на липазата, когато се използва при потопена ферментация [39], но няма съобщения за използване на Tween 80 при ферментация в твърдо състояние. Tween 80 може да увеличи производството на извънклетъчна липаза по време на процеса на ферментация поради емулгиращия капацитет на субстрата и следователно да подобри достъпността на субстрата за микроорганизма, както и да промени клетъчната пропускливост [40]. Така беше проведено изследване, комбиниращо соево масло 1,5 (процент тегло/обем) и Tween 80 0.001 процента (тегло/обем) в емулсия за допълване на ферментационната твърда среда, както е показано на Фигура 4.

Относно добавките с Tween 80 беше потвърдено, че след 14 часа ферментация, липолитичната активност е 57,6 U·g -1. Същата стойност беше получена преди това само с добавяне на соево масло при 28 часа ферментация, което удължава процеса на ферментация и влияе върху жизнеспособността. Максималната липолитична активност след 20 часа ферментация беше 82,52 U·g −1, 1.46-кратно увеличение в сравнение с производството на липаза при използване само на соево масло и 8-h намаляване на времевия процес.

Дългите времена на ферментация увеличават цената на процеса, така че търсенето на идеален биномен микроорганизъм - среда, която произвежда липаза за по-кратко време (висока производителност) и която използва странични продукти като матрици, е интересно. Няколко проучвания в литературата съобщават за производството на липаза чрез SSF, за да се постигнат адекватни условия и да се направи възможно получаването на липази. Наблюдава се използването на различни суровини, включително соево брашно, рапица, кори от диня и кюспе от палмово масло, с активности, вариращи от 9 до 127 U·g −1 [9,22,24].

Sales, Castro, Ribeiro и Coelho [22] изследват производството на липаза от Y. lipolytica при ферментация в твърдо състояние, използвайки соево брашно, допълнено с кора от диня (5 процента), се получава подобрение на липазната активност с 31 процента, стойност, съответстваща на 75,22 U ·g −1. Souza и др. [41] произвеждат липаза от Y. lipolytica чрез ферментация в твърдо състояние за приложение в синтеза на търговски естери със стойност за хранително-вкусовата промишленост и резултатите показват, че най-добрите условия на ферментация за производство на биокатализатор е използването на соево брашно и соево масло ( 3 процента w/w). Ензимът, произведен при тези условия, позволява превръщането на до 92.9 за синтезиране на полезните естери с висока добавена стойност, използвани в хранително-вкусовата промишленост.

В допълнение към високите ензимни активности, получени в настоящата работа, можем да подчертаем допълнителните предимства: (i) възможността за използване на странични продукти с ниска експлоатация, с привлекателност за устойчивост за региона на Амазонка; (ii) възможността за комбинация от различни странични продукти, което позволява хранителна добавка за микробния метаболизъм; (iii) намаляване на натиска върху компоненти, които вече са широко използвани в промишлеността за биопроцеси, като например соев шрот; (iv) икономическа валоризация на регионите, произвеждащи странични продукти; (v) разширяване на опциите за субстрат за производство на липази и (vi) намаляване на оперативните разходи, наред с други предимства.

2.4. SDS-СТРАНИЦА

Суровият ензимен екстракт, получен след ферментация с помощта на матрица, съставена от кюспе от андироба и соево брашно (50:50) без добавки, се анализира в SDS-PAGE. Електрофоретичният анализ показа протеиновите ивици, съдържащи се в ензимния екстракт, както е представено на фигура 5.

Ивица 1 се отнася за стандартни протеинови маркери, а ивица 2 е пробата, получена от комбинацията от маслена кюспе andiroba и соево брашно в по-доброто изследвано съотношение (50:50). Възможно е да се визуализира лента около 37–40 kDa в суровия ензимен екстракт, която може да е свързана с липаза и/или естераза, произведени от Yarrowia lipolytica, както се наблюдава от Souza et al. [41], която също може да бъде основната екстрацелуларна липаза на Y. lipolytica (Lip2), която се произвежда широко във всички наши проучвания. Освен това се съобщава, че дори за ензими, които са свързани главно с клетъчната стена (Lip7 и Lip8) на Y. lipolytica, се наблюдава същата молекулна маса (37–41 kDa) [42].

Освен това, според резултатите, публикувани преди това от нашата изследователска група, същите ленти, представени тук, са свързани с активността на естераза и липаза от зимограмата, разкрита от -нафтил ацетат като субстрат [41], което ни позволи да ги съпоставим. Лентите от 75 kDa се отнасят до субединицата на -конглицинина, присъстваща в соевото брашно, както е установено от Sales et al. [22] и Cheng et al. [43] при ферментацията на соево брашно.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】