Лизозомната липидна пероксидация регулира туморния имунитет
Sep 19, 2023
Лизозомното инхибиране, предизвикано от инхибитори на палмитоил-протеин тиоестераза 1 (PPT1), като DC661, може да доведе до клетъчна смърт, но механизмът за това не е напълно разбран. Програмираните пътища на клетъчна смърт (аутофагия, апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) не са необходими за постигане на цитотоксичния ефект на DC661. Инхибирането на катепсините или хелатирането на желязото или калция не спасява цитотоксичността, предизвикана от DC661-. Инхибирането на PPT1 индуцира лизозомна липидна пероксидация (LLP), което доведе до пермеабилизация на лизозомната мембрана и клетъчна смърт, които могат да бъдат обърнати от антиоксиданта N-ацетилцистеин (NAC), но не и от други антиоксиданти за липидна пероксидация. Лизозомният цистеинов транспортер MFSD12 беше необходим за интрализозомния транспорт на NAC и спасяването на LLP. Инхибирането на PPT1 предизвиква присъща на клетката имуногенност с повърхностна експресия на калретикулин, която може да бъде обърната само с NAC. Третираните с DC661- клетки инициират наивни Т клетки и засилват медиираната от Т клетки токсичност. Мишки, ваксинирани с клетки, третирани с DC661-, породиха адаптивен имунитет и отхвърляне на тумора при "имунно горещи" тумори, но не и при "имунно студени" тумори. Тези констатации показват, че LLP води до лизозомна клетъчна смърт, уникална имуногенна форма на клетъчна смърт, сочейки пътя към рационални комбинации от имунотерапия и лизозомно инхибиране, които могат да бъдат тествани в клинични изпитвания.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
Въведение
С окуражаваща активност в клинични изпитвания, които включват лизозомния инхибитор хидроксихлорохин (HCQ) (1), идентифицирането на палмитоил-протеин тиоестераза 1 (PPT1) като молекулярна мишена на хлорохиновите производни (2) и пускането на нови PPT1 инхибитори в клиничната практика проучвания (3, 4), има нужда да се разбере механизмът, чрез който лизозомните инхибитори индуцират клетъчна смърт и ефектът на лизозомното инхибиране върху туморния имунитет. Каноничният механизъм на лизозомна клетъчна смърт, описан за HCQ, включва пермеабилизация на лизозомната мембрана (LMP), изтичане на катепсини и активиране на каспаза-медиирана апоптоза (5, 6). По-рано показахме, че лизозомният инхибитор DC661 прониква в клетките в киселата туморна микросреда и се локализира в лизозомата по-ефективно от HCQ (2, 7). DC661 предизвиква мощна клетъчна смърт в много ракови клетъчни линии (2). DC661 свързва и инхибира PPT1, откислява лизозомата и инхибира автофагията. DC661 също индуцира LMP и повишава нивата на разцепената каспаза 3 (2, 7). През последните години са дефинирани нови механизми на клетъчна смърт, които имат имуногенни последици и включват некроптоза, фероптоза и пироптоза (8). Доказано е, че зависимата от лизозома автофагия разгражда МНС клас I (9), както и компоненти на имунопротеазомата (10), което предполага, че инхибирането на автофагията може да подобри обработката на антигена. Въпреки това, имуногенните ефекти на лизозомното инхибиране и последващата клетъчна смърт не са напълно характеризирани. За да се справим с тази празнина в знанията, ние изследвахме ефектите на DC661 върху каноничните механизми на клетъчна смърт, за да определим дали лизозомната клетъчна смърт е нейната форма на клетъчна смърт или просто предшественик на един от другите установени механизми. Открихме, че HCQ и DC661 индуцират значително увеличение само на малък брой протеини в протеома на меланома и повечето от тях са протеини, свързани с автофагия и апоптоза. Инхибиторите на програмираната клетъчна смърт (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) не смекчават цитотоксичните ефекти след лизозомно увреждане от DC661. Лизозомната липидна пероксидация (LLP) е основен двигател на LMP-индуцирана клетъчна смърт, свързана с експресията на калретикулин (CALR) върху клетъчната повърхност. Тази форма на клетъчна смърт може да бъде обърната само с помощта на антиоксиданта N-ацетилцистеин (NAC). NAC активността е нарушена от инхибирането на лизозомния цистеинов вносител MFSD12. LLP предизвиква имуногенни фенотипове, насърчаващи Т-клетъчно-медиирано убиване. Тези открития показват, че лизозомната клетъчна смърт е потенциално уникална форма на имуногенна клетъчна смърт.
растение цистанче, повишаващо имунната система
Резултати
Лизозомното инхибиране предизвиква значителни промени в протеома, свързани с аутофагия и апоптоза. За да установим цитотоксичните ефекти на лизозомните инхибитори, ние оценихме жизнеспособността на A375P меланом, RKO карцином на дебелото черво и MIA PaCa-2 клетъчни линии на рак на панкреаса, третирани с вакуоларния H+-ATPase инхибитор бафиломицин-A1 (1 00 nM); PPT1 инхибитори DC661 (3 μM) или HCQ (10 μM или 30 μM); палмитат миметик хексадецил сулфонил флуорид (HDSF; 60 μM); инхибитори на катепсин пепстатин А (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) или PepA+E64; и разрушител на лизозомната мембрана Leu-Leu метилов естер хидробромид (20 μM) за 48 часа. Само бафиломицин-A1 и DC661 причиняват значително намаляване на клетъчната жизнеспособност в раковите клетъчни линии (Фигура 1A и допълнителна фигура 1A; допълнителен материал, достъпен онлайн с тази статия; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), като DC661 произвежда по-дълбоко намаляване на клетъчната жизнеспособност от бафиломицин-А1. Въз основа на тези данни и подобните на фармакологичните лекарства свойства на производните на хлорохина, ние фокусирахме нашето изследване върху производните на хлорохина като инструменти за разбиране на лизозомната клетъчна смърт. Безпристрастен глобален протеомен анализ беше приложен към A375P меланомни клетки, третирани с DC661 (3 μM) или по-малко мощния HCQ (10 μM или 30 μM) за 24 часа. От 4 264 количествено определени протеини с висока степен на сигурност, само 87 и 55 протеина са значително увеличени с DC661 (3 μM) и HCQ (30 μM), съответно; освен това, 14 и 15 протеина бяха значително намалени с DC661 (3 μM) и HCQ (30 μM), съответно (абсолютна промяна на пъти по-голяма от 2; q <0,05) с DC661 (3 μM) или HCQ (30 μM), съответно , в сравнение с управлението на превозното средство. По-ниската доза HCQ (10 μM) не показва значителни протеинови промени в сравнение с контролата на носителя. Първите 50 протеина, които са значително увеличени след лечение с DC661, са свързани главно с аутофагия и апоптоза и подобни промени са наблюдавани за по-високата доза HCQ (Фигура 1B). Поради тези причини избрахме да съсредоточим допълнителни проучвания върху по-мощния DC661. Примери за някои от най-големите протеинови промени, свързани с аутофагията и апоптозата, са дан1-свързващ протеин 1 (TAX1BP1; увеличен 15-кратно); BCL2-взаимодействащ протеин 3 (BNIP3; увеличен 6-кратно); съсед на BRCA1 ген 1 протеин (NBR1; увеличен 12-кратно); секвестозома-1 (SQSTM1/p62; увеличен 5-кратно); ядрен рецепторен коактиватор 4 (NCOA4; увеличен 3-кратно); и LC3B (MAP1LC3B; увеличен 3-кратно). Аполипопротеин B-100 (APOB; увеличен 66-кратно) е получен от фетален телешки серум и не е проучван допълнително. Имуноблотингът потвърди, че лечението с DC661 или по-високи концентрации на HCQ води до значително повишаване на експресията на автофагични товарни рецептори NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 и NCOA4 по начин, зависим от дозата и времето (допълнителна фигура 1, B и C). CRISPR/Cas9 KO на PPT1 в A375P клетки фенокопира ефектите на DC661 върху тези протеини в сравнение с техните WT аналози (допълнителна фигура 1D). Въпреки това, експресията на автофагични товарни рецептори и относителните увеличения, предизвикани от лечението с DC661, са променливи при рак на дебелото черво, рак на панкреаса и други клетъчни линии на меланома, в които DC661 демонстрира цитотоксичност (допълнителна фигура 1E). Това предполага, че самите автофагични карго рецептори, макар и повишени на ниво протеин, е малко вероятно да бъдат отговорни за клетъчната смърт след лечение с DC661. За да потвърдим това, ние се съсредоточихме върху рецепторите за автофагия TAX1BP1 и BNIP3, тъй като те имат известни проапоптотични ефекти в раковите клетки (Фигура 1C). TAX1BP1 е адаптер за автофагия (11) и също така регулира апоптозата, индуцирана от инхибитори на протеиновия синтез или агенти, увреждащи ДНК в раковите клетки (12). Нокдаунът на TAX1BP1 от siRNA (Фигура 1D) не повлиява DC661-индуцирана цитотоксичност при краткосрочни (Фигура 1E) и дългосрочни анализи на жизнеспособност (Фигура 1F). Тези резултати показват, че TAX1BP1 не играе съществена роля в медиираната от DC{126}}цитотоксичност. BNIP3 е проапоптотичен протеин, който уврежда митохондриалната биоенергетика и регулира митофагията (13). Ефективният нокдаун на BNIP3 (Фигура 1G) не повлиява DC661-индуцираната цитотоксичност (Фигури 1, H и I). Тези резултати показват, че цитотоксичните ефекти на DC661 са независими от експресията на BNIP3. След това проучихме ефектите от изчерпването на клетките на каноничните гени за автофагия, необходими за производството на автофагозома върху ефикасността на DC661 чрез унищожаване на unc-51 като киназа 1 (ULK1) и свързан с автофагия ген 7 (ATG7). Ефективният нокдаун на ULK1 или ATG7 (допълнителна фигура 2, A и B) инхибира автофагичния поток (допълнителна фигура 2C), но не повлиява DC661-индуцираната цитотоксичност (фигура 1, J–M). Тези резултати показват, че отсъствието на основния механизъм за автофагия не отменя цитотоксичните ефекти на DC661. Лизозомното инхибиране от DC661 индуцира множество програмирани пътища на клетъчна смърт. Каноничната гледна точка е, че лизозомната клетъчна смърт се дължи на апоптоза (5). Имуноблотингът разкрива, че лечението с DC661 води до активиране на каспаза-3, -7 и -9 и разцепване на PARP-1, потвърждавайки, че DC661 активира апоптоза (Фигура 2А). Инхибиторът на пан-каспаза Z-VAD-FMK предотвратява активирането на каспаза от DC661, но не инхибира натрупването на LC3B и p62, демонстрирайки, че активирането на апоптозата и блокадата на аутофагията са разделени след лизозомно инхибиране (Фигура 2В). Блокирането на апоптозата със ZVAD-FMK не повишава или ограничава цитотоксичността на DC661, което предполага, че апоптозата е ненужна за лизозомна клетъчна смърт (Фигура 2, C и D). Цитотоксичните ефекти на DC661 са сходни в Bax/Bak двойно-KO първични клетки от костен мозък, неспособни да претърпят апоптоза и WT клетки (Фигура 2E). Блокадата на апоптозата също не повлиява DC661-индуцираната цитотоксичност при рак на дебелото черво и ракови клетки на панкреаса (допълнителна фигура 2, D–F). Тъй като открихме, че апоптозата не е необходима за клетъчна смърт, предизвикана от DC661-, ние проучихме дали DC661 индуцира некроптоза, друга форма на програмирана клетъчна смърт, регулирана от взаимодействаща с рецептора протеин киназа (RIPK) и протеин, подобен на домен на смесена линия киназа ( MLKL). Нивата на фосфорилираните и активираните форми на RIPK и MLKL бяха повишени след лечение с DC661 от 0,1–1 μM (Фигура 2F). При 3 μM DC661 имаше отсъствие на фосфорилиран RIPK1, но персистиращ фосфорилиран MLKL, което предполага, че при тази по-висока концентрация могат да бъдат включени допълнителни форми на клетъчна смърт. Предварителното третиране с инхибиторите на RIPK1 некростатин-1 или некростатин-1 или MLKL инхибиторът некросулфонамид предотврати фосфорилирането на RIPK1 след лечение с DC661 (1 μM) в меланомни клетки (Фигура 2G), но не успя да спаси DC{{192 }}индуцирана цитотоксичност в меланомни клетки (Фигура 2H) или рак на дебелото черво или ракови клетки на панкреаса (допълнителна фигура 2G). Тези констатации предполагат, че некроптозата е активирана, но не е необходима за медиирана от DC{195}}клетъчна смърт.
Фигура 1. Инхибирането на лизозомна аутофагия предизвиква значителни промени в протеините на апоптозата и аутофагията. (А)
Лизозомите са едно от основните места за съхранение на желязо. Нарушеният вътреклетъчен метаболизъм на желязото, съчетан с намален редукционен капацитет, може да предизвика неапоптозна клетъчна смърт, известна като фероптоза. Отличителен белег на фероптозата е повишената регулация на простагландин-ендопероксид синтаза 2 (PTGS2), регулатор на катионен транспорт хомолог 1 (CHAC1) и цистеинил-тРНК синтетаза (CARS) (14). Всичките 3 от тези маркери за фероптоза бяха транскрипционно регулирани нагоре чрез лечение с DC661 (Фигура 3А), което предполага, че лизозомното инхибиране индуцира фероптоза. DC661 индуцира промяна на флуоресценцията в C11-BODIPY-третирани A375P клетки, което показва липидна пероксидация, характерна за фероптозата. Това индуцирано от DC661-изместване беше значително обърнато в присъствието на инхибитори на фероптоза феростатин-1 или лип рокстатин-1, приложени в ефективна концентрация (Фигура 3B и допълнителна фигура 3A), което допълнително показва, че DC661 индуцирана фероптоза. Въпреки това, инхибирането на фероптозата не спасява цитотоксичността, свързана с DC661 (Фигура 3, C и D). Съвместното лечение на ракови клетки с хелатор на желязо дефероксамин (DFO) и DC661 не спаси цитотоксичността на DC661 (Фигура 3E). Лечението с ferostatin-1, lip roxstatin-1 или DFO не спасява инхибирането на DC661 на краткотрайната жизнеспособност или дългосрочния клоногенен растеж в ракови клетки на меланома, дебелото черво и панкреаса (допълнителна фигура 3, B –E и допълнителна фигура 4, A–D). Тези данни показват, че фероптозата е активирана, но не е необходима за медиирана от DC{31}}клетъчна смърт. Пироптозата е форма на програмирана клетъчна смърт, свързана с възпалителен отговор, който включва активирането на каспази, които обработват гастрин (GSDM), позволявайки образуване на пори върху плазмената мембрана и последващо освобождаване на свързани с увреждане молекулярни модели, като например висока мобилност групова кутия 1 (HMGB1). Лечението с DC661 в множество меланомни клетъчни линии (A375P, A375, WM35 и WM793) доведе до активиране на инициаторната каспаза-8 и -9 и екзекуторната каспаза-7, типични за пироптоза, и произведени разцепване на GSDME с пълна дължина, подобно по степен на известния индуктор на пироптоза PLX4720 и PD0325901 (допълнителна фигура 5А). DC661 произвежда по-силно извънклетъчно освобождаване на HMGB1 от известния индуктор на пироптоза, BRAF и инхибиране на MEK в 1% FBS (15), отразявайки функционалните последици от активираната пироптоза. След това тествахме дали инхибирането на пироптозата от GSDME KO би подобрило цитотоксичните ефекти на DC661. Лечението с DC661 индуцира натрупване на LC3II и SQSTM1/p62 и активиране на каспаза, но освобождаването на HMGB1 беше почти напълно отменено в GSDME-KO WM35 човешки клетки, което демонстрира, че е постигната функционалната последица от инхибирането на пироптозата (Фигура 3F). Въпреки това, лечението с DC661 произвежда еднаква цитотоксичност в YUMM1.7 WT, празен вектор (EV) и Gsdme KO1 и KO2 клетки както при 10%, така и при 1% FBS условия (Фигура 3G и допълнителна фигура 5B). Един общ резултат от множество форми на клетъчна смърт е освобождаването на LDH. DC661 предизвиква значително увеличение на освобождаването на LDH и това не може да бъде обърнато чрез апоптоза, некроптоза или инхибиране на фероптоза (допълнителна фигура 5C). Тези резултати показват, че DC661 индуцира множество начини на клетъчна смърт, включително апоптоза и пироптоза, както и некроптоза и фероптоза, но нито един от тези начини на клетъчна смърт не е необходим за индуцирана от DC661-клетъчна смърт. Инхибирането на катепсин или калциевото хелиране не предотвратява клетъчната смърт от пермеабилизация на лизозомната мембрана. След като демонстрирахме, че активирането на каспаза (което е необходимо за апоптоза и пироптоза) не е необходимо за индуцирана от DC661-клетъчна смърт, ние предположихме, че освобождаването на катепсин от лизозомите може да причини зависима от каспаза клетъчна смърт. Химическо (DC661) или генетично (PPT1 siRNA [siPPT1]) инхибиране на PPT1 предизвиква пермеабилизация на лизозомната мембрана (LMP), докато HDSF, по-малко мощен необратим инхибитор на PPT1, който се изчерпва бързо в клетъчната култура, не може да индуцира LMP, както е измерено от галектин-3–положителна puncta (Фигура 4A). LMP води до освобождаване на катепсини и друго лизозомно съдържание в цитоплазмата и се смята, че е ключова проксимална характеристика на базираната на лизозома клетъчна смърт. LMP, индуциран от DC661, се свързва със значително повишаване на цитоплазмената активност на катепсин-L, която е значително блокирана с инхибитор на цистеин протеаза Е64 (Фигура 4В). Предишни доклади предполагат, че освобождаването на катепсин от фрактурирани лизозоми насърчава активирането на каспаза, което води до апоптотична клетъчна смърт (16-18). Пълното инхибиране на катепсин не предотвратява разцепването на каспаза (Фигура 4C) и не спасява DC661-индуцираната цитотоксичност при краткосрочни и дългосрочни тестове за жизнеспособност при меланом (Фигура 4, D и E), рак на дебелото черво и панкреаса ракови клетки (допълнителна фигура 6, A–C). Тези резултати противоречат на каноничния възглед за лизозомната клетъчна смърт, задвижвана от медиирана от катепсин клетъчна смърт. Освен освобождаването на катепсин от пропускливи лизозоми, освобождаването на калций от лизозомите е замесено в клетъчна дисфункция, когато PPT1 е нарушен (19). Лечението с DC661 доведе до екстензивно освобождаване на калций, което беше отменено чрез предварителна обработка на клетъчен постоянен калциев (Ca2+) хелатор, BAPTA-AM. (Фигура 4F). Трябва да се отбележи, че BAPTA-AM не предотвратява DC661-индуцирана LMP (Фигура 4G) или разцепване на каспаза (допълнителна фигура 6, D и E) и, най-важното, не спасява DC661-индуцирана цитотоксичност ( Фигура 4H). Тези констатации са наблюдавани и при RKO и MIA PaCa-2 клетъчни линии, при които не са наблюдавани значителни разлики в стойностите на IC50 с BAPTA-AM и DC661 (допълнителна фигура 6F), което предполага, че свързаната с LMP клетъчна смърт е не зависи от калций или катепсини.
Фигура 2. DC661-индуцирана апоптоза и некроптоза. (А)
Фигура 3. DC661-индуцирана фероптоза и пироптоза. (А)
LLP управлява LMP. След като установи, че инхибиторите на основните пътища на клетъчна смърт (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза), катепсини (PepA и E64) и йонни хелатори (BAPTA-AM [Ca2+] и DFO [Fe{{3} }]) не предотврати клетъчна смърт от DC661 и откривайки доказателства за липидна пероксидация от C-11-BODIPY, извършихме глобален анализ на липидом на 2 и 4 часа след лечението с DC661. DC661 индуцира ранни и устойчиви 3- до 10-кратни увеличения във всеки клас лизофосфолипид (Фигура 5А). Обратно, минимални или никакви промени не са наблюдавани във фосфолипидни класове, включително фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол и фосфатидна киселина (допълнителна фигура 7А). Лизофосфолипидни видове могат да бъдат генерирани от ROS, който окислява веригата на наситени мастни киселини, която след това се отцепва от фосфолипази (20). За да определим дали антиоксидантите могат да предотвратят ROS-медиирано увреждане на липидите, ние изследвахме DC661-индуцирана цитотоксичност в присъствието на пан-ROS акцептора N-ацетилцистеин (NAC) (21, 22) и предполагаеми инхибитори на липидна пероксидация Trolox (23 ) и витамин С (аскорбинова киселина) (24, 25). За разлика от всички други агенти, тествани досега, съвместното лечение с NAC спаси цитотоксичността, свързана с DC661-в множество клетъчни линии (Фигура 5B и допълнителна фигура 7B). Дългосрочните CFU анализи показват, че NAC, за разлика от всички тествани тук инхибитори на клетъчна смърт, йонни хелатори и инхибитори на катепсин, предотвратява цитотоксичните ефекти на DC661 в A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 и MC38 клетки ( Фигура 5C и допълнителна фигура 7C). Интересното е, че Trolox и витамин C не спасяват цитотоксичността на DC661 при човешки меланом, колоректален рак, ракови клетки на панкреаса и миши меланом и колоректален ракови клетки (Фигура 5D и допълнителна фигура 7, D–H). Това несъответствие ни подтикна да тестваме дали NAC, Trolox и витамин C повлияват LMP. Нашите резултати показват, че NAC е единственият антиоксидант, който значително намалява LMP, индуцирана от DC661- (Фигура 5E). Ние предположихме, че LLP задвижва производството на LMP от DC661, което може да бъде върнато от NAC, но не и от Trolox и витамин С. За да проучим процеса на LLP, използвахме флуоресцентната сонда FOAM-LPO (26), която специфично се локализира в лизозомата и произвежда спектрално изместване от 586 до 512 nm (червено към зелено), когато е изложено на липидни пероксиди. Открихме, че DC661 индуцира LLP в сравнение с контролата (Фигура 5F). NAC намалява липидната пероксидация в лизозомите на меланомните клетки, третирани с DC661-, докато Trolox и витамин C не успяват да намалят LLP (Фигура 5F). NAC, Trolox и витамин С сами по себе си нямат значителен ефект върху липидната пероксидация. Нокдаун на PPT1 (допълнителна фигура 8A) или лечение с високи концентрации на HCQ (допълнителна фигура 8B) също индуцира LMP, което може да бъде обърнато от NAC, докато химическото инхибиране на ULK1 не индуцира LMP (допълнителна фигура 8C). Важно е, че нокдаунът на siPPT1 също включва LLP, който може да бъде обърнат с NAC (допълнителна фигура 8D). Тези резултати показват, че инхибирането на PPT1 индуцира LLP, което може да бъде спасено от NAC и вероятно е причината за LMP, индуцирано от инхибиране на PPT1-. Освен това, тези открития предполагат, че LLP е критичен за смъртта на лизозомните клетки.
Китайска билка растение цистанче-Противотуморно
Импортирането на цистеин в лизозомите от MFSD12 намалява лизозомната клетъчна смърт. От 3-те инхибитора на липидната пероксидация, само NAC предотвратява LLP. Неотдавнашен доклад показа, че основният улесняващ суперсемейен домейн, съдържащ 12 (MFSD12), е основен компонент на вносителя на цистеин за лизозоми и меланозоми (27). Разсъждавахме, че NAC или неговият метаболит цистеин се транспортира в лизозомата чрез MFSD12, където цистеинът се окислява до своя дисулфид, цистеин. За да тестваме тази хипотеза, сравнихме способността на NAC да спаси цитотоксичността на DC661 в siNT и siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP клетки. Нашите резултати показаха, че NAC спаси DC661-индуцирана LMP в siNT клетки, но не спаси LMP в siMFSD12 клетки (Фигура 6А). NAC намалява LLP на DC661-третирани siNT-A375P клетки, но не и siMFSD12 клетки. Клетките siMFSD12, третирани с DMSO или NAC, имат повишен базален LLP (Фигура 6B) в сравнение със siNT клетки. Докато NAC спасява DC661 цитотоксичността в siNT клетки, способността на NAC да спасява DC661 цитотоксичността е напълно отменена в siMSFD12 клетки (Фигура 6C). Това показа, че нокдаунът на MFSD12 блокира цитопротективните ефекти на NAC срещу DC661. NAC се деацетилира от ацилаза в цитозола (28). За да определим дали лечението с NAC води до натрупване на цистеин или цистин в лизозомите, ние използвахме техниката на лизозомна имунопреципитация (Lyso-IP) (29) за пречистване на лизозоми от DMSO и третирани с NAC A375P клетки (Фигура 6D и допълнителна фигура 9A) и извършихме насочена метаболомика за количествено определяне на NAC и свързаните с него метаболити. Както се очакваше, NAC беше открит в третиран с NAC лизат на цели клетки и свързани несвързани фракции. Нивата на L-цистеин са значително повишени в рамките на третираните с NAC лизозоми. L-цистинът се открива само в третираните с NAC лизозоми. Поразително е, че не открихме значително увеличение на глутатиона (намален) в групите, третирани с NAC (Фигура 6E); това беше изненадващо, тъй като обикновено се смята, че лечението с NAC предизвиква повишено производство на глутатион, коригирайки редокс баланса. Тези резултати предполагат, че цистеинът, внесен в лизозомите чрез вносителя на MFSD12, е критичен за спасяването на LLP, LMP и лизозомната клетъчна смърт. LLP е имуногенен. Някои форми на регулирана клетъчна смърт, индуцирана от DC661 (пироптоза, некроптоза, фероптоза), са идентифицирани като имуногенни. По-рано е описана имуногенна клетъчна смърт за химиотерапевтични лекарства въз основа на характерни характеристики, които включват показване на свързани с увреждане молекулярни модели, включително експресия на CALR на клетъчната повърхност и освобождаване на HMGB1 протеин и аденозин трифосфат (ATP) (30). CALR действа като сигнал "яж ме", когато е изложен на клетъчни повърхности по време на клетъчен стрес. Извънклетъчното освобождаване на HMGB1 и ATP действа като сигнал „намери ме“, разпознат от фагоцитните клетки. Ние сравнихме два модела: B16F10 клетки, които в сингенни туморни модели са почти напълно лишени от тумор-инфилтриращи лимфоцити, и MC38 клетки, които в сингенни туморни модели имат тумор-инфилтриращи лимфоцити. Първо, ние демонстрирахме, че лечението с DC661 или siPpt1 значително индуцира повърхностна CALR експресия, която може да бъде напълно отменена с NAC съвместно лечение в MC38 клетки (Фигури 7, A и B). Подобни находки са наблюдавани в клетки B16F10 (Фигура 7C). Инхибиторите на основните пътища на клетъчна смърт (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) не успяха да предотвратят повърхностната експресия на CALR (Фигура 7D). За да се определи дали имуногенната клетъчна смърт, индуцирана от DC661, се дължи на повишена регулация на МНС клас I, клетките B16F10 и MC38 бяха третирани с DC661 (3 μM) или DMSO в продължение на 24 часа. Ние открихме, че лечението с DC661 не повишава експресията на MHC клас I и имунопротеазомна регулация (Фигура 7E и допълнителна фигура 9, B и C).
Фигура 4. Инхибирането на катепсин или калциевото хелиране не предотвратява клетъчна смърт, предизвикана от DC661-. (А)
За да разберем ефектите от инхибирането на аутофагията върху Т клетъчното праймиране, ние проведохме in vitro първичен експеримент и съвместно култивиране, използвайки C57BL6/J спленоцити, както е описано по-горе (31). За праймиране, ние изложихме спленоцитите на DC661- или третирани с DMSO B16F10 или MC38 клетки. След това тези праймирани спленоцити се култивират с живи B16F10 или MC38 клетки и се измерва цитотоксичността (Фигура 8А). Спленоцити, приготвени с DC661-третирани B16F10 клетки, произвеждат значително увеличение на IFN- в сравнение със спленоцити, изложени на DMSO-третирани B16F10 клетки. Медиираното от праймирани Т клетки убиване на пролифериращи B16F10 клетки беше значително повишено в праймирани с DC661- спленоцити в сравнение с праймирани с DMSO спленоцити (Фигура 8, B и C). MC38 клетки, третирани с DC661, произвеждат дори повече IFN- и първична Т-клетъчна цитотоксичност в сравнение с B16F10 клетки (Фигура 8, D и E). Съвместното лечение с NAC с DC661 е в състояние напълно да отмени освобождаването на IFN от спленоцитите и да намали първичната Т-клетъчна цитотоксичност (Фигура 8, F и G). Нокдаунът на калретикулин от siCalr в MC38 клетки (допълнителна фигура 9D) отмени началната ефикасност на лечението с DC661 и значително намали първичната цитотоксичност на Т-клетките (Фигура 8, H и I). Взети заедно, тези данни подкрепят механистичната роля на свързаното с LLP регулиране на CALR в насърчаването на антитуморен клетъчен Т-клетъчен имунитет. След това разширихме тези in vitro констатации до in vivo проучване за антитуморна ваксинация при модели на имунокомпетентни и имунодефицитни мишки. За този анализ, in vitro замразени-размразени или третирани с DC661- B16F10 или MC38 клетки се инжектират подкожно на левия хълбок, за да защитят имунокомпетентни C57BL/6 или NOD/SCID мишки срещу повторно провокиране с инжектирани живи туморни клетки от същия вид 7 дни по-късно в десния фланг (Фигура 9A). Третираните с DC661- B16F10 клетки не успяха да предотвратят отхвърлянето на тумора въпреки in vitro анализите, което предполага, че DC661 индуцира имуногенна клетъчна смърт (Фигура 9B и допълнителна фигура 9E). За разлика от това, инокулирането на един хълбок с DC661-третирани MC38 клетки насърчава пълното отхвърляне на живи MC38 клетки, имплантирани на противоположния хълбок (Фигура 9C и допълнителна фигура 9F). За да определим дали адаптивният имунитет е критичен за ефекта на ваксината, който DC661 изглежда има с MC38 тумори, ние повторихме експеримента с NOD/SCID мишки. Учудващо е, че открихме, че третирани с DC661- MC38 клетки не индуцират отхвърляне на повторно провокирани тумори в имунодефицитни NOD/SCID мишки (Фигура 9D и допълнителна фигура 9G), което показва, че е необходим адаптивен имунитет за наблюдавания ефект на ваксината. За да тестваме устойчивостта на това откритие, ние избрахме друга добре известна имуногенна миша ракова клетъчна линия, CT26, и проведохме експеримента за ваксиниране, както по-горе. Както се очакваше, имплантирането на DC661-третирани CT26 клетки в единия хълбок на мишката произведе ваксиноподобен ефект и предотврати израстването на живи CT26 клетки, имплантирани на другия хълбок (Фигура 9E и допълнителна фигура 9H). Нашите констатации предполагат, че DC661-индуцираната LLP е критична за LMP-медиирана имуногенна клетъчна смърт, която се обръща от вноса на цистеин в лизозомата от лизозомния транспортер MFSD12 (Фигура 9F).
Дискусия
Лизозомното инхибиране изглежда обещаващ терапевтичен подход в предклиничните проучвания, а клиничните изпитвания на HCQ са дали окуражаващи, но смесени резултати (1, 32). PPT1 е молекулярната мишена на HCQ и по-мощни инхибитори на PPT1, като DC661 (2) и GNS561 (3), индуцират LMP-медиирана клетъчна смърт in vitro. Точният механизъм на смъртта на лизозомните клетки и неговата роля в имуногенността на тумора не е напълно изяснен. Антитуморният имунитет се засилва, когато инхибирането на аутофагията се комбинира с имунотерапия (9, 10, 31). Предложените механизми за клетъчно присъща имуногенност след инхибиране на аутофагията включват MHC клас I и имунопротеазомна регулация, които и двете поддържат подобрена обработка и представяне на антиген. В допълнение, загубата на протеини на аутофагия или инхибирането на аутофагия от хлорохин усилва CD8+ Т клетъчния отговор чрез повишаване на повърхностните нива на МНС клас I в дендритни клетки (33). По-рано показахме, че системното инхибиране на PPT1 може да реполяризира макрофагите от M2 към M1 фенотип. PPT1 инхибиторите могат да повишат нивата на STING, което води до освобождаване на IFN и увеличаване на Т-клетъчно медиираното убиване при модели на меланом (31). Тук демонстрирахме, че самата LLP произвежда присъща на туморни клетки имуногенна форма на клетъчна смърт. Ние открихме, че лизозомното инхибиране предизвиква много малко протеинови промени в раковите клетки, а най-значително повишените протеини включват автофагични товарни рецептори и регулатори на апоптоза. Нашият подход, насочен към някои от тези гени във всички функции, показа, че индуцираните от лекарства протеини вероятно не са основните регулатори на клетъчната смърт. Генетичното инхибиране на ULK1 или ATG7 също не спаси цитотоксичността на DC661. Ние демонстрирахме, че лизозомното инхибиране активира множество форми на програмирана клетъчна смърт, включително апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза, но всяка от тях е неприложима за индуцирана от лекарството цитотоксичност. Трябва да се отбележи, че програмираните механизми на клетъчна смърт могат да се припокриват и съвместното насочване на множество механизми на клетъчна смърт може да осигури цитозащита срещу клетъчна смърт след пермеабилизация на лизозомната мембрана. Нашата работа изключи катепсин- и калций-зависими механизми за лизозомна клетъчна смърт и подчерта важността на LLP като критичен фактор за клетъчната смърт. Открихме доказателства за LLP, които са обратими от антиоксидант, който се транспортира в лизозомата, NAC и е критичен за пермеабилизацията на лизозомната мембрана и цитотоксичността. NAC е единственият агент, способен да смекчи или обърне DC661-индуцираната клетъчна смърт и този капацитет зависи от присъствието на лизозомния цистеинов транспортер MFSD12. Липсата на лизозомно проникване вероятно е причината други предполагаеми инхибитори на липидна пероксидация, Trolox и витамин C, да не са в състояние да предотвратят цитотоксичността на DC661. NAC се превръща в цистеин, който се внася в лизозомите и се окислява до своята дисулфидна форма, цистин. Цистинът се изнася към цитозола чрез друг лизозомален транспортер, цистиноза, където се редуцира до цистеин, който ремобилизира вътрешните източници на хранителни вещества, реактивира мишената на рапамицин комплекс 1 и насърчава автофагията (34). Това окислително-редукционно циклизиране на цистеин към цистин (лизозоми) и обратно към цистеин (цитозол) може да бъде възможен спасителен механизъм на NAC срещу цитотоксичност на DC661 или по-общо лизозомно увреждане в контекст на други заболявания, където NAC е доказано, че е полезен терапевтично (35) . NAC не само обърна DC661-индуцираните LLP и LMP, но и повърхностната експресия на имуногенния маркер за клетъчна смърт калретикулин. Експресията на CALR протеин на клетъчната повърхност беше необходима за повишената Т-клетъчно-медиирана цитотоксичност, индуцирана от DC661-праймирани спленоцити, демонстрирайки, че лизозомното инхибиране произвежда специфична форма на клетъчно присъща имуногенност.
Докато предишни проучвания показват, че лизозомното инхибиране може да засили антитуморната активност на инхибирането на имунната контролна точка при установени хълбочни тумори (9, 31), нашето изследване е първото, доколкото ни е известно, което демонстрира ваксиноподобен ефект за MC38 тумори, но не и B16 тумори в туморни клетки, предварително третирани с DC661 преди имплантиране. Това демонстрира, че лизозомната клетъчна смърт може да индуцира присъща на клетката имуногенност, но тези промени сами по себе си не са достатъчни, за да обърнат "имунно студена" туморна микросреда в "имунно гореща" туморна микросреда. Нашите предишни проучвания в модели на туморна микросреда B16 на "имунен студ" и BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 генетично модифицирани модели на мишки (31) показаха, че системното лизозомно инхибиране предизвиква ефекти върху свързаните с тумора макрофаги и супресорни клетки, получени от миелоидни клетки, които са достатъчни за подобряване на ефикасността на имунотерапията. Може да се окаже, че присъщата на клетката имуногенност също играе роля в тези имунни студени тумори, които стават по-чувствителни към ICD след лизозомно инхибиране. Подобният на ваксината ефект на лизозомно инхибиране, наблюдаван в контролирана лабораторна среда, може или не може да се пренесе в клиниката, но може да обясни защо някои пациенти, лекувани с дабрафениб, траметиниб и HCQ при лекуван преди това BRAF мутант меланом, са имали толкова дълбоко и трайно отговор на този режим (32). Необходимо е допълнително проучване, за да се разбере как инхибирането на PPT1 произвежда лизозомна ROS и липидна пероксидация. PPT1-зависимата регулация на V-ATPase и лизозомното подкиселяване не е достатъчно обяснение, тъй като бафиломицинът инхибира лизозомното подкисляване, но не произвежда LMP (данните не са показани). Последиците от тези констатации предполагат, че лизозомните инхибитори, които повишават присъщата на туморните клетки имуногенност, могат да бъдат рационално комбинирани с терапии, които подобряват активирането на Т-клетките или инфилтрацията в туморната микросреда, което потенциално води до синергични ефекти.
Фигура 5. N-ацетил цистеин предотвратява клетъчна смърт, предизвикана от DC661-. (А)
Методи
Клетъчна култура. Човешки A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) и миши B16F10 (CRL-6475) клетъчни линии бяха закупени от ATCC. Човешки линии A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 и YUMM1.7 (WT, Gsdme EV и Gsdme KO1 и KO2) бяха получени вътрешно. Миши MC38 и CT26 клетки бяха предоставени от Andy Minn, Университет на Пенсилвания. FL5.12 и IL-3-зависими Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) първични клетки от костен мозък бяха получени от Kathryn E. Wellen, Университет на Пенсилвания. Човешката клетъчна линия Panc-1 (CRL-1469, ATCC) е предоставена от Ben Z. Stanger, Университет на Пенсилвания. Клетъчната линия YUMMER 1.7 на мишка е получена от Xiaowei (George) Xu, Университет на Пенсилвания. Всички клетъчни линии бяха тествани за Mycoplasma два пъти годишно от основните съоръжения на Университета на Пенсилвания и удостоверени с помощта на кратко тандемно повторение на пръстови отпечатъци от ядрото на Wistar Institute Genomics. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 и Bax/Bak DKO клетъчни линии бяха култивирани в RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 и MC38 клетъчни линии бяха култивирани в DMEM (Invitrogen, 11995); и YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV и Gsdme KO1 и KO2) клетки (15) бяха култивирани в DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Културалната среда беше допълнена с 10% фетален говежди серум (12306C, MilliporeSigma) и 1 × антибиотичен антимикотичен разтвор (Gibco, 15140-122). Клетъчните линии FL5.12 и Bax/Bak DKO се поддържат в пълна RPMI среда, допълнена с 50 μM -меркаптоетанол (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) и 0,35 ng/mL и 3,5 ng /mL IL-3, съответно. Клетъчните линии YUMMER1.7 и YUMM1.7 (WT, Gsdme EV и Gsdme KO) се поддържат в пълна среда, допълнена с 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Клетките WM35 и WM793 се култивират в MCDB среда 153 (MilliporeSigma, M7403), съдържаща 10% FBS в 1 × Leibovitz L-15 среда (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v натриев бикарбонат ( Corning, 25-035-CI), 1 × антибиотичен антимикотичен разтвор (Gibco, 15140-122) и 5 ug/mL инсулин (MilliporeSigma, I0516). Клетките се отглеждат при 37 градуса в присъствието на 5% CO2. Химикали и реактиви. Закупените химикали включват HCQ сулфат (Spectrum Chemicals, 747-36-4) и DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) се използва за оцветяване на клетките за калций съгласно инструкциите на производителя. Списък с антитела и инхибитори е даден в Допълнителна таблица 1 и Допълнителна таблица 2.
Фигура 6. NAC обръща LLP по начин, зависим от MFSD12-. (A–C)
Екстракция и смилане на протеин за течна хроматография – тандемен масспектрометричен анализ за протеомика. {{0}}.7 × 106 A375P меланомни клетки бяха култивирани в 60 mm чаши за култура. Клетките бяха третирани с DMSO (контрола), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) или HCQ (3{{70}} μM) за 24 часа при приблизително 5{{ 112}}% сливане. Замразените клетъчни пелети се лизират с 50 mM Tris рН 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL пепстатин, и 1 ug/mL леупептин. Избистрените лизати (10 ug всеки) се подлагат на електрофореза 0,5 cm в бис-трис гел, последвано от фиксиране и оцветяване с колоидно кумаси. Всяка 0,5 cm гел лента беше изрязана, обезцветена, редуцирана с трис (2-карбоксиетил) фосфин, алкилирана с йодоацетамид и усвоена с трипсин, както е описано по-горе (36). Усвоените продукти (1 ug) бяха анализирани чрез течна хроматография-тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS) на Q-Exactive Plus масспектрометър (Thermo Fisher Scientific) в съответствие с nanoAQUITY UPLC (Waters). Аналитичното разделяне се извършва на 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 колона (Waters, 186003546), като се използва 245-минутен градиент с 0,1% мравчена киселина във вода (подвижна фаза А) и ацетонитрил (подвижна фаза В), както следва : 5%–30% B за 225 минути, 30%–80% B за 5 минути, 15-минутно задържане при 80% B и връщане към първоначалните условия. Пълните MS спектри са получени при разделителна способност 70, 000, с обхват на сканиране от 400–2, 000 m/z, цел за автоматичен контрол на усилването от 3 × 106 йони и максимално време на инжектиране от 50 милисекунди. Зависещите от данни MS2 спектри са получени за първите 20 най-разпространени йона при разделителна способност 17 500, с ширина на изолация от 1, 5 m/z, автоматична цел за контрол на усилването от 5 × 104 йони и максимално време на инжектиране от 50 милисекунди. Пептидното съвпадение беше зададено като предпочитано и неопределените и еднократно заредени йони бяха отхвърлени (37). Суровите MS данни бяха анализирани с помощта на MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) с база данни Uniprot за човешка последователност (достъп на 10 октомври 2019 г.) и обща база данни за замърсители, включително трипсин, кератини, говежди протеини, и микоплазма (38). При търсенето са използвани специфичност на триптичен пептид с максимум 2 пропуснати разцепвания, фиксирана модификация на цистеин (карбамидометилиране) и променливо окисление на метионин или N-терминално ацетилиране (39). За пептиди и протеини е използвана граница от 1% FDR. Съвпадението между изпълненията беше активирано; протеините бяха количествено определени с помощта на количествено определяне без етикет (40). Статистическият анализ беше извършен с помощта на Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Протеините трябваше да бъдат идентифицирани с най-малко 3 уникални пептида и да имат 3 валидни стойности (ненулево количествено определяне) в рамките на група проби, а замърсителите и обратните протеини бяха филтрирани от набора от данни. Липсващите стойности бяха условни от нормално разпределение. Бяха извършени сравнения по двойки между условията на ниво протеин с помощта на 2-опашен t-тест на Student с базиран на пермутация FDR с s0=0.1 и 250 рандомизации. Значими промени бяха дефинирани като FDR от по-малко от 5% и абсолютна промяна на пъти по-голяма от 1,5 или 2,0, както е посочено. Лизо-IP. Клетките A375P бяха инфектирани с pLJC5-Tmem192-3xHA лентивирус и селектирани с помощта на 1 mg/mL пуромицин (MilliporeSigma, P4512). Приблизително 3 × 106 HA-маркирани A375P клетки бяха третирани или с 10 mM NAC, или с воден носител контрол за 24 часа в условията на култивиране, описани по-рано. След третиране клетките се промиват в PBS, събират се в 0.5 mL студен KPBS и внимателно се хомогенизират с помощта на 20 удара в 2 mL хомогенизатор Dounce. Около 2,5% от хомогената беше запазен за анализ на лизат на цяла клетка, а остатъкът беше центрофугиран при 3,000}g за 2 минути при 4 градуса за отстраняване на остатъците от клетъчната мембрана. След това супернатантът на хомогената се прехвърля в чиста епруветка от 1,5 mL и се инкубира с 50 μL зърна анти-НА (Pierce, 88836) или зърна анти-DDK/Flag (OriGene, TA150042) в продължение на 15 минути при 4 градуса. След това пробите се утаяват чрез поставяне на епруветки върху DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) и се разклащат внимателно за 2 минути при стайна температура. Супернатантата беше запазена за анализ на несвързани фракции. IP се промива 3 пъти с KPBS, съдържащ 8 mM CaCl2. Lyso-IP се екстрахира в 80% МеОН за метаболомичен анализ. Липидна екстракция и анализ с помощта на LC-MS/MS за глобален липидом. Меланомни A375P клетки се посяват в 60 mm панички при 0.7 × 106 клетки на чиния. Когато клетките бяха при приблизително 50% сливане, те бяха третирани с DMSO (контрола), DC661 (3 μM) или HCQ (30 μM) в продължение на 24 часа. Клетките се промиват 2 пъти с HBSS, изстъргват се в леденостуден метанол и се прехвърлят в стъклени епруветки за липидна екстракция с хлороформ/метанол/0.88% NaCl (2:1:1), съдържащи вътрешен липиден стандарт EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Пробите се разбъркват на вортекс и след това се обработват с ултразвук на водна баня за 5 минути върху лед. След центрофугиране при 500 g за 15 минути при 40 градуса, долната фаза се прехвърля в друга стъклена епруветка. Горната фаза се екстрахира отново с помощта на синтетична долна фаза. След обработка с ултразвук и центрофугиране, долната фаза се комбинира с първата колекция от долна фаза. Пробите се сушат под азот, ресуспендират се в 10% хлороформ/90% метанол и се прехвърлят в стъклени LTQ флакони. Липидни проби бяха анализирани на Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X масспектрометър и Vanquish Horizon UHPLC система. Аналитичното разделяне използва колона Accucore C30 (2.1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) с 50:50 ацетонитрил/вода и 88:10:2 изопропанол/ацетонитрил/вода, всяка съдържаща 5 mM амониев формиат и 0.1% мравчена киселина. LC-MS/MS данни бяха получени отделно в положителни и отрицателни полярности със следните параметри на инструмента: MS1 сканиране 120, 000 резолюция; зависещ от данни MS2 за първите 20 най-разпространени йона при 15,000 резолюция; 0,4 m/z ширина на изолация; и стъпаловидна нормализирана енергия на сблъсък от 20:30:40 (43).
Фигура 7. N-ацетил цистеинът предотвратява DC661-индуцирана повърхностна експресия на калретикулин. (A–D)
Липидите бяха идентифицирани и количествено определени с помощта на LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Идентифицираните липидни видове бяха филтрирани чрез очаквани адукти и степен на идентификация въз основа на класа. Пиковите площи бяха нормализирани към стандартите на EquiSPLASH за поддържаните класове и допълнително нормализирани въз основа на общата площ за всяка проба, за да се коригират вариациите в броя на клетките. Статистическият анализ беше извършен върху лог-трансформирани данни с помощта на Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Екстракция на метаболит и анализ с помощта на LC-MS/MS за метабалон. Полярните метаболити бяха извлечени от цели клетки, Lyso-IP несвързани фракции и Lyso-IP свързани проби с помощта на 80% метанол и бяха съхранявани при –8{{30}} градуса преди течна хроматография –масспектрометричен (LC-MS) анализ. Екстрактите бяха анализирани чрез LC-MS с помощта на Thermo Scientific Q-Exactive HF-X масспектрометър с HESI II сонда в съответствие с Thermo Vanquish Horizon UHPLC система. LC разделянето се извършва с помощта на колона ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, размер на частиците 5 μm, EMD Millipore) с предпазна колона ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore), поддържана при 45 градуса със скорост на потока от 0.2 mL/min. Хроматографията се извършва при киселинни условия, за да се намали реактивността на тиоловите групи. Подвижна фаза А е вода, а В е ацетонитрил, като и двете съдържат 0,1% мравчена киселина. Градиентът на LC е 85% В за 2 минути, 85% В до 20% В за 15 минути, 20% В до 85% В за 0,1 минути и 85% В за 8,9 минути. Автоматичният пробоотборник се поддържа при 4 градуса и се инжектират 4 μL от всяка проба за анализ. Бяха използвани следните MS параметри: скорост на потока на обвивния газ, 40 AU; дебит на спомагателния газ, 10 AU; скорост на потока газ за почистване, 2 AU; температура на спомагателния газов нагревател, 350 градуса; напрежение на пръскане, 3,75 kV за положителен режим и 3,5 kV за отрицателен режим; капилярна температура, 375 градуса; и RF ниво на фунията, 40%. Всички проби бяха анализирани чрез пълна MS с превключване на полярността. Бяха получени пълни MS сканирания от 65 до 975 m/z при разделителна способност 120 000 с автоматична цел за контрол на усилването от 1 × 106 йони и максимално време на инжектиране от 100 милисекунди. Суровите данни бяха анализирани с помощта на TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Целевите метаболити бяха идентифицирани чрез точна маса и време на задържане в тяхната предпочитана полярност въз основа на аналитични стандарти. Откриването на пикове използва алгоритъма ICIS с изглаждане от 1. Относителното количествено определяне беше извършено с помощта на интегрирана пикова площ и тези стойности бяха коригирани до общото количество на проба (дефинирано като обща пикова площ). Редактиране на PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-нецелеви и KO клетки бяха приготвени, както е описано по-горе (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) е подарък от Feng Zhang (Addgene плазмид, 48139). Водещи РНК олигонуклеотиди (IDT) бяха загряти, фосфорилирани и след това лигирани в BbsI усвоен и дефосфорилиран pX459 плазмид, следвайки протоколите на Zhang lab, достъпни чрез Addgene. Лигираните плазмиди се трансформират в Stbl3 клетки (Invitrogen). Секвенирането на плазмидни препарати потвърди наличието на желаните водещи РНК последователности. A375P клетки бяха трансфектирани с помощта на Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), последвано от селекция на пуромицин. Анализите на Surveyor потвърдиха редактирането на гена PPT1 от CRISPR/Cas9, а нокдаунът на PPT1 беше потвърден чрез Western blotting с PPT1 антитяло (Origene). Последователностите за водещи РНК олиго са както следва: нецелева направляваща РНК напред (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), нецелева направляваща РНК обратна (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), човешка PPT1 водеща РНК 1 напред (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), човешка PPT1 водеща РНК 1 обратно (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), човешка PPT1 водеща РНК 3 напред (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) и човешка PPT1 направляваща РНК 3 обратно (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Клоновете, отгледани от единични клетки, използвани в тази статия, включват следното: клон C8 е човешки водач 1 и клон B5 е човешки водач 3. Имуноблотинг. Един милион клетки бяха поставени в 10 см блюдо и лечението беше дадено на следващия ден; клетките бяха събрани чрез изстъргване. Цели клетъчни лизати се приготвят с помощта на SDS лизисен буфер. Концентрацията на протеин се измерва с помощта на Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug протеин се използва за SDS-PAGE и се прехвърля върху PVDF мембрана (Bio-Rad, 1620177). Мембраната се блокира с помощта на 5% BSA или 5% обезмаслено мляко, според оптимизирани условия, и се инкубира с първично антитяло за една нощ при 4 градуса. PVDF мембраните се промиват с 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) и се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура със специфично за вида HRP-конюгирано вторично антитяло. Мембраните впоследствие се промиват и проявяват с помощта на Pierce ECL Western Blotting субстрат (Thermo Fisher Scientific, 32106) и авторадиографски филми (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). За изследвания на пироптоза, протеиновите лизати се разделят чрез SDS-PAGE и се прехвърлят към PVDF мембрани. След блокиране в 5% BSA, PVDF мембраните се инкубират с посочените първични антитела за една нощ при 4 градуса, промиват се в PBS/Tween и се инкубират с пероксидаза-свързани вторични антитела. Имунореактивността беше открита с помощта на HRP-конюгирани вторични антитела (CalBioTech), хемилуминесцентен субстрат (Thermo Fisher Scientific) и система за изображения ChemicDoc MP (Bio-Rad). За експерименти, включващи супернатанта, клетките се култивират в среда без FBS, за да се избегне изкривяване на SDS-PAGE. Клетъчните супернатанти бяха събрани и центрофугирани за 10 минути при 500 g при 4 градуса за отстраняване на клетъчните остатъци. Получените супернатанти се концентрират 10 пъти с помощта на Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) чрез центрофугиране в продължение на 30 минути при 4,500 g при 4 градуса. Концентратите се смесват с буфер за проби и се анализират чрез Western blotting, както е описано по-горе. Оцветяването с протеинов гел се извършва с помощта на оцветяване с червено Ponceau. LMP и анализ на активността на катепсин L. Човешкият pEGFP-hGal3 плазмид е подарък от Тамоцу Йошимори (Addgene плазмид, 73080) и е използван за създаване на линията A375P-Galectin-3. pEGFP-C1 контролен плазмиден векторен скелет беше закупен (novo prolabs, V012024). Плазмидите се трансфектират (1 ug/mL) в A375P клетки, като се използва Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) съгласно протокола на производителя; трансфектираните клетки бяха стабилно селектирани с помощта на G418 (Gibco, 10131035). За LMP бяха преброени общо 25 A375P-галектин-3 puncta-положителни клетки в множество полета на изображението. Процентът на puncta-позитивните клетки се изчислява във всяко поле поотделно и се изчислява среден процент за всяка група. Използван е комплектът за анализ Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) съгласно протокола на производителя. Клетките се изобразяват под обърнат микроскоп Zeiss Axio Observer 7. Суровият интегриран интензитет на Magic Red беше изчислен с помощта на Fiji - ImageJ софтуер (NIH). МТТ (3-[4, 5-диметилтиазол-2-ил]-2, 5 дифенил тетразолиев бромид) анализ на клетъчната жизнеспособност. 2000 клетки се посяват в три екземпляра във всяка ямка на 96-плака с ямки и 3-дневни МТТ анализи се извършват с помощта на комплекта Cell viability Kit (Roche, 11465007001) съгласно протокола на производителя. Предварително третиране с инхибитор се прилага за 1 час, последвано от съвместно третиране на клетките с инхибитори със или без DC661. Методът на нелинейна регресия (напасване на кривата) беше използван за изчисляване на IC50.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Тест за образуване на колонии. 2,000 клетки на ямка бяха посяти в 6-плака с ямки и бяха третирани на следващия ден; клетките бяха държани под въздействието на лечението общо 8 дни. Колониите, образувани във всяка ямка, се промиват с PBS, фиксират се със студен метанол при –20 градуса за 20 минути и се оцветяват с кристално виолетово 0,5% воден разтвор (V5265; MilliporeSigma).
Тест за изключване на трипаново синьо багрило. Реакционната смес за анализ на трипаново синьо се приготвя чрез смесване на 1 част от 0.4% трипаново синьо (25- 900-CI, Corning) и 1 част разредени клетъчни проби. Сместа се инкубира за 1 минута и клетките се преброяват на Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Фигура 8. DC661-индуцирана повърхностна експресия на калретикулин подготвя Т клетки срещу туморни клетки. (А)
Фигура 9. Инокулирането на третирани с DC661-клетки води до отхвърляне на тумора в специфичен контекст. (А)
ПЯНА-LPO. LLP е изследван с помощта на флуоресцентна сонда, FOAMLPO. FOAM-LPO се синтезира, както е описано по-горе (26). Клетките се култивират върху 8-ямков μSlide (пак там, 80807) и се третират с инхибитори и със или без DC661. Клетките се инкубират със среда, съдържаща FOAM-LPO (1 М) в атмосфера от 5% CO2 и 95% въздух за 5 минути при 37 градуса. Клетките се промиват два пъти със среда и след това клетките се наблюдават под микроскоп (Zeiss Axio Observer 7 обърнат микроскоп), за да се открие флуоресценция, изместваща се от 586 на 512 nm в отговор на LLP. qRT-PCR и праймери. A375P (3 × 105) клетки се култивират в 60 mm панички и се третират с DMSO или DC661 (3 цМ) в продължение на 24 часа. Общата РНК се изолира с комплект за изолиране на РНК (QIAGEN, 74134) съгласно протокола на производителя. cDNA се синтезира с помощта на комплект iScript Reverse Transcriptase с 500 ng пречистена РНК съгласно протокола на производителя (Thermo Scientific, K1642). qPCR реакцията беше настроена с помощта на SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121), съдържаща 1 μL cDNA. Всички измервания бяха извършени в три екземпляра и BACTIN беше използван като вътрешен стандарт за ΔCT изчисления. Анализът на генната експресия е извършен с помощта на следните праймери: PTGS2/COX-2 напред (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 обратен (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS напред (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS обратен (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 напред (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 обратно (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN напред (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) и BACTIN обратно (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
трансфекция на siRNA. Генетични проучвания за нокдаун за човешки ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 и MFSD12 бяха проведени в A375P клетъчни линии. Проучвания за генетично инхибиране за миши Ppt1 и калретикулин бяха проведени в MC38 клетки. Нецелева siRNA (sc{{10}}), човешки ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), мишка Ppt1/Cln1 (sc-142398) и калретикулин /Calregulin (sc-29895) siRNA са закупени от Santa Cruz Biotechnology. Тези siPHK се състоят от пулове от 3–5 целеви специфични siPHK. Поточна цитометрия. Индукцията на фероптоза се измерва с помощта на C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Клетките A375P се посяват в 6-плака с ямки и се третират с DMSO, феростатин{{40}} (10 μM), рокстатин за устни-1 (2 μM), еластин (5 μM ), DC661 (3 μM) или комбинация за 24 часа. Клетките се събират чрез центрофугиране при 300 g за 5 минути. Клетките се ресуспендират в 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV), съдържащ 1 μM C11-BODIPY и се инкубират при 37 градуса за 15 минути. Клетките се пелетират и ресуспендират в 500 μL 1X HBSS и интензитетът на флуоресценция се измерва на BD LSRII цитометър, като се използва 530/30 Blue (Flow Core Facility на Университета на Пенсилвания). Количественото определяне на експресията на клетъчната повърхност на калретикулин за имуногенна клетъчна смърт се извършва, както е описано по-горе (45) чрез поточна цитометрия. B16F10 или MC38 клетки бяха култивирани и третирани с NAC (10 mM) или DC661 (3 µM) в продължение на 24 часа. MC38 клетки бяха третирани със siPpt1 или siNT в продължение на 48 часа в присъствието или отсъствието на 10 mM NAC в продължение на 24 часа. Клетките бяха оцветени с CALR антитяло (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 козе анти-заешко второ антитяло (Invitrogen) и пропидиев йодид (PI) (Biolegend, 421301). Оцветените проби бяха получени на BD LSRII поточен цитометър, използвайки 710/50 синьо и 670/30 червено за улавяне съответно на PI и CALR флуоресценция (съоръжение Flow Core на Университета на Пенсилвания) и анализът беше ограничен до CALR-положителни и PI-отрицателни клетки за да избегнете фалшиво положителни събития. Т-клетъчно праймиране и процентна цитотоксичност. B16 или MC38 туморни клетки (5 × 104) се култивират и третират с NAC (10 mM) или DC661 (1 μM или 3 μM), съответно за 24 часа. За генетично инхибиране на Calr, клетките MC38 бяха третирани с Calr siRNA или нецелева siRNA (siNT) в продължение на 48 часа, последвано от третиране с DMSO или 3 μM DC661 в продължение на 24 часа. След това спленоцитите се култивират с DC661 със или без клетки B16 или MC38 в присъствието на IL-2 (5 IU/mL) и се култивират съвместно в продължение на 72 часа. Първичното се потвърждава от IFN-ELISA (Biolegend, 430815) на супернатанта. След това праймираните спленоцити се култивират съвместно с прясно култивирани B16 или MC38 клетки със съотношения мишена към ефектор (B16 или MC38 към спленоцити) съответно 1:20 и 1:50 за B16 и MC38 клетки. Свързаното с клетъчна смърт B16 или MC38 освобождаване на LDH и след това процентната цитотоксичност се измерва съгласно протокола на производителя (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Тестове за противотуморна ваксинация и химиотерапевтични изследвания с установени модели на рак. Женски мишки WT C57BL/6, NOD/SCID и BALB/c на възраст от шест до осем седмици бяха получени от The Jackson Laboratory. За експерименти с противотуморна ваксинация, WT B16F10, MC38 и CT26 клетки бяха третирани с DC661 (3 μM) в продължение на 36 часа в 175 cm2 колби. След това, супернатантите и отделените клетки бяха събрани в 50 mL falcon епруветка. Клетките бяха центрофугирани и промити с ледено студен PBS. За ваксинация, 150 μL клетъчна суспензия се инжектира подкожно в левия хълбок на имунокомпетентни C57BL/6 мишки, имунодефицитни NOD/SCID мишки (1,8 × 104 B16F10 клетки, 1,5 × 106 MC38 клетки на мишка) или сингенни BALB/c мишки (3,0 × 106 CT26 клетки на мишка). Замразени-размразени клетки, ресуспендирани в PBS, се инжектират като отрицателна контрола. Една седмица по-късно живи ракови клетки от същия тип (3 × 104 B16F10 клетки, 2 × 105 MC38 клетки или 5 × 105 CT26 клетки на мишка) с равен обем Matrigel (Corning, 354248) бяха инжектирани в десния хълбок на ваксинирани мишки. Туморите се измерват с помощта на електронни шублери и обемът се изчислява като L × W2 × 0.5. Растежът на тумора се наблюдава редовно през следващите дни и липсата на тумори се счита за индикация за ефективна противотуморна ваксинация. Проучванията за ваксиниране с DC661-MC38 бяха повторени при мишки NOD/SCID. Статистика. Статистическата значимост беше определена чрез използване на несдвоения, 2-опашен t-тест на Student при сравняване на 2 групи. Използван е 1-тестът ANOVA, когато са сравнени повече от 2 групи. Нулевата хипотеза беше значително отхвърлена, ако P стойността беше по-малка от 0,05. Данните са показани като средна стойност ± SEM. Одобрение на изследването. Всички експерименти с животни бяха проведени в съответствие с протоколите, одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Университета на Пенсилвания.
Китайска билка растение цистанче-Противотуморно
Препратки
1. Zeh HJ, et al. Рандомизирано фаза II предоперативно проучване на инхибиране на аутофагията с високи дози хидроксихлорохин и гемцитабин/Nab-паклитаксел при пациенти с рак на панкреаса. Clin Cancer Res. 2020; 26 (13): 3126–3134.
2. Rebecca VW и др. PPT1 насърчава растежа на тумора и е молекулярната цел на производните на хлорохина при рак. Рак Discov. 2019; 9 (2): 220–229.
3. Brun S, et al. GNS561, нов инхибитор на автофагия, активен срещу ракови стволови клетки при хепатоцелуларен карцином и чернодробни метастази от колоректален рак. J Рак. 2021; 12 (18): 5432–5438.
4. Brun S, et al. GNS561, инхибитор на PPT1 в клиничен стадий, е ефективен срещу хепатоцелуларен карцином чрез модулиране на лизозомни функции. Автофагия. 2022; 18 (3): 678–694.
5. Oberle C, et al. Пермеабилизирането на лизозомната мембрана и освобождаването на катепсин е Bax/Bak-зависимо, усилващо събитие на апоптоза във фибробласти и моноцити. Клетъчна смърт Разл. 2010; 17 (7): 1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Лизозомна мембранна пропускливост при клетъчна смърт. Онкоген. 2008; 27 (50): 6434–6451.
7. Rebecca VW и др. Унифициран подход за насочване към деградативни и сигнални роли на лизозомата. Рак Discov. 2017; 7 (11): 1266–1283.
8. Tang R, et al. Фероптоза, некроптоза и пироптоза при противораков имунитет. J Hematol Oncol. 2020; 13 (1): 110.
9. Yamamoto K, et al. Автофагията насърчава имунното избягване на рак на панкреаса чрез разграждане на MHCI. Природата. 2020; 581 (7806): 100–105.
10. Deng J, et al. Инхибирането на ULK1 преодолява компрометираното представяне на антиген и възстановява антитуморния имунитет при LKB1 мутантен рак на белия дроб. Нат Рак. 2021; 2 (5): 503–514.
11. Lazarou M, et al. Убиквитин киназата PINK1 набира рецептори за автофагия, за да индуцира митофагия. Природата. 2015; 524 (7565): 309–314.
12. Choi YB, et al. TAX1BP1 ограничава индуцираната от вирус апоптоза чрез улесняване на медиираното от сърбеж разграждане на митохондриалния адаптер MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, et al. Bnip3 уврежда митохондриалната биоенергетика и стимулира митохондриалния оборот. Клетъчна смърт Разл. 2011; 18 (4): 721–731.
14. Leu JI, et al. Механична основа за увредена фероптоза в клетки, експресиращи африкано-центричния S47 вариант на p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Мутантните BRAF и MEK инхибитори регулират туморната имунна микросреда чрез пироптоза. Рак Discov. 2020; 10 (2): 254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Лизозомна мембранна пермеабилизация при клетъчна смърт: нови доказателства и последици за здравето и болестта. Ann NY Acad Sci. 2016; 1371 (1): 30–44.
17. Thirusangu P, et al. Индуцираната от квинакрин аутофагия при рак на яйчниците задейства медиирана от катепсин-L пермеабилизация на лизозомна/митохондриална мембрана и клетъчна смърт. Ракови заболявания (Базел). 2021;13(9):2004.
18. Michallet MC, et al. Катепсин-зависима апоптоза, предизвикана от супраоптимално активиране на Т-лимфоцити: възможен механизъм на толерантност към високи дози. J Immunol. 2004; 172 (9): 5405–5414.
19. Mondal A, et al. Ppt1-дефицитът нарушава лизозомната Ca++ хомеостаза, допринасяйки за патогенезата в миши модел на CLN1 заболяване. J Наследяване на Metab Dis. 2022; 45 (3): 635–656. 20. Engel KM, et al. Липидни биомаркери, получени от фосфолипази и реактивни кислородни видове при здрави и болни хора и животни - фокус върху лизофосфатидилхолина. Фронт физиол. 2021;12:732319.
21. Fu R, et al. Ефикасност на N-ацетилцистеин при фенотипно потискане на миши модели на болест на Niemann-Pick, тип C1. Хум Мол Генет. 2013; 22 (17): 3508–3523.
22. Boz Z, et al. N-ацетилцистеинът предотвратява индуцирания от оланзапин оксидативен стрес в mHypoA-59 невроните на хипоталамуса. Sci Rep. 2020; 10 (1): 19185.
23. Khare S, et al. ASS1 и ASL потискат растежа на ясноклетъчен бъбречноклетъчен карцином чрез променен азотен метаболизъм. Рак Metab. 2021; 9 (1): 40.
24. Gęgotek A, et al. Сравнение на защитния ефект на аскорбиновата киселина върху взаимодействията на редокс и ендоканабиноидните системи in vitro култивирани фибробласти на човешка кожа, изложени на UV радиация и водороден пероксид. Arch Dermatol Res. 2017; 309 (4): 285–303.
25. De Raedt T, et al. Използване на уязвимостта на раковите клетки за разработване на комбинирана терапия за тумори, причинени от ras. Ракова клетка. 2011; 20 (3): 400–413.
26. Zhang X, et al. Мониторинг на липидната пероксидация в пенестите клетки чрез насочена към лизозома и съотношителна сонда. Anal Chem. 2015; 87 (16): 8292–8300.
27. Wei CY, et al. Базираният на биоинформатика анализ разкрива повишен MFSD12 като ключов промотор на клетъчната пролиферация и потенциална терапевтична цел при меланома. Онкоген. 2019; 38 (11): 1876–1891.
28. Aldini G, et al. N-ацетилцистеинът като антиоксидант и дисулфиден разграждащ агент: причините защо. Free Radic Res. 2018; 52 (7): 751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Лизозомната метаболомика разкрива V-ATPase- и mTOR-зависима регулация на ефлукса на аминокиселини от лизозомите. Наука. 2017; 358 (6364): 807–813.
30. Zhou J, et al. Имуногенна клетъчна смърт при терапия на рак: настоящи и нововъзникващи индуктори. J Cell Mol Med. 2019; 23 (8): 4854–4865. 31. Sharma G, et al. Инхибирането на PPT1 повишава антитуморната активност на анти-PD-1 антитялото при меланома. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF аутофагия и инхибиране на MEK при меланома): фаза I/II изпитване на дабрафениб, траметиниб и хидроксихлорохин при напреднал BRAFV600-мутантен меланом. Clin Cancer Res. 2022; 28 (6): 1098–1106. 33. Loi M, et al. Протеините на макроавтофагията контролират нивата на МНС клас I върху дендритни клетки и оформят антивирусните CD8(+) Т клетъчни отговори. Cell Rep. 2016; 15 (5): 1076–1087.
34. Jouandin P, et al. Лизозомната мобилизация на цистеин оформя реакцията на TORC1 и тъканния растеж на гладуване. Наука. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Швалфенберг ГК. N-ацетилцистеин: преглед на клиничната полезност (старо лекарство с нови трикове). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Beer LA, et al. Систематично откриване на серумни биомаркери за извънматочна бременност с помощта на профилиране на 3-D протеин, съчетано с количествено определяне без етикети. J Proteome Res. 2011; 10 (3): 1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Първичният ефект върху протеома на ARID1A-мутиран овариален светлоклетъчен карцином е понижаването на мевалонатния път на пост-транскрипционно ниво. Mol клетъчна протеомика. 2016; 15 (11): 3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant дава възможност за високи скорости на идентификация на пептиди, индивидуализирани точности на масата в диапазона на ppb и количествено определяне на протеина в целия протеом. Nat Biotechnol. 2008; 26 (12): 1367–1372.
39. Cox J, et al. Andromeda: пептидна търсачка, интегрирана в средата MaxQuant. J Proteome Res. 2011; 10 (4): 1794–1805.
40. Cox J, et al. Прецизно количествено определяне без етикети за целия протеом чрез забавено нормализиране и екстракция на максимално пептидно съотношение, наречено MaxLFQ. Mol клетъчна протеомика. 2014; 13 (9): 2513–2526.
41. Тянова С и др. Изчислителната платформа Perseus за цялостен анализ на (проте)омични данни. Nat методи. 2016; 13 (9): 731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: биоинформатична платформа за интегративен анализ на протеомични данни в изследванията на рака. Методи Mol Biol. 2018; 1711: 133–148.
43. Alicea GM, et al. Промените в липидния метаболизъм на остарелите фибробласти индуцират зависима от възрастта резистентност на меланомните клетки към целева терапия чрез транспортера на мастни киселини FATP2. Рак Discov. 2020; 10 (9): 1282–1295.
44. Ran FA, et al. Геномно инженерство с помощта на системата CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013; 8 (11): 2281–2308.
45. Liu P, et al. Количествено определяне на експозицията на калретикулин, свързана с имуногенна клетъчна смърт. Методи Enzymol. 2020; 632: 1–13.
