Мелатонин от микроорганизми, водорасли и растения като възможни алтернативи на синтетичния мелатонин, част 1

Резюме: Диетичните добавки с мелатонин се консумират широко в световен мащаб, като най-големите потребители са развитите страни, с прогнозен годишен темп на растеж от приблизително 10 процента до 2027 г., главно в развиващите се страни. Широката употреба на мелатонин срещу нарушения на съня и специфични проблеми, като забавяне на часовете, е добавена към други приложения, като анти-стареене, антистрес, активиране на имунната система, противоракови и други, които са предизвикали употребата му, като цяло без рецепта. В момента химическата индустрия покрива 100% от нуждите на пазара на мелатонин. Мотивирана от сектори с по-естествени потребителски навици, възможността за получаване на мелатонин от растения, наречен фитомелатонин, се появи преди няколко години. Съвсем наскоро фармацевтичната индустрия разработи генетично модифицирани микроорганизми, чиято способност да произвеждат естествен мелатонин в биореактори е подобрена. Тази статия разглежда аспектите на химичния и биологичен синтез на мелатонин за консумация от човека, главно като хранителна добавка. Анализират се предимствата и недостатъците на получаването на мелатонин от микроорганизми и фитомелатонин от растения и водорасли, както и предимствата на естествения мелатонин, като се избягват нежеланите химически странични продукти от химическия синтез на мелатонин. Накрая се анализират икономическите и качествените аспекти на тези нови продукти, някои от които вече са пуснати на пазара.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Cistanche Странични ефекти Reddit

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключови думи: хранителни добавки; ГМО; мелатонин; микроорганизми; фитомелатонин; растителна суровина

1. Въведение

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is widely used around the world as a  dietary supplement. In general, melatonin is used as a sleep aid supplement, a mild tranquilizer, a generalist antioxidant, and an anticancer and anti-aging component, among others [1]. According to the American Psychiatric Association (APA), approximately one-third of adults suffer from insomnia during their lifetime [2]. It manifests itself in ongoing problems falling asleep and staying asleep. Therefore, it is very likely that the use of synthetic melatonin will spread. In 2019, the global production of synthetic melatonin,  which was around 4000 tons, accounted for around 1.3 billion USD. This vast market is fully assisted by the chemical melatonin, whose synthesis process is very cheap, effective, and,  therefore, lucrative. The melatonin market is expected to grow at a CAGR (compound annual growth rate) of >10 процента през следващите 5 години. С това значително увеличение на търсенето проблемите с безсънието, породени от пандемията от COVID-19, са от голямо значение [3]. Северна Америка е с най-голямо потребление, следвана от Европа. Глобалният пазар на мелатонин се контролира главно от няколко големи компании, като BASF, Aspen Pharmacare Australia, Nature's Bounty, Pfizer Inc., Natrol LLC, Aurobindo Pharma и Biotics Research Co. Имайте предвид, че консумацията на мелатонин за медицински цели включва около 50 процента от произведения синтетичен мелатонин; останалото има химически и индустриални приложения [2,4].

Биологично, мелатонинът е молекула, широко разпространена във всички царства на живите организми [5]. Открит през 1958 г. в епифизната жлеза на крава [6] и по-късно при хора [7], той е една от най-изследваните биомолекули и са известни множеството му функции, главно при бозайници [8,9], но също и при риби [10–12], домашни птици [13,14] и безгръбначни [15]. В животинските и човешките клетки мелатонинът действа като антиоксидант – важна роля, която му се приписва през 1993 г. [16–18]. Мелатонинът действа като интересен защитник на клетките в стресови ситуации, в различни физиологични аспекти при хората и, според множество проучвания, благоприятства подобряването на различни заболявания и дисфункции. Фигура 1 показва някои от защитните и регулаторни действия на мелатонина при хората и представя мелатонина като интересна плейотропна молекула, открояваща се поради своята значимост, ролята на мелатонина в регулирането на липидния и глюкозния метаболизъм, предизвикване на нощна инсулинова резистентност и дневен инсулин чувствителност. Този ефект изглежда е свързан с нощното гладуване и дневното хранене, предотвратявайки прекомерното наддаване на тегло [19]. Ние също подчертаваме неговата роля като антионкогенен агент, инхибиращ растежа, пролиферацията и метастазите на няколко тумора. Лечението на тумори с мелатонин подобрява чувствителността към химио- и лъчетерапия, действайки като синергична молекула в контрола на раковите клетки. Освен това мелатонинът смекчава острото увреждане на нормалните клетки, като ги предпазва от лекарствена токсичност, вероятно чрез засилване на имунните отговори [20–22]. Сред дисфункциите и заболяванията, при които са изследвани полезните ефекти на мелатонина, са неврологичните, като Алцхаймер, Паркинсон, фибромиалгия, депресия, хиперактивно разстройство с дефицит на вниманието, аутизъм и мигрена; сърдечно-съдови здравословни проблеми, включително хиперхолестеролемия, хипертония, метаболитен синдром и гликемичен дисбаланс; стомашно-чревни здравословни проблеми, като гастроезофагеален рефлукс, язви и синдром на раздразнените черва; имунологични здравословни проблеми, като множествена склероза, автоимунни реакции (атлетичен стрес, токсичен стрес, псориазис и др.), сепсис, COVID-19 и др. [3,23–26]; и също така остеопения [27], саркопения [28], прееклампсия, фертилитет, синдром на поликистозни яйчници и менопауза, наред с други [29–32]. Въпреки това, въпреки че мелатонинът е молекула, която е широко изследвана от 50-те години на миналия век, проведените проучвания изискват повече клинични и обширни двойно-слепи проучвания, за да се изясни неговото понякога объркващо плейотропно действие [33,34].

Въпреки това, мелатонинът е добре известен като хормона, който регулира съня. Неговите осцилиращи нива в кръвния поток според периодите на светлина и тъмнина (циркадни ритми), дължащи се на освобождаването на мелатонин от епифизната жлеза, е един от най-изследваните и известни аспекти на тази молекула. Повишаването на нивата на мелатонин в кръвта по време на първия период на сън до около 150–220 полюса/mL действа върху започването на съня, намалява латентността и фрагментацията на съня и увеличава продължителността и качеството на съня [1,35,36]. Мелатонинът действа като вътрешен синхронизатор на циркадния цикъл сън-събуждане и сезонната ритмичност. В този смисъл, много разстройства на съня са били лекувани с мелатонин, включително синдром на забавената фаза на съня, разстройство на съня при работа през нощта, сезонно афективно разстройство, разстройства на съня при слепи и стареещи и патофизиологични разстройства при деца, със забележими подобрения в качеството на съня [ 37–41]. Най-широко разпространеното разстройство, лекувано с мелатонин, е джет лаг - дефазиране на ритъма сън-събуждане след трансокеански полети [42-45]. Вероятно акцентът в проучванията върху ролята му като регулатор на съня е причинил липса на проучвания за възможната му роля в много други физиологични и клинични аспекти.

Мелатонинът в растенията, така нареченият фитомелатонин, е открит едновременно от три изследователски групи в различни растителни материали през 1995 г. [46–48]. Терминът фитомелатонин, който се отнася до мелатонин от растителен произход (растения и водорасли), се използва за разграничаване от животински и/или синтетичен мелатонин. Този термин е много разпространен и се използва непрекъснато в изследванията на фитохимията, физиологията на растенията, ботаниката, хранителната химия и др., върху растителния мелатонин. В растенията фитомелатонинът също е плейотропна молекула, представяща множество роли в различни физиологични реакции (Фигура 1). Регулирането от мелатонин на аспекти като фотосинтеза, включително усвояване на CO2 от устицата и икономия на вода, метаболизъм на въглехидрати, липиди, азот и сяра и прост метаболизъм на фенол, флавоноиди и терпеноиди, демонстрира изключителен интерес към основните и технически процеси на вегетативното (поникване, растеж на растенията, вкореняване, разклоняване и др.) и репродуктивно развитие, включително плодовитост, партенокарпия, развитие на семена и плодове, узряване, стареене и запазване на плодове и рязани цветя [49–53]. Като цяло, мелатонинът регулира тези процеси чрез действието на растителната хормонална мрежа, регулирайки нагоре/надолу няколко биосинтезни, катаболни и транскрипционни фактори, които са свързани с растителните хормони [54–56]. Един от аспектите с най-голям агрономически и биотехнологичен интерес е ролята на фитомелатонина като промотор на толерантност срещу биотичен и абиотичен стрес [57–68] (Фигура 1). В момента фитомелатонинът се представя като интересно екологично средство за контрол на биологични заболявания и за улесняване на устойчивостта/адаптирането на растенията към/срещу изменението на климата.

2. Биосинтез на мелатонин

Мелатонинът е ацетилирано съединение, получено от серотонин. И двата индолови амина се синтезират от аминокиселината триптофан по биосинтетичен път, който е широко изследван както при животни, така и при растения [69,70]. В растенията триптофанът се превръща в триптамин от ензима триптофан декарбоксилаза (TDC) (Фигура 2). След това триптаминът се превръща в 5-хидрокситриптамин (серотонин) от триптамин 5-хидроксилазата (T5H), ензим, който е широко изследван в ориза и който може да действа с много субстрати, въпреки че това не е проучено в дълбочина. Серотонинът се N-ацетилира от серотонин N-ацетилтрансфераза (SNAT). След това N-ацетилсеротонинът се метилира от ацетилсеротонин метил трансфераза (ASMT) - хидрокси индол-О-метилтрансфераза - която генерира мелатонин. В растенията метилирането на N-ацетилсеротонин може да се извърши и от О-метилтрансфераза на кафеената киселина (COMT), клас ензими, които могат да действат върху различни субстрати, включително кафеена киселина и кверцетин [71]. Серотонинът може също да се трансформира в 5-метокситриптамин чрез ASMT/COMT, за да генерира мелатонин след действието на SNAT. Този път би възникнал при стареене и/или стресови ситуации [70,72]. Освен това, мелатонинът може да се генерира чрез образуването на N-ацетил триптамин от SNAT, който би се превърнал в N-ацетилсеротонин от T5H [73], въпреки че този път не е демонстриран, вероятно защото T5H е най-слабо проученият ензим от пътя. (Фигура 2). Интересното е, че до четири гена, кодиращи хистонови деацетилази (DAC), са идентифицирани в оризови растения, които могат да обърнат стъпките от серотонин към N-ацетилсеротонин и от 5-метокситриптамин към мелатонин. DAC, експресиран в хлоропласта, проявява ензимна активност към N-ацетилсеротонин, N-ацетил триптамин и мелатонин, с най-висока деацетилазна активност за N-ацетил тирамин [74].

В животинските клетки серотонинът се образува от 5-хидрокситриптофан след последователното действие на триптофан хидроксилазата (TPH) и TDC. Въпреки че TPH не е открит в растенията, наличието на 5-хидрокситриптофан предполага, че някои ензимни активности, като тази на TPH, действат в по-малка степен в растителните клетки. Освен това мелатонинът може да се генерира чрез образуването на 5-метокси триптамин, главно при условия на стрес, както е предложено от няколко автори, което предполага, че пътят на биосинтеза на мелатонин може да следва различни алтернативни пътища в сравнение с животинските клетки, с по-голяма способност за адаптиране към метаболитни промени в растенията [72,75]. Всички посочени ензими са открити и характеризирани в ориз и Arabidopsis, с изключение на TPH, който е добре известен при животните, но не и при растенията. Въпреки това, някои автори предполагат, че T5H може да действа като хидроксилаза с ниска субстратна специфичност и е способен да действа във всички описани стъпки на хидроксилиране [70,76–79]. Същата широка субстратна специфичност може да се припише и на SNAT, ASMT и COMT ензими. Междинните продукти на мелатонин се произвеждат в различни субклетъчни отделения, като цитоплазма, ендоплазмен ретикулум, митохондрии и хлоропласти, които определят последващите ензимни стъпки [80,81].

При микроорганизмите има малко изследвания върху пътя на биосинтеза на мелатонин [82]. Saccharomyces и бактериите (Geobacillus, Bacillus и Pseudomonas) произвеждат серотонин и мелатонин в различни концентрации [83–89]. Освен това производството на мелатонин е доказано от други автори в културите на дрождите Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae и S. uvarum и бактерии (Agrobacterium, Pseudomonas, Variovorax, Bacillus и Oenococcus) [85,90,91] и преди това във фотосинтезиращите бактерии Rhodospirillum rubrum [92] и Erythrobacter longus [93] и Escherichia coli [94].

При дрождите Saccharomyces cerevisiae, за разлика от растенията и животните, изглежда не се осъществява биосинтезата на 5-хидрокситриптофан от триптофан. Интересно е, че няколко от описаните етапи изглеждат обратими в S. cerevisiae, като между 5-хидрокситриптофан и серотонин, N-ацетилсеротонин и мелатонин и 5-метокси триптамин и мелатонин [90,95], както е описано подробно на фигура 2. В Bacillus amyloliquefaciens SB-9 и Pseudomonas fluorescens RG11, 5- хидрокситриптофан, серотонин и N-ацетилсеротонин, но не е открит триптамин [85,86]. И така, няколко гена от бактериален произход са използвани за изграждането на щам Escherichia coli, произвеждащ мелатонин. Например, генът DDC, кодиращ декарбоксилаза на ароматна L-аминокиселина от Candidatus Koribacter versatile Ellin 345 и Draconibacterium orientale, и генът AANAT, кодиращ алкиламин N-ацетилтрансфераза от Streptomyces griseofuscus, бяха анализирани [96,97]. Несъмнено са необходими допълнителни проучвания за изясняване на пълните биосинтетични пътища на мелатонин в различни прокариотни и еукариотни микроби [82].

3. Биологичен мелатонин срещу синтетичен мелатонин

Първоначално мелатонинът е получен за експериментални и клинични изследвания от животински източници (главно от епифизната жлеза и урина), с последващия риск от предаване на вируси [98,99]. Тези техники бяха оттеглени, когато мелатонинът можеше да бъде получен чрез химичен синтез [100]. Понастоящем целият мелатонин, използван за промишлени и медицински цели, се получава чрез използване на методи на химичен синтез. Тези методи, които създаваха сериозни проблеми през 80-те години, включително смъртни случаи поради наличието на странични продукти от синтеза на триптофан [101], днес са много по-безопасни и по-ефективни. Въпреки това, препаратите с мелатонин описват наличието на цял набор от нежелани странични продукти поради тяхната токсична природа. Фигура 3 показва три от най-често използваните пътища за химичен синтез на мелатонин и страничните продукти, които се генерират при неговия синтез [102]. Синтезът на мелатонин от триптофанови производни (Фигура 3, Схема А) генерира токсични странични продукти, които понякога причиняват значителни заболявания, като синдром на еозинофилия-миалгия [101,103,104], докато най-актуалните методи (Фигура 3, Схема Б) за синтезът на мелатонин от фталимид [105] поражда сериозни съмнения относно токсичността на няколко от страничните продукти, които се генерират [106]. В допълнение, индоловите реакции на Фишер от алиламин (Фигура 3, Схема C) представят опасни и токсични реагенти [107].

От друга страна, получаването на мелатонин от неживотински биологични източници се представя като силен ангажимент към бъдещето, не за да замени синтетичния мелатонин, а за да бъде по-естествен допълнителен и алтернативен източник [108].

4. Стратегии за получаване на биологичен мелатонин

Мелатонинът присъства във всички известни биологични видове, от прокариоти до еукариоти, включително дрожди, водорасли, гъби и растения, както и животни [80,109–111]. По-долу са представени методологиите, разработени в микроорганизми и растения като възможни източници на естествен мелатонин.

4.1. Мелатонин от микроорганизми

а. Saccharomyces

Първият подход към производството на биологичен мелатонин наскоро беше направен от група от датската фармацевтична компания Novo Nordisk, използвайки генетично модифицирани Saccharomyces cerevisiae (Таблица 1, продукт #1). Герман и сътрудници конструираха рекомбинантен път на мелатонин в щам дрожди, който съдържаше хетероложни гени, кодиращи няколко ензима за биосинтеза на мелатонин и пътища, поддържащи кофактори [112]. Трансгенните дрожди кодират различни гени от Rattus norvegicus, Lactobacillus ruminis, Pseudomonas aeruginosa, Homo sapiens, Schistosoma mansoni, Bos Taurus и Salmonella enterica. Хранейки дрожди само с глюкоза и ацетил Co-A, производството на мелатонин достига 14,5 mg·L -1 на 76 h. Въпреки това, според други автори, някои проблеми, като високото натрупване на N-ацетилсеротонин в клетките на дрождите, небалансираната генна експресия и идентифицирането на някои потенциални токсични междинни продукти, трябва да бъдат разгледани [113].

b. Ешерихия коли

При втори подход, този път използвайки трансгенно-модифицирана култура на Escherichia coli (Таблица 1, продукт #2), Novo Nordisk докладва за биологичното производство на мелатонин от хетероложен щам, конструиран от рекомбинантна E. coli, включително няколко гена като TDC гена от Candidatus Koribacter versatile, SNAT гена от Streptomyces griseofuscus и човешкия ASMT ген. Освен това, някои гени, свързани с триптофан, бяха блокирани или изтрити, за да се предотврати нежелано потискане, разграждане и експортен транспорт [96,97]. След няколко подобрения на щама и хранене с минерални соли, витамини и антибиотици, култивираните клетки генерират мелатонин при ~1 g·L −1, използвайки глюкоза като единствен източник на въглерод и до 2 g·L −1 в клетки, захранвани с триптофан, с незначителни нива на странични продукти. По този начин, според авторите, тези ГМО щамове E. coli могат да бъдат основата за бъдещо биологично комерсиално производство на мелатонин с помощта на фабрики за микробни клетки. Независимо от това, използването на трансгенни организми за производство на вещества за човешка консумация може да бъде проблематично, когато целта е да се предостави естествен продукт на чувствителен потребител или потребител, който е против ГМО.

° С. Млечнокисели бактерии

Мелатонинът също се произвежда индустриално чрез микробна ферментация, както се съобщава в [114]. Биосинтезата на мелатонин се ръководи от многощамови млечнокисели бактерии, като Lactobacillus sp. (L. brevis, acidophilus, bulgaricus, casei subspecies. sake, fermentum, helveticus subspec. jogorti, plantarum); Bifidobacterium sp. (B. breve spp. breve, longum spp. infantis); Enterococcus sp. (E. faecalis TH10); и Streptococcus thermophilus. Продуктите, произведени по тази технология, се предлагат на пазара от Quantum Nutrition Labs (Тексас, САЩ) като Melatonin Drops, Qultured™, съдържащи 8 mg дрожден мелатонин (Таблица 1, продукт #3).

д. Хлорела

Продукт, произведен от водорасли, е Herbatonin® (Таблица 1, продукт №4), формулиран в хапчета, съдържащи 0.3 или 3 mg фитомелатонин, въпреки че в Европа се продава в дози от 0.3 и 1,9 мг, съгласно законите на ЕС. Тази формула съдържа няколко растителни вида като ориз (Oryza sativa L.) и люцерна (Medicago sativa L.), заедно със зелените водорасли Chlorella pyrenoidosa и C. vulgaris. Нашите данни показват, че тези микроводорасли съдържат не повече от 2–15 ng·g DW−1 [115], а придружаващите растителни видове съдържат много ниски нива на фитомелатонин, 1–5 ng·g−1 в ориза и 16 ng·g −1 в люцерна [116]. Наличието на Chlorella предполага, че фитомелатонинът се получава главно чрез култивиране на зелени водорасли в биореактори, вероятно захранвани с прекурсори като триптофан, по подобен начин на този в Achillea millefolium [117], въпреки че няма публикувани данни за метода на получаването на тези богати на фитомелатонин екстракти, само тяхната биохимична характеристика [118]. Липсват и данни за контрол на наличието на цианотоксини в тези екстракти поради възможните замърсявания от цианобактерии (синьо-зелени водорасли). Тези цианотоксини имат няколко нежелани ефекта, свързани с канцерогенност, хепатотоксичност и невротоксичност, между другото. По този начин откриването на цианотоксини в някои хранителни добавки с водорасли засилва необходимостта от по-добър контрол на качеството [119,120].

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】