Резюме:Фитохимично изследване на семена от египетски мандарин (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) даде тринадесет известни съединения, 1–13. Структурите на изолираните съединения бяха определени с помощта на 1D и 2D NMR и HRESIMS анализи. За характеризиране на фармакологичната активност на тези съединения бяха приложени няколко интегрирани експеримента, базирани на виртуален скрининг и базирани на симулация на молекулярна динамика. В резултат на това съединения 2, 3 и 5 са ​​предполагаемо идентифицирани като инхибитори на хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа. Последвалото in vitro тестване беше направено, за да се валидират базираните на in silico експерименти, за да се подчертае потенциалът на тези флавоноиди като обещаващи инхибитори на хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа със стойности на IC50, вариращи от 6,39 ± 0,36 до 73,7 ± 2,33 µM . Настоящото изследване хвърли светлина върху потенциала на отпадъчния продукт на египетския мандарин портокал (т.е. неговите семена) като естествен агент, подпомагащ здравето на кожата. Освен това, той разкри приложимостта на интегрирания виртуален скрининг, базиран на обратен докинг, и експерименти, базирани на MDS, за ефективно прогнозиране на биологичния потенциал на природните продукти.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да пречиства DPPH свободните радикали и има способността да пречиства реактивните кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на анионите от свободните радикали на тимина.

Щракнете върху Cistanche Tablets Предимства

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Въведение

Мандарините, C. reticulata, са едни от най-забележителните цитрусови култури за прясна употреба [1]. Те често се представят като „мандарини“; обаче „мандарин“ е по-популярното име. В природата са разпространени няколко хибрида и сортове мандарини [1]. Най-известните, сложни видове се състоят от C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore и C. reticulata Blanco [1,2]. Мандарините са сред основните цитрусови плодове, събрани в много страни. Въпреки че културите се използват главно за десерт, те имат значително търговско значение поради етеричните си масла [3]. Цитрусовите аромати се прилагат в напитки, сладкарски изделия, бисквити и десерти [4]. Също така кората на C. reticulata се използва за ароматизиране на алкохол [4].

Инверсното докингване е вид метод за виртуален скрининг, който може да се манипулира, за да се предвидят потенциалните молекулярни цели за дадена структура на съединение. Преди това сме използвали този ефикасен метод за виртуален скрининг, за да определим най-добрите протеинови цели за няколко изолирани природни продукта [5]. Въпреки това, докинг резултатите, които са резултат от тази стъпка на предварителен скрининг, предоставят само известна информация за структурната комплементарност между протеиновите мишени и структурата на търсеното съединение [6]. Съответно експериментите със симулация на молекулярна динамика (MDS), включително свободна енергия на абсолютно свързване (∆Gbinding), осигуряват по-строги и надеждни резултати, които могат да бъдат избрани за in vitro тестване. Тук подложихме семената на C. reticulata на поетапно хроматографско изолиране, за да добием известна представа за основния фитохимикал в този отпадъчен продукт. Впоследствие проучихме дали тези фитохимикали имат определени фармакологични ефекти, като ги подложихме на поетапен анализ, базиран на силико, който беше иницииран от цялостно обратно докингване и завърши с няколко MDS експеримента. Потенциалът на биоактивните фитохимикали, извлечени от семената на C. reticulata, хвърля светлина върху високия капацитет на отпадъчните продукти от ядливи плодове като огромен резервоар за агенти, насърчаващи здравето.

2. Материали и методи

2.1. Растителен материал

Плодовете на C. reticulata бяха събрани през януари 2021 г. от местен регион в Бени-Суеф, Египет, и удостоверени от старши ботаник, проф. д-р Абд Ел-Халим А. Мохамед Отдел за изследване на флората и фитотаксономията; Изследователски институт по градинарство; Доки; Кайро; Египет). Екземпляр от плодовете се съхранява под номер на ваучер 2021-BuPD 80 в отдела по фармакогнозия; Факултет по фармация; Университет на Бени-Суеф; Египет).

2.2. Химикали и реактиви

Етил ацетат (EtOAc), метанол (MeOH), n-хексан (n-Hex), етанол (EtOH), дихлорометан (DCM) и n-бутанол (n-BuOH) бяха придобити от El-Nasr Company, Египет. Sigma Aldrich, Saint Louis, Мисури, САЩ, предостави деутерирани разтворители за NMR анализ, както и разтворители с висока чистота за HPLC, спектроскопски и хроматографски анализи (напр. метанол-d4 (CD3OD), диметилсулфоксид-d6 (DMSO), хлороформ -d (CDCI3), метанол за HPLC, вода с клас HPLC и ацетонитрил с клас HPLC). За хроматографско изолиране, Sephadex LH20 (0.25–0.1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; CA, САЩ) и силикагел (E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, USA) бяха използвани. За вакуумна течна хроматография беше използван силикагел за TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Cairo, Egypt) (VLC). Предварително покрит силикагел (E-Merck, Дармщат, Германия) се използва за TLC изследвания. Произведените петна се идентифицират с параанисалдехид след нагряване при 110 ◦C [7]. Всички материали за биологични изследвания идват от Sigma Chemical Company (SCC; Калифорния, САЩ).

2.3. Спектрални анализи

NMR сигналите се получават при 400 за 1H-NMR и 100 MHz за 13C-NMR. Пиковете на CDCl3-d, CD3OD-d4 и DMSO-d6 разтворители бяха използвани като референтни сигнали. NMR сигналът беше получен с помощта на NMR машина Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, California, MA, USA).

Масови данни с висока разделителна способност бяха събрани с помощта на Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-машина, свързана с Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometer (Waters, Milford, MA, USA). Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC беше използван за постигане на HPLC хроматографско разделяне.

2.4. Приготвяне на екстракт от семена на C. reticulata

Семената на C. reticulata (1 килограм) бяха закупени пресни и след това изсушени на въздух на сянка. След това семената се настъргват с помощта на машина за смилане (Хенан, континентален Китай). След това прахообразният продукт се екстрахира старателно със 70 процента EtOH (1 L × 5). Полученият течен екстракт се концентрира с помощта на ротационен изпарител (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) под вакуум при 45 ◦C, за да се осигури 100 g суров сух екстракт, който след това се разделя с помощта на серия от разтворители с нарастваща полярност: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Фракции I (24.0 g), II (5.0 g), III (3.0 g) и IV (6.0 g) бяха получени чрез изпаряване на отделената органична фаза при понижено налягане. Всички екстракти и фракции се съхраняват при 4 ◦C за последващ фитохимичен и биохимичен анализ.

2.5. Изолиране на основните природни продукти от семена на C. reticulata 

TLC-силикагелна колона се използва за излагане на фракция I (20 g) на нормален VLC. Използвани са EtOAc и n-Hex последователно елуиране (0–100 процента, 5 процента нарастване). Три подфракции (I1–I3) бяха получени чрез събиране на идентични фракции и изпаряването им при понижено налягане. В друга колона със силикагел, субфракция I1 (1.0 g) беше екстензивно фракционирана. Хроматографско елуиране се извършва с n-Hex до EtOAc, градиентни смеси (0-10 процента, 1 процент нарастване, 100 mL всяка), за да се осигури съединение 13. (10 mg).

Подфракция I2 (50 mg) беше допълнително хроматографирана върху силикагел-60 (100 × 1 cm, 20 g). Хроматографската процедура беше извършена с използване на DCM: MeOH, изократна смес (0.5 процента, 500 mL), за да се получат съединения 8 (20 mg) и 9 (15 mg). Подфракция I3 беше донякъде фракционирана върху силикагел 60 (100 × 1 cm, 20 g). Произведено елуиране с използване на DCM: МеОН, изократна смес (0.5 процента, 500 mL), за да се получи 10 (20 mg).

TLC колона със силикагел се използва за излагане на фракция II (2.5 g). DCM: EtOAc (0–100 процента, нарастване с 5 процента) се използва за елуиране на пробите. Произведените отпадъчни води се получават на части от 250 mL. Бяха получени идентични фракции и редуцирани до две подфракции (II1–II2) при понижено налягане. В друга колона със силикагел, субфракция I1 (1.0 g) беше екстензивно фракционирана. Съединение 5 се елуира с помощта на DCM: EtOAc (0-10 процента, 1 процент нарастване, 100 mL всеки) (10 mg).

Подфракция I2 (50 mg) беше допълнително хроматографирана върху силикагел60 (100 × 1 cm, 20 g). Прилага се хроматографско елуиране с използване на DCM към МеОН (изократно елуиране; 0.5 процента, 500 mL), за да се получат съединения 11 (20 mg) и 12 (15 mg).

При нормален VLC, фракция IV (60 g) се отделя с помощта на силикагел. DCM: EtOAc (0–100 процента, 5 процента нарастване, 250 mL всеки) се използва за елуиране на пробите. Хроматографските отпадъчни води се получават на стъпки от 250 mL.

Идентични фракции бяха групирани и редуцирани при понижено налягане, за да се получат пет субфракции (IV1–V5); подфракции IV1, IV2, IV3 и IV4 бяха само леко хроматографирани върху колона Sephadex-LH20, елуирана с МеОН, за да се получат 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) и 1 (15 mg, съответно, докато субфракция IV5 е значително чиста (10 mg).

2.6. In Silico Study

2.6.1. Инверсно докинг

Вероятните молекулярни мишени за отделените флавоноиди бяха заключени чрез подлагане на техните структури на виртуален скрининг в зависимост от обратния докинг срещу почти всички протеини, раздадени в Protein-Data-Bank; PDB.

За тази стъпка беше използвана онлайн базираната платформа IdTarget. Тази програма за скрининг на нищожна виртуална структура използва специфичен обратен докинг метод, а именно DivideConquer-Docking, който конструира ограничени припокриващи се мрежи, което прави изследването на протеина по-ограничено. В резултат на това той може да извърши голям брой скачвания за кратко време [8]. Получените резултати бяха описани като списък с оценки, вариращи от най-лошите до най-добрите. За да идентифицираме оптималните белтъчни цели за всяка дадена структура, ние използвахме афинитетен резултат от -10 kcal/mol като гранична стойност (Таблица 1).

Експериментите за симулация на молекулярна динамика (MDS) бяха проведени, както беше съобщено по-рано от Alhadrami et al. 2021 г. [6]. MDS машината на софтуера Maestro (т.е. Desmond v. 2.2; Хамбург, Германия) беше използвана за провеждане на MDS експерименти [9–11]. OPLS-Force-Field беше използвано за симулационни изпълнения.

Подготовката на протеинови структури беше извършена от алгоритъма System-Builder, в който те бяха опаковани в орторомбична водна кутия (20 Å3), използвайки водния модел TIP3P съвместно с Na plus и Cl− йони, {{ 16}}.15 M за всеки от тях. След това оптимизираните моделирани структури бяха подложени на предварително равновесие за 10 ns. Лигандните структури бяха автоматично параметризирани по време на етапа на подготовка на структурата съгласно OPLSForce-Field. Протеини, съдържащи метал, като ММР, които включват комплекс хистидин-Zn плюс 2 в ефективното място, трябва да бъдат параметризирани по време на етапа на образуване на протеин. За да продължим, трябва да се създаде хетеро състояние за хетеро атоми като Zn (генериране на хетеро състояния). Тази функция е част от съветника за образуване на протеини на маестрото. Тази стъпка ще улесни развитието на правилно хетеро състояние или координирано ковалентно състояние за хетероатома (т.е. Zn плюс 2) в мрежа с протеина, така че силовите полета като OPLS да могат бързо да наблюдават цинковия атом. За репродукции, извършени от софтуера Molecular Dynamics в наномащаб (NAMD 3.0) [12], топологиите и параметрите на моделираните структури бяха определени от онлайн платформата Ligand Reader and Modeler. Бяха използвани хармонични Tcl сили, за да задържат Zn плюс 2 на място.

Изчисляването на свободната енергия на свързване (∆Gbinding) се извършва, както е описано по-рано от Alhadrami et al. 2021 г. [6]. ∆ Смилането беше извършено с помощта на процедурата за смущения на свободната енергия (FEP) [12], която е описана подробно в публикацията на Kim et al. С две думи, тази техника изчислява необходимата достъпна енергия ∆Gbinding с помощта на уравнението ∆Gbinding=∆GComplex − ∆GLigand. Стойността на всяко ∆Grinding се изчислява с помощта на програмата NAMD в отделни експерименти.

Всички входни файлове могат да бъдат подготвени чрез уебсайта CharmmGUI. След това файловете бяха използвани за създаване на планираните изчисления на ∆Gbinding, използвайки протокола FEP в NAMD. Равновесието по-късно беше зададено в NPT (300 K, 1 atm, Langevin-Piston-Pressure "Complex"-"Ligand") при съществуването на водния модел TIP3P. По-късно бяха произведени 10 ns FEP симулации за всяка структура и последните 5 ns от наличните енергийни количества бяха изчислени за готовите скорости на свободната енергия [12]. В крайна сметка обвързващите пози бяха предвидени и оценени чрез използване на програмата VMD [13].

2.7. In vitro анализ на хиалуронидазна активност

Инхибиторната активност на хиалуронидаза се формира съгласно по-рано установената процедура, предоставена на Chaiyana et al. 2019 г. [14]. Инхибиторният ефект спрямо активността на хиалуронидазата се оценява от следното уравнение: инхибиране на хиалуронидаза (процент)=(1 − A/B) × 100, където A и B са характеристиките на хиалуроновата киселина след лечение при наличие или липса на пробата, отделно. Като положителна контрола се прилага 6-О-палмитоил-ласкорбинова киселина. Експериментът е направен в три екземпляра.

2.8. In vitro анализ на активността на ксантин оксидазата

Инхибиторният потенциал на ксантин оксидаза (XO) се провежда съгласно описания по-горе метод [15]. Цветът, получен поради отделянето на водороден пероксид по време на процеса на окисление на XO, беше измерен при 570 nm с помощта на четеца на плаки EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". Четиридесет и четири микролитра ксантин оксидазен буфер се смесват с 2 µL разтвор на ксантин субстрат и 2 µL XO. L-мимозин се прилага като положителна контрола. Този експеримент беше проведен в три екземпляра.

2.9. In vitro анализ на тирозиназната активност

Инхибиторната активност на тирозиназата на всеки флавоноид се наблюдава при използване на DOPAchrome процеса, съответстващ на схемата на Momtaz et al. 2008 [16], който е модифициран от Nerya et al. 2003 [17] и Curto et al. 1999 г. [18]. Инхибиторната активност на тирозиназата се измерва от следното уравнение: инхибиторна активност (проценти)=(1 − A/B) × 100, (9) където A и B са абсорбцията на сместа в присъствието или отсъствието на тест флавоноид, респ. Всеки експеримент беше направен в три екземпляра.

3. Резултати и дискусия

3.1. Фитохимично изследване на семена от C. reticulata

Използвайки UV, 1H и DEPT-Q NMR, освен сравнение с литературата и използване на някои автентични проби, известните съединения кемпферол 1 [19], кемпферол-40 -O- -Dглюкопиранозид 2 [19], кемпферол -7-O- -D-глюкопиранозид 3 [19], 2-хидрокси генистеин 4 [19], хесперетин 5 [19], 3000 (1000-O- - D-глюкопиранозил)-захароза 6 [20], 6(1000 -O- -Dфруктофуранози)-30 (1"-O- -D-глюкопиранозил)-захароза 7 [20 ], 1-О-елаидоил-глицерол 8 [21], 1- О-олеоил-2-палмитоил-глицерол 9 [22], 1-О-олеоил-глицерол 10 [ 21], (E)-3-((4-метил хептилокси) карбонил)акрилова киселина 11 [23], (E)-3-((6-метил нонилокси) карбонил)акрилова киселина 12 [23] и -ситостерол 13 [24] (Фигура 1) са идентифицирани от суровия етанолов екстракт от семена на C. reticulata Всички идентифицирани съединения 11 и 12 са отделени тук за първи път от рода Citrus ( Фигури 1 и S1–S28).Заслужава да се отбележи, че за разлика от широко разпространените флаванони и флавони в надземните части на C. reticulata, включително плодовете, флавонолите изглежда са преобладаващият тип флавоноиди в семената.

3.2. Разследване в Силико

За да характеризираме биологичната активност на изолираните съединения, ние ги подложихме на серия от in-silico базирани анализи. Първо, ние се съсредоточихме върху изолираните флавоноиди (1–5) за нашия първоначален етап на виртуален скрининг, тъй като флавоноидите са добре известни биоактивни растителни вторични метаболити. В допълнение, останалите изолирани съединения (6-13) са често срещани първични метаболити, които вероятно нямат терапевтична ефикасност.

Структурите на флавоноиди 1–5 бяха подложени на базиран на докинг виртуален скрининг срещу почти всички протеини, хоствани в PDB. Онлайн платформата, а именно idTarget, беше използвана за тази предварителна задача за виртуален скрининг [8]. Възстановените резултати бяха извлечени като списък от най-голямата отрицателна стойност до най-малката. Поставихме убедителен резултат за афинитет от -10 kcal/mol като гранична стойност, за да откроим добрите цели за всеки изолиран флавоноид (1–5). Установено е, че няколко интересни молекулярни цели са вероятно добри цели за тези свързани съединения, включително протеин кинази и синтази (Таблица 1).

Интересното е, че са докладвани три общи молекулярни мишени между тези ензими флавоноиди, хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа. Тези ензими са свързани с поддържането на здрава кожа [25–30] и следователно стъпката на предварителния виртуален скрининг предполагаемо идентифицира тези флавоноиди като вероятни агенти, насърчаващи грижата за кожата.

3.3. Симулация на молекулярна динамика и изчисляване на свободна енергия на абсолютно свързване

За по-нататъшна подкрепа на предварителния етап на скрининг, базиран на докинг, ние оценихме абсолютните свободни енергии на свързване (∆G свързване) на съединения 1–5 с хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа ензими, използвайки MDS-зависимия метод, а именно метода на смущение на свободната енергия ( FEP) [26,31].

Както е показано в таблица 2, само съединения 2, 3 и 5 успяха да постигнат най-висок афинитет към хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа ензими със стойности на ∆смилане, вариращи от -8,1 до -9,9 kcal/mol. Останалите съединения имат стойности на ∆G свързване по-високи от -6 kcal/mol.

Допълнителни 50 ns MDS експерименти бяха проведени за изследване на взаимодействията и стабилността на свързване на съединения 2, 3 и 5 с хиалуронидаза, ксантин оксидаза и тирозиназа ензими. Както е изобразено на Фигура 2, както съединение 3, така и съкристализираният лиганд постигат подобна стабилност на свързване вътре в мястото на свързване на ензима през цялата MDS с RMSD от ~2,8 Å от първоначалните докинг пози. RMSD на съединение 2 0 също бяха подобни на тези на съединение 3 до 28,7 ns, когато то започва да се отклонява малко по-високо от съединение 3 и съкристализирания лиганд, за да се постигне средно RMSD от 3,8 Å в целия MDS. Последната моментна снимка, получена от MDS на съединения 2 и 3 и кокристализирания лиганд, показва, че TYR-75, ASP-129 и GLU-131 са обичайните взаимодействащи аминокиселинни остатъци чрез H- залепване.

По отношение на ксантин оксидазата, съединение 3 постигна стабилно свързване вътре в активното си място по време на MDS, записвайки средно RMSD от 2,6 Å, което е сходно с това на ко-кристализирания инхибитор (RMSD ~2,4 Å). Такова стабилно свързване на съединение 3 очевидно се дължи на мрежата от Н-връзки, която то установява с LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 и THR-1010 (Фигура 3).

Накрая, съединение 5 също беше стабилно вътре в активното място на тирозиназата през 50 ns MDS със средна RMSD стойност от 4, 9 Å, което беше по-високо от това на ко-кристализирания инхибитор (RMSD ~ 3, 8 Å). Както е показано в последната моментна снимка, получена от MDS, съединение 5 успя да взаимодейства с двата Zn2 плюс йона подобно на кокристализирания инхибитор. В допълнение, той беше стабилизиран с няколко Н-връзки с LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 и THR-391 (Фигура 4 ).

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】