Мета-анализът на резултатите от количественото определяне на NAD(P)(H) показва вариабилност в тъканите на бозайници
Jun 01, 2023
Никотинамид аденин динуклеотид (NAD плюс) играе важна роля в енергийния метаболизъм и сигналните пътища, контролиращи важни клетъчни функции. Theповишен интерес към NAD плюс метаболизъмиNAD плюс -усилващи терапиизасили необходимостта от точно NAD плюс количествено определяне. За да изследваме публикуваните NAD (P) (H) мерки в тъканите на бозайници, ние извършихме aмета-анализ на съществуващите данни. Търсене в базата данни на Ovid MEDLINE идентифицира статии с резултати от количествено определяне на NAD(P)(H), получени от тъкани на бозайници, публикувани между 1961 и 2021 г. Проверихме 4890 записа и извлякохме количествени данни, както иметоди за количествено определяне, преданалитичните условия и характеристиките на обекта. Извлечените физиологични концентрации на NAD(P)(H) вразлични тъканиот мишки, плъхове и хора, разкрива важна променливост между и в рамките на метода, която се простира до последните публикации. Това подчертава сравнително слабия потенциал за кръстосани експериментални анализи за NAD(P)(H) количествени данни и значението на стандартизацията за NAD(P)(H) методите за количествено определяне ипреданалитични процедуриза бъдещи предклинични иклинични изследвания.
Щракнете тук, за да получите антиокислителни свойства на Cistanche и продукти против стареене
Никотинамид аденин динуклеотидът играе двойна роля като aредукция-окисление (редокс)коензим, в неговия окислен (NAD(P) плюс ) иредуцирани (NAD(P)H) форми, и като aкосубстрат (NAD(P) плюс ) за ензими, участващи в деацилирането1, моно- и поли-ADP-рибозилиране 2,3 и създаването на базирани на аденин вторични носители 4–7. Съотношението NAD(P) плюс /NAD(P)H е важен индикатор за вътреклетъчното редокс състояние и играе критична роля в регулирането на ключови метаболитни пътища8,9. Например, NAD плюс е от съществено значение за гликолизата, заедно с цикъла на трикарбоксилната киселина (TCA), за осигуряване на редуциращи еквиваленти по време на генерирането на аденозин трифосфат (ATP), основният източник на енергия за клетката8,9. Когато NAD плюс е ограничен, той може също да се регенерира от NADH чрез ферментация на пируват за производство на лактат в клетките на бозайниците, като по този начин се поддържа клетъчният редокс баланс25. NAD плюс и NADH могат също да бъдат фосфорилирани до NADP и NADPH, съответно, от NAD плюс кинази (NADKs)10,11. NADPH е от съществено значение за редуктивната биосинтеза, сигналната трансдукция, клетъчните антиоксидантни реакции и по-специално редукция на глутатион12-14. В цитозола NADP плюс се редуцира до NADPH от глюкозо-6-фосфат дехидрогеназата и 6-фосфоглюконат дехидрогеназата на пентозофосфатния път (PPP), наред с други реакции13. Докато в митохондриите производството на NADPH се поддържа от различни реакции, включително тези, които зависят от ензимната активност на никотинамид нуклеотид трансхидрогеназа (NNT) и изоцитрат дехидрогеназа (IDH2)15. В резултат на това е доказано, че статусът на NAD (P) (H) засяга клетъчното сигнализиране и метаболизма, енергийната хомеостаза, митохондриалната биогенеза, реакциите на оксидативен стрес и поддържането и възстановяването на ДНК 16–18. Освен това, тъй като прогресирането на заболявания, свързани с възрастта, като затлъстяване19, неалкохолно мастно чернодробно заболяване20,21, невродегенерация22, митохондриални23 и сърдечно-съдови24 заболявания и мускулна атрофия или дистрофия25, е свързано с промени в свързаните с NAD плюс метаболити, подходите насочени към поддържане на NAD плюс хомеостаза, в момента се изследват.
Отвъд обичайните редокс преходи, NADP плюс може да се консумира чрез обмен на неговата никотинамидна група с никотинова киселина в реакция, катализирана от cADPR синтази, като CD38, за образуване на втория посредник NAADP, който участва в мобилизирането на калций, секрецията на хормони и имунните клетки пролиферация6,7,26. NAD plus може също да се консумира, когато действа като ко-субстрат за образуване на никотинамид (NAM), който може да се използва като субстрат за регенериране на NAD plus чрез спасителния път на NAM. NAM може също да бъде метилиран, за да образува 1-метил NAM (meNAM), който може да бъде допълнително окислен до продуктите на разграждане N1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2py) и N1-метил-4-пиридон-3-карбоксамид (4py). В крайна сметка метилираните катаболити могат да бъдат изчистени от тялото чрез урината 27, 28. Пулът NAD plus може също да бъде намален чрез консумацията на NADP plus чрез реакция на базов обмен за образуването на втория посредник NAADP14. Поддържането на запаса от NAD plus, следователно, изисква биосинтеза по пътя на Preiss-Handler (започвайки с общата молекула на витамин B3 ниацин (NA; никотинова киселина)), пътя за биосинтеза de novo (започвайки с аминокиселината триптофан (Trp)) или регенерация от превръщането на NAM чрез спасителния път в NMN и след това в NAD плюс. И накрая, спасителният път е важен и за биосинтезата на NAD плюс от никотинамид рибозид (NR), алтернативна форма на витамин B3, открита в храните, след неговото фосфорилиране от никотинамид рибозид киназа до NMN и след това превръщане в NAD плюс чрез спасителния път .
Следователно разбирането на динамиката на NAD плюс метаболома стана от съществено значение и в крайна сметка изисква стриктно количествено определяне на метаболитите, за да се разбере по-добре връзката на NAD плюс метаболитите по време на нормалната физиология или с прогресирането на заболяването или здравословното стареене. Ясната картина на тези промени е от съществено значение за свързване на промените в NAD плюс метаболома с ензимни или редокс реакции надолу по веригата, които държат ключа към промените в тъканните фенотипове. Като се има предвид значителното количество докладвани по-рано количествени данни за NAD плюс метаболити при бозайници, включително нарастващ брой доклади при хора, от съществено значение и навреме е да се обобщят тези промени по време на здравето и заболяването. Многобройни проучвания са изследвали компонентите на NAD плюс метаболома при гризачи и хора при различни метаболитни състояния, възрасти и заболявания, но разчитат на различни методи за подготовка на проби или количествено определяне. Подготовката на пробите е важна за метаболитите, участващи в редокс реакции поради потенциално разграждане и взаимно превръщане при определени условия29,30. За количествено определяне се смята, че течната хроматография, съчетана с масспектрометрия (LC–MS) и магнитно-резонансна спектрометрия (MRS), са чувствителни и специфични методи31–33, докато анализите на ензимния цикъл са по-често срещаните. Количествените LC–MS методи изискват всеобхватно включване на качествени контроли за индивидуалните метаболити, които се измерват, и за цялостния матричен ефект на пробите, ефект, който обяснява различните масспектрометрични отговори за даден аналит, когато се измерва в различни разтвори. Без тези контроли LC–MS е в най-добрия случай полуколичествен. В това проучване ние идентифицирахме значителна променливост в мерките на NAD(P)(H) при проучвания върху гризачи и хора, подчертавайки необходимостта от подходящи методи за докладване и стандартизирана обработка на проби и аналитични протоколи. Като цяло, сравними набори от данни NAD (P) (H) в проучванията са необходими за смислена интерпретация на съществуващите и бъдещи данни в областта на NAD плюс биология.
Резултати
Мета-анализ на общи методи за количествено определяне, заедно с изследваните видове, пол и тъкани.
В исторически план ранните методи, използвани за количествено определяне на NAD(P)(H), разчитат на спектрофотометричните или флуорометрични свойства на тези метаболити 34, 35. Съвсем наскоро, методите за ензимен цикъл, съчетани със спектрофотометрично или флуорометрично откриване, се използват по-често за разграничаване на коензимните нива на NAD(P)(H)36–38. Нарастващата нужда от висока чувствителност и разделителна способност при количественото определяне на тези коензими, заедно с необходимостта от измерване на други свързани с NAD плюс метаболити, доведе до използването на високоефективна течна хроматография (HPLC) и LC-MS техники. От тези подходи LC-MS се превърна в предпочитания метод, тъй като масспектрометрията, комбинирана с течна хроматография, позволява специфична идентификация на елуираните съединения заедно с допълнителната полза за включване на NAD(P)(H) изотопни метаболити като вътрешно пиково качество контроли. Въпреки предимствата си пред класическите спектрофотометрични или флуорометрични анализи, HPLC и LC-MS остават скъпи и отнемат време, което обяснява защо анализите на ензимния цикъл продължават да съществуват в последните проучвания.
Използвайки систематичен подход, от 241 допустими проучвания (допълнителен материал 2), 205 проучвания, които включват количествен мета-анализ на концентрациите на NAD(P)(H) в мишки, плъхове и човешки тъкани, са избрани за допълнителен анализ. От тези проучвания 46,7 процента са използвали анализи на ензимен цикъл, от които са включвали колориметрично (40,9 процента) или флуорометрично (5,8 процента) откриване, докато 17,8 процента са използвали HPLC методи (в съчетание с UV или флуоресцентни детектори), а 13,2 процента са използвали LC-MS анализи ( Фиг. 1а). Повечето проучвания не включват подробно описание на процедурите за екстракция на метаболита. Въпреки това, често използваните екстракционни процедури се състоят или от екстракционни буфери със или без повърхностно активни вещества (Triton®, Tris, додецил триметил амониев бромид), или полярни органични разтворители като ацетонитрил, метанол, етанол или хлороформ. Предишни проучвания показват, че ензимното инактивиране и оптималните условия на рН и температура са ефективни при запазване на стабилността на различните NAD(P)(H) форми30,39,40. Когато бяха разкрити, пробите бяха обработени при условия на ниска температура и във включените изследвания не бяха споменати окислително-редукционни добавки. Редокс реакциите са ограничени от инактивирането на ензимите в пробите преди измерванията на метаболитите на NAD(P)(H), обикновено чрез утаяване с разтворители като етанол, метанол, ацетонитрил или перхлорна киселина (PCA). Въпреки това, използването на PCA е рядко поради киселинно-лабилния характер на редуцираните форми (т.е. NADH и NADPH), както и необходимостта от допълнителен етап на неутрализация. Освен това сред проучванията, отчитащи използването на PCA по време на екстракцията на метаболита (5,4 процента), 3,7 процента съобщават само за резултати от NAD(P) плюс или са използвали втори некиселинен метод за екстракция за правилно количествено определяне на NAD(P)H. Само 1,7 процента от проучванията съобщават за резултати от NADH, общ NAD(H) и/или NAD плюс /NADH, като се използва само екстракцията на PCA. Потенциалното отклонение от тези проучвания не може да бъде анализирано поради ограничените данни.
Сравнения на средните физиологични нива на NAD(P)(H) в тъкани за гризачи и хора.
За да помогнем при идентифицирането на очакваните средни физиологични нива на NAD(P)(H) за най-често изследваните тъкани на мишки, плъхове и хора, ние събрахме данни от всички контролни и диви кохорти от всяко от включените проучвания (допълнителен материал 2 ). По-конкретно, ние записахме средните нива на NAD(P)(H), нормализирани спрямо теглото на тъканта или, в случай на кръв, обема. Данните от проучвания, които нормализират нивата на метаболитите до съдържанието на протеини, бяха включени в нашия компилиран набор от данни (допълнителен материал 2), но не бяха използвани за допълнителен анализ предвид малкия брой докладвани резултати. Освен това, когато е възможно, изчислихме съотношенията NAD(P) плюс /NAD(P)H, като отражение на редокс състоянието, както и общите нива на NAD(P)(H) (NAD(P) плюс плюс NAD (P)(H)), които са общи изходи за докладване за корекции на NAD(P)(H). Извлечените данни включват също вид, щамове, възраст, пол, метод за количествено определяне, диета и график на хранене, тип проба, метод за събиране на пробата и време на прибиране на реколтата (преди или след смъртта).
Мета-анализът на данните за NAD(H) идентифицира средните физиологични концентрации за NAD плюс и NADH в миши (фиг. 2a,b, допълнителна фигура 1a,b) и плъхове (допълнителна фигура 2a,b) тъкани от животни по-млади от 14 месеца за мишки и 18 месеца за плъхове. Извлеченият диапазон от физиологични стойности на съотношението NAD плюс /NADH и общи нива на NAD (H) (NAD плюс плюс NADH) бяха начертани за мишки (Фиг. 2c, d) и плъхове (Допълнителна фигура 2c, d). За разлика от проучванията с мишки, повечето от докладваните данни за плъхове не включват възрастта на животните; ние обаче избрахме да включим тези данни, при условие че проучването не класифицира техните кохорти като възрастни. От най-известните проучени тъкани, този мета-анализ показва, че средното ниво на NAD плюс за черния дроб (596 nmol/g, n=26) е по-високо от всички други тъкани при мишки, докато изненадващо скелетните мускули (162,8 nmol /g, n=9) показва една от най-ниските средни стойности на грам тъкан (фиг. 2а). Тези резултати могат или да означават намалена ефективност при екстракцията на NAD плюс метаболит, поради силно влакнестия характер на мускулите, или че има важни разлики в метаболизма на мускул NAD плюс в сравнение с други силно метаболитни тъкани, като черния дроб и бъбреците.
Въпреки малкото количествени изследвания на стареенето, нивата на NAD плюс от възрастни мишки са средно намалени в черния дроб, мускулите и пигментния епител на ретината (RPE), в сравнение с техните млади кохорти и в сравнение със средната стойност на всички проучвания, проведени с по-млади мишки на възраст над 14 месеца (допълнителна фигура 3). Мета-анализ на NADH и съотношението NAD плюс /NADH при възрастни животни не беше възможен, като се има предвид, че само едно от тези количествени изследвания извърши тези измервания.
Тези данни показват липсата на количествени данни за NAD(H) при стареещи животни.
За данните, извлечени от проучвания, използващи здрави хора, възрастовите диапазони варират значително в различните проучвания (от 15 до 92,3 години) и в повечето случаи данните не са стратифицирани в тези възрасти. Най-често измерваните човешки тъкани включват скелетни мускули и компоненти на кръвта, поради техния по-малко инвазивен характер на събиране (фиг. 3a-d). Резултатите от други човешки тъкани (n= 1–2) са показани на допълнителна фигура 4. Този анализ показва средна NAD плюс концентрация от 44,62 nmol/ml (n=23) в цяла кръв, с подобни Докладвани концентрации на NAD плюс за червени кръвни клетки при 46,96 nmol/ml (n=7) (Фиг. 3a; Допълнителна таблица 1). Въпреки това нивата на NAD плюс в кръвната плазма са значително по-ниски с медиана от 0.37 nmol/ml (n=8) (Фигура 3а). Средните нива на NAD плюс, открити в скелетните мускули на хора, са 191,9 (n=4) nmol/g в мокри мускулни препарати спрямо 1713 (n=3) nmol/g в лиофилизирани препарати, ниска температура процес на дехидратация, който вероятно концентрира метаболити (фиг. 3а). В по-често изследваните тъкани за измервания на NADH средните нива в човешки червени кръвни клетки, плазма и лиофилизирани скелетни мускули са 1,75 nmol/ml (n =7), 0.39 nmol/ml (n=8) и съответно 136,8 nmol/g (n=6) (фиг. 3b). Съответните средни съотношения NAD плюс /NADH са 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) и 12,7 (n=3) (Фиг. 3c). Интересно е, че средното съотношение NAD плюс /NADH за червени кръвни клетки (23,65) и лиофилизирани скелетни мускули (12,7) (Фиг. 3c) е няколко пъти по-високо от повечето тъкани на мишки и плъхове (Фигура 2c и Допълнителна фигура 2c) , което показва силно окислително редокс състояние с изобилие от наличен NAD плюс в тези човешки тъкани. В случай на мускулна тъкан, това може да има последици при разглеждане на потенциала за транслация на проучвания върху гризачи, които са идентифицирали ползите от повишаване на нивата на NAD плюс в мускулите. Въпреки това, повишеното съотношение NAD плюс /NADH в мускулите може също да бъде резултат от забавени процедури за замразяване на пробата в клинична среда, което може да доведе до нефизиологични промени в редокс статуса на пробата.
Физиологичните нива на NADP(H) в тъканите на гризачи бяха събрани, като най-често срещаното измерване беше в черния дроб. Черният дроб на мишка показва средна стойност от 124,2 nmol/g NADP плюс (n=13) и 140.2 nmol/g NADPH (n=4) (Фиг. 4a,b ), докато черният дроб на плъх показва медиана от 95,11 nmol/g NADP плюс (n=10) и 240,7 nmol/g NADPH (n=9) (допълнителна фигура 5a, b). Средното съотношение NADP плюс /NADPH, получено от проучвания, които измерват и двата метаболита, е по-ниско от 1 в повечето тъкани на мишки и плъхове (фиг. 4c, допълнителна фигура 5c). Средните общи нива на NADP(H) (NADP плюс плюс NADPH) в черния дроб на мишка и плъх са 244,4 (n=3) (Фиг. 4d) и 342,1 (n=9) (Допълнителна фигура 5d) , съответно. При хора най-честите измервания на NADP(H) са извършени в червени кръвни клетки, показващи медиана от 33,2 nmol/ml за NADP плюс (n=14) и 22,4 nmol/ml за NADPH (n{{30} }) от несъвпадащи проучвания, със средно съотношение NADP плюс /NADPH от 1,27 и средно общо NADP(H) от 52,0 nmol/ml от проучвания, които измерват и двата метаболита (n=11) (фиг. 4e– з). Като цяло количеството налични данни за NADP(H) е оскъдно при всички видове, което води до по-ниска увереност в средните стойности за всяка тъкан.
Анализ на отклонението и променливостта в методите за количествено определяне на NAD(P)(H).
Като се има предвид, че по-голямата част от проучванията, включени в този мета-анализ, изследват нивата на NAD плюс в проби от черен дроб на гризачи (фиг. 1c,e), ние използвахме физиологичните нива на NAD плюс на черния дроб на мишки и плъхове, за да идентифицираме всяко потенциално отклонение в резултатите, което съответства на към метода на количествено определяне (фиг. 5a,b). Средната възраст на мишките, включени в този анализ, е 17,9 седмици (диапазон: 2–55 седмици), като 6 проучвания не разкриват възрастта на животните. За плъхове повечето проучвания не разкриват възрастта на животните, с изключение на три, които варират от 2 дни до 8 месеца. Нито едно от проучванията не съобщава за използване на стари животни. В черния дроб на мишка големият диапазон на докладваните концентрации за NAD плюс обхваща от 1,8 до 1132 nmol/g черен дроб със средна стойност от 596.0 (n=26) (Фиг. 5a) , докато концентрациите на NADH варират от 0.9 до 109 nmol/g тъкан със средна стойност от 66.43 (n=6) (допълнителна фигура 6а). Важно е, че коефициент на вариация от 52,5 процента и 76,5 процента бяха изчислени за средните физиологични резултати от NAD плюс и NADH в черния дроб на мишка, съответно, измерени чрез множество методи за количествено определяне, показващи степента на променливостта в проучванията. Както се прогнозира от тези резултати, средното съотношение NAD плюс /NADH в черния дроб на мишка (3,41 плюс /- 3,16 SD, n=19) демонстрира еднакво голям диапазон на променливост с CV от 92,7 процента (допълнителна фигура 6c) . Подобна вариабилност в мерките за NAD плюс и NADH също се наблюдава в черния дроб на плъх (CV=42.6 процента за NAD плюс и CV=44.4 процента за NADH). Съответните концентрации за NAD плюс и NADH в черния дроб на плъх варират съответно от 159 до 796 (n=16) и 65 до 265 (n=12) nmol/g (фиг. 5b, допълнителна фигура 6b). ), докато съотношенията NAD плюс /NADH показват CV от 50.1 процента (средно: 3.219 плюс /- 1.612 SD, n=23) (допълнителна фигура 6d). Средните стойности и стандартните отклонения за NAD плюс, NADH, общия NAD(H) и данните за съотношението NAD плюс /NADH в черен дроб на мишка и плъх, групирани по метод на количествено определяне, са показани в допълнителна таблица 2. Относно нивата на NADP(H) и съотношението NADP плюс / NADPH, подобна вариабилност се наблюдава в чернодробните тъкани. Нивата на NADP плюс варират от 50.4 до 247.4 nmol/g тъкан за мишки (допълнителна фигура 8a) и от 45.7 до 171 nmol/g тъкан за плъхове (допълнителна фигура 8b), докато нивата на NADPH варира от 28 до 236,9 nmol/g тъкан за мишки (допълнителна фигура 8c) и от 90 до 409 nmol/g тъкан за плъхове (допълнителна фигура 8d). И накрая, съотношението NADP плюс /NADPH варира от 0.12 до 0.55 в черния дроб на мишка (допълнителна фигура 8e) и от 0.12 до 1.44 в черния дроб на плъх (допълнителна фигура 8f).
в най-големия диапазон от резултати (1,8 до 1132,3 nmol/g). Дори най-новите изследвани LC-MS изследвания илюстрират обхвата на тези стойности на NAD плюс, включително стойности от 1,8 nmol/g41 и 33,8 nmol/g42 и много по-високи стойности от 946,3 nmol/g43 и 1132,3 nmol/g44. В допълнение, големият диапазон от стойности на LC-MS NAD плюс изглежда не корелира с проучвания, които изключват маркирани с изотопи вътрешни стандарти (фиг. 5а), метод, използван за подобряване на идентифицирането на метаболита и точността на количествената стойност . Въпреки това, двете идентифицирани LC-MS проучвания, които разчитаха единствено на външна стандартна крива за NAD плюс количествено определяне, вместо да включват вътрешен контрол, бяха средно по-ниски от средните за всички мерки (фиг. 5а). Освен това, проучванията, използващи нормализация на вътрешни стандарти, използват различни видове вътрешни стандарти, като включването на единичен белязан референтен метаболит45,46 или белязани метаболитни екстракти от дрожди43,44 или клетъчни култури41. Интересното е, че тези проучвания, които използват стандарти, получени от екстракти от дрожди или клетъчни култури, осигуряват или най-високите, или най-ниските измервания, получени от LC-MS, за чернодробни NAD плюс нива. Това потенциално подчертава как клетъчните екстракти от богати на изотопи стандарти могат да допринесат за променливостта в измерванията на NAD плюс, тъй като матричният ефект на добавената стандартна мая или клетъчен екстракт може да попречи на ефективността на йонизация и следователно на измерените концентрации на целевите метаболити.
Ограниченията на този анализ на пристрастията и променливостта на количественото определяне включват потенциални разлики в околната среда, генетичен произход, жертва, пол и възраст. Всички данни за този анализ идват от животни на диета с храна, но може да се различават по вид. При жертвоприношението се съобщава за разлики в нахраненото или гладно състояние на животното и времето от деня за жертвоприношението. Освен това, въпреки че повечето изследвания върху мишки са извършени на фон C57BL/6, имаше по-голям диапазон от фонове, използвани за плъхове в проучванията (Wistar: 38 процента, Albino Wistar: 25 процента и 6 процента за Hooded Wistar, Sprague–Dawley, плъхове Holtzman, ACI, Long-Evans и Zucker). В проучванията върху черния дроб на мишки няма статистически разлики между мъжките и женските стойности за NAD плюс, NADH или общи нива на NAD(H) или за съотношението NAD плюс /NADH (допълнителна фигура 7). Не можем обаче да направим заключения поради ограничения брой женски кохорти.
Питай за още:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950
