МикроРНК при бъбречно развитие и заболяване Ⅱ

Развитие на бъбреците

Theбъбрек на бозайник(или метанефрос) е жизненоважен орган, който играе критична роля вотделяне на метаболитни отпадъци,регулиране на обема на извънклетъчната течност, иподдържане на електролитикиселинно-алкална хомеостаза. Освен това бъбреците произвеждат важни хормони, като напреритропоетин, калцитриол,ренин, ипростагландини(48). Функционалният капацитет на бъбрека корелира с броя на функциониращите нефрони, които се образуват по време на развитието на бъбреците преди раждането, наричани още нефронови дарения. Всеки човешки бъбрек съдържа средно 1,000,000 нефрона, въпреки че този брой варира значително, като оценките варират от 200,000 до 2,000,{{8 }} нефрони (49, 50). сстареене,загуба на функционален нефронов резерввъзниква с течение на времето (51, 52); следователно ниската нефронова надареност при раждането е свързана с повишен риск от развитие на хипертония и хронично бъбречно заболяване (CKD) по-късно в живота (53–55). Нещо повече, CAKUT, което води до намалено снабдяване с нефрони и функция на нефрони, е водещата причина за бъбречна недостатъчност при деца, което води до значителна заболеваемост и смъртност, свързани с трансплантация и диализа (56, 57). По този начин, по-доброто разбиране на клетъчните и молекулярните механизми, лежащи в основата на установяването на броя на нефроните и нормалното образуване на нефрони, дава представа за нови пътища за прогнозиране, предотвратяване и лечение на детска бъбречна болест.

КОЛКО ВРЕМЕ НЕОБХОДИМО ЗА ДЕЙСТВАНЕ НА CISTANCHE ПРИ ПАЦИЕНТИ С БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ?

Развитие на метанефричен бъбрекзапочва около 10.5 ембрионален ден (E10.5) при мишки и около петата гестационна седмица при хора (58). В отговор на индуктивни сигнали от метанефричния мезенхим, уретерната пъпка се простира от каудалния край на Волфовия канал и нахлува в съседния мезенхим (Фигура 2). Едновременно с това морфогените, излъчвани от уретерната пъпка, индуцират кондензация на метанефричния мезенхим, за да образуват мезенхима на капачката (наричан също нефронни прогенитори) около върховете на уретерната пъпка. С напредването на нефрогенезата уретерната пъпка претърпява последователни кръгове на разклоняване, удължаване и диференциация, за да генерира събирателните каналчета на бъбрека. Субпопулация от нефронни прогенитори претърпява мезенхимно-епителен преход за образуване на бъбречни везикули, които след поляризация и удължаване се превръщат в телесни структури с форма на запетая и S. Накрая, дисталната част на S-образното тяло се слива със събирателния канал, за да образува функционален нефрон (59-61). S-образното тяло претърпява по-нататъшна диференциация, за да образува зрелите типове клетки на нефрона, с изключение на събирателния канал. Foxd1+ стромалните прогениторни клетки са в съседство с нефронните прогениторни клетки във външната кортикална или нефрогенна зона на развиващия се бъбрек (Фигура 2) (62). Смята се, че сигналите от кортикалната строма инхибират експанзията на нефронните прогениторни клетки и стимулират диференциацията им, тъй като аблацията на бъбречната строма води до нарушена диференциация на нефронните прогениторни клетки (63). Прогениторните клетки на Foxd1+ пораждат всички стромални клетки в метанефричния бъбрек, включително бъбречни кортикални и медуларни интерстициални клетки, перицити, периваскуларни фибробласти, мезангиални клетки и съдови гладкомускулни клетки (64, 65). Смущенията във всяка стъпка от този процес могат да доведат до CAKUT, основната причина за ХБН в детска възраст (66, 67).

Зрелият нефрон се състои от гломерул, който действа като филтрираща единица, и тубуларно задно сорбционно отделение, което е подразделено на проксимален извит тубул, бримка на Хенле, дистален извит тубул и събирателен канал (Фигура 2). Филтриращата бариера на гломерула (която се състои от фенестриран ендотел, гломерулна базална мембрана, израстъци на краката и прорези на диафрагмите на подоцитите) позволява филтрирането на плазмата и малките разтворени вещества, като същевременно селективно задържа протеини като албумин и имуноглобулини в кръвта (68, 69). Междувременно отделението за тубулна реабсорбция е отговорно за поддържането на водната хомеостаза, реабсорбцията на разтворени вещества (включително натрий, калий, калций, фосфор, магнезий, глюкоза и много други) и екскрецията на киселина и други отпадъци.

MiPHK в развиващия се бъбрек

В проучвания при условни трансгенни мишки, miRNAs се очертават като критични регулатори на бъбречната морфогенеза в множество клетъчни линии. Първоначалните проучвания, оценяващи функционалната роля на miPHK в развитието на бъбреците, използваха условна делеция на Dicer (70) в различни бъбречни линии. Известно е обаче, че Dicer има независими от miRNA роли (71), което усложнява интерпретацията на тези модели. Условната делеция на Dicer в ранните метанефрични мезенхими или нефронни прогенитори води до увеличена апоптоза на нефронни прогенитори, повишени нива на проапоптотичния протеин Bim и преждевременно спиране на нефрогенезата (72–75) (Таблица 1). Интересно е, че загубата на експресия на Bim в прогенитори на нефрон с дефицит на Dicer намалява апоптозата и частично възстановява образуването на нефрон. Две miPHK, експресирани в нефронни прогенитори, miR-17 и miR-106, бяха идентифицирани като супресори на BIM експресията (76). Заедно тези констатации показват, че miPHK контролират баланса между оцеляването и апоптозата в нефроновите прогенитори, за да осигурят образуването на правилен брой нефрони по време на нефрогенезата.

Фигура 2. Схематична илюстрация на етапите на развитие на метанефричния бъбрек. Сигналите от уретерната пъпка предизвикват кондензация на метанефричния мезенхим, за да се образува капачка от нефронни прогенитори (капачка мезенхим) около върховете на уретерната пъпка. Мезенхимът на капачката претърпява мезенхимално-епителен преход, за да образува бъбречни везикули, които се развиват последователно в тела с форма на запетая и S. Тези структури се свързват с дръжката на уретерната пъпка, която води до събирателния канал. Клетките в проксималната област на S-образното тяло се диференцират в специализирани епителни клетки на зрелите бъбречни телца (т.е. подоцити и клетки на капсулата на Боуман), докато клетките в средните и дисталните части се диференцират в тубулните сегменти на нефрона (проксималните тубули , бримките на Хенле и дисталните тубули). Създаден с BioRender.com.

Условната делеция на Dicer в линията на уретерната пъпка води до спектър от аномалии, които силно наподобяват CAKUT, включително бъбречна дисплазия и развитие на кисти на събирателния канал (73, 77, 78). Преждевременното прекъсване на разклонената морфогенеза (в отговор на намалената експресия на Wnt11 и c-Ret от уретерната пъпка) вероятно е основният фактор, допринасящ за бъбречна дисплазия (73). Началото на образуването на кисти настъпва около E15.5 и е свързано с дефекти в първичната дължина на ресничките, повишена апоптотична клетъчна смърт и прекомерна клетъчна пролиферация (73). Тъй като Dicer има важни независими от miPHK роли в клетката, условната делеция на Dgcr8 е използвана, за да потвърди, че фенотипите, наблюдавани при условни Dicer-нокаут модели, наистина са резултат от загуба на miPHK. Животни с делеция на Dgcr8 в дисталния нефрон и производни на събирателния канал развиват хидронефроза и кисти на събирателния канал (79), CAKUT-подобен фенотип, който наподобява загубата на активност на Dicer в линията на уретерната пъпка.

Проучвания от две независими групи показват, че аблация на Dicer от линията на бъбречната строма на Foxd1+ и нейните производни води до спектър от бъбречни аномалии, с последователни констатации относно хипопластични бъбреци, намален брой гломерули, абнормно гломерулно съзряване и дефектни съдови моделиране (80, 81). Въпреки че и двете групи описват до голяма степен съгласувани фенотипове, използвайки подобни миши модели, бяха отбелязани две различни разлики. Накагава и др. наблюдават липса на вътрешната медула и папила, както и намаляване на нефрогенната зона (80). За разлика от тях Phua et al. показват разширяване на популацията на нефронните прогенитори и запазена бъбречна папила (81). Накагава и др. предполага, че тези дефекти са свързани с прекъсването на сигнализирането на пътя на Wnt, което води до промени в миграцията и пролиферацията на стромалните клетки, поради понижена регулация на миРНК на стромалните клетки, miR-214, miR-199a{{7 }}p и miR-199a-3p (80). Проучването на Phua et al. предполагат, че промените в апоптотичните програми (включително увеличена експресия на Bim и p53 ефекторни гени) допринасят за фенотипни дефекти (81). Възможно е разликите в генетичния фон и/или ефективността на Cre-медиираната рекомбинация да са отговорни за разликите, които тези изследвания описват. Независимо от това, описаните фенотипове са в съответствие с известните многостранни роли на бъбречната строма в развитието на бъбреците и механизмите, лежащи в основата на тези фенотипове, вероятно са сложни, като се има предвид естеството на делеция на Dicer. Необходими са допълнителни проучвания, изследващи специфични miPHK в различни стромални субпопулации, за да се дефинират по-добре действащите регулаторни механизми.

По-скорошна работа се занимава с въпроса за функцията на специфични miPHK както в развиващия се бъбрек, така и в нефронните предшественици. Използвайки модел на човешки ембрионални стволови клетки, Bantounas et al. показаха, че инхибирането на клъстера miR-199a~214 води до дисморфични гломерули, аберантни проксимални тубули, намалена експресия на WT1 и повишени интерстициални капиляри в подобни на бъбрек органоиди (82). Интересно е, че глобалното заличаване на чувствителни към хипоксия miR-210 води до специфичен за мъжа дефицит на нефрони (83). Например, условното заличаване на клъстера miR-17~92 в нефронови прогенитори и техните производни при мишки уврежда прогениторната клетъчна пролиферация и намалява броя на развиващите се нефрони. В резултат на това мутантните мишки развиват протеинурия, бъбречна фиброза и нарушена бъбречна функция (84). Дерегулираните нива на miR-17~92 целевия ген, CFTR, са замесени в дефектната пролиферация на прогениторни клетки и намалената наличност на нефрони в този миши модел (85).

Секвенирането на малка РНК (smRNA-Seq) все повече се използва за профилиране на модели на експресия на miRNA и за откриване на нови видове miRNA. smRNA-Seq на E15.5 нефрогенни мезенхимни клетки идентифицира 162 анотирани miPHK, които са диференциално експресирани в тази клетъчна популация в сравнение с цели бъбреци и 49 нови вида miRNA (86). Интересно е, че нивата на миРНК от семейството на miR-200 са значително намалени в прогениторите на нефрона. Като се има предвид, че членовете на семейството miR-200 са ключови регулатори на мезенхимно-епителния преход в събирателния канал (87), ние спекулираме, че тяхната експресия може да бъде строго регулирана, за да се осигури нормална епителна диференциация на нефронови прогенитори по време на развитието на бъбреците.

MiRNA функционира в зрелия нефрон

В допълнение към тяхното изискване по време на развитието на бъбреците, miPHK регулират множество биологични процеси в основните клетъчни линии, които образуват зрелия нефрон (69, 88–91). В съответствие с това е описана сегментно-специфична експресия на miPHK по протежение на нефрона, включително miR-143 и miR-195a в гломерула, miR-107 и miR{{7} }a в проксималния тубул, miR-193 и miR-378a в дебелия възходящ крайник, miR-874 и miR-155 в дисталния извит тубул и miR{{ 12}}c в събирателния канал (87). Освен това, функционалните изследвания в отделенията на зрелия нефрон поддържат различни роли за miPHK.

Мишките без Dicer или Drosha в подоцитите показват изразена протеинурия, гломерулосклероза и бърза прогресия до бъбречна недостатъчност, вследствие на разрушаване на гломерулната филтрационна бариера (90–93). Анализите in silico разкриват, че различни регулирани нагоре транскрипти в мутантни гломерули съдържат целеви последователности за miR-30 членове на семейството. Като всички четири члена на семейството miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d и miR-30c{ {9}}) обикновено са силно експресирани в подоцитите, тези miRNA могат да бъдат отговорни за аномалиите на подоцитите и разрушаването на гломерулната филтрационна бариера при мутантни мишки (91).

Донякъде изненадващо, делецията на Dicer от постнаталните проксимални тубули на бозайници не засяга развитието на бъбреците, хистологията или функцията, но предпазва от бъбречна исхемия/реперфузионно увреждане. Мутантните мишки показват по-добра бъбречна функция, намалено бъбречно увреждане, по-ниска тубулна апоптоза и подобрена преживяемост в сравнение с техните WT котила (94). Това вероятно отразява "сумата" на ефекта от делеция на множество miRNAs в проксималния тубул, тъй като друга работа оттогава показа, че експресията на специфични miRNAs е защитна при бъбречна исхемия/реперфузионно увреждане (напр. miR-16 и miR-21 препратки 95, 96); докато други са вредни (напр. miR-182; реф. 97).

Въпреки че miRNAs изглеждат незаменими за функцията на проксималните тубули, те са от съществено значение за дисталните нефрони и хомеостазата на събирателния канал (79, 88, 98). Събиране на специфично за канала инактивиране на Dicer и други критични гени, свързани с биогенезата на miRNA (включително Dgcr8, Ago1, 2, 3 и 4), причинява бъбречна недостатъчност при възрастни мишки поради прогресивна тубулоинтерстициална фиброза и интерстициално възпаление (88). Това е предшествано от частичен епителен-мезенхимален преход (EMT) на клетките на събирателния канал и регулиране надолу на членовете на семейството miR-200, които инхибират EMT (88). По същия начин, аблация на Dicer или Dgcr8 от дистален нефрон и производни на пъпката на уретера, съответно, води до бъбречни аномалии и бъбречна недостатъчност (78, 98), които в крайна сметка са свързани с регулиране надолу на miR-200 членове на семейството (98). Повишената експресия на miR-200 прицелен ген Pkd1 в тези мутантни мишки нарушава тубулогенезата и произвежда цистоподобни структури (98). Тези разлики в изискването за функционални miRNAs в проксималните тубули и дисталния нефрон/събирателен канал могат да се обяснят със сегментното разпределение на miRNAs по дължината на нефрона и събирателния канал в WT бъбреците (88).

Делецията на Dicer в ренин-секретиращи клетки в юкстагломеруларния апарат води до дефицит на юкстагломеруларни клетки, намалени циркулиращи нива на ренин с последващо понижение на артериалното кръвно налягане, намалена бъбречна функция, ивичеста интерстициална фиброза и съдови аномалии (89). Намаляването на юкстагломерулните клетки предполага изискване за зрели miPHK при поддържането на техния фенотип. По-късно miR-330 и miR-125b-5p бяха идентифицирани като потенциални кандидати, които или инхибират, или насърчават, съответно, гладкомускулния фенотип на юкстагломерулните клетки (99).

Други активни области на изследване на miPHK при остро бъбречно увреждане (8–10), поликистозна бъбречна болест (11) и бъбречна трансплантация (10) са разгледани изчерпателно в други скорошни прегледи.

MiPHK при педиатрични бъбречни заболявания В този раздел предоставяме общ преглед на ролята на miPHK при развитието на бъбречни заболявания, включително CAKUT и тумори на Wilms. CAKUT са сред най-честите форми на малформации при раждане, засягащи приблизително 3-7 от 1000 живородени (100). Нарушаването на развитието на бъбреците и долните пикочни пътища води до широк спектър от клинични прояви, наблюдавани при CAKUT, включително бъбречни аномалии (т.е. бъбречна агенезия, бъбречна хипоплазия и дисплазия и мултикистозни диспластични бъбреци), уретеропелвични аномалии (т.е. обструкция на уретеропелвичното съединение), дуплексна събирателна система и аномалии на пикочния мехур и уретрата (101–103). Тази фенотипна хетерогенност вероятно се дължи на сложни взаимодействия между генетични, епигенетични и/или пренатални фактори на околната среда, които засягат развитието на бъбреците и долните пикочни пътища, което води до CAKUT (101). Повечето от сегашните ни познания за патогенезата на CAKUT са възникнали от миши модели и синдромни форми на CAKUT. Тези проучвания са довели до идентифицирането на няколко гена CAKUT, много от които са замесени в ранното развитие на бъбреците, включително PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 и други (101, 104, 105). Въпреки това, единични мутации или варианти на брой копия в гени, кодиращи протеини, не обясняват повечето случаи на CAKUT (~80%) (101, 106).

Както бе споменато по-горе, изчерпването на зрели miPHK от различни клетъчни линии на развиващия се бъбрек в миши модели води до бъбречни аномалии, които имитират човешкия CAKUT (73, 74, 78, 79). В допълнение, заличаванията на зародишната линия на MIR17HG, който кодира клъстера miR-17~92, причиняват тип 2 синдром на Feingold при хора (107). Въпреки че бъбречният фенотип при пациенти със синдром на Feingold тип 2 с мутации на MIR17HG остава недефиниран, се съобщава за 18% честота на CAKUT при случаи на синдром на Feingold, свързани с мутации на MYCN (108, 109). Заедно тези наблюдения предполагат, че мутациите в miRNAs, експресирани по време на развитието на бъбреците, могат да причинят CAKUT при хора, особено тъй като много miPHKs са силно запазени между мишки и хора.

За да се тества тази хипотеза, едно проучване изследва 1248 пациенти с несиндромна CAKUT от 980 семейства и търси мутации в 96 области на стволови бримки на 73 бъбречни miPHK гени (106). В рамките на тази кохорта бяха идентифицирани 31 индивида със 17 различни единични нуклеотидни варианта, засягащи 16 различни miRNA гени. Сред тях два нови варианта в miPHK са открити като потенциално патогенни. MIR19B1 (член на клъстера miR-17~92) се свързва с наличието на дясна бъбречна агенезия, а MIR99A се свързва с тежък везикоуретерален рефлукс и бъбречна птоза. Този изненадващо нисък брой кандидат-патогенни варианти се дължи отчасти на ограниченията на това проучване, тъй като анализът отчита само мутации в miPHK гени, които са включени в подхода на кандидат-гена и не открива вариации в броя на копията и големи пренареждания на ДНК (106) .

При алтернативен подход, уретерни сегменти от пациенти с различни CAKUT бяха анализирани за диференциална експресия на транскрипт чрез микрочипове, за наличието на биоинформатично прогнозирани миРНК мишени и зрели миРНК чрез qPCR (110). С помощта на този многостранен подход бяха идентифицирани седем miPHK с потенциални роли в CAKUT и сред тях has-miR-144 беше значително увеличен при пациенти с CAKUT. Генният онтологичен анализ показа, че прогнозираните has-miR-144 целеви гени допринасят за биологични процеси, включени в развитието на CAKUT, включително развитие на тръбата (22 целеви гена), развитие на урогениталната система (18 целеви гена), развитие на бъбреците (14 целеви гена) и развитие на ембрионални органи (18 целеви гена) (110).

Необходими са допълнителни проучвания за определяне на молекулярните механизми, лежащи в основата на патогенните роли на miPHK в CAKUT. Констатациите от такива проучвания ще бъдат от решаващо значение за подобряване на грижите за пациенти с CAKUT и предотвратяване на прогресирането им до ХБН, осигуряване на подходящо генетично консултиране за пациенти и техните семейства и разработване на нови терапевтични стратегии.