МикроРНК при бъбречно развитие и заболяване Ⅲ

MiRNAs в тумор на Wilms

Тумор на Wilms,илинефробластом, е най-често срещаното детстворак на бъбреците, с честота 1 на 10,000 деца в Северна Америка (111). Това е предимно спорадично заболяване, въпреки че фамилните форми се срещат в приблизително 1%-2% от случаите (112, 113). Туморите на Wilms възникват от аберантна нефрогенеза, при която плурипотентните ембрионални бъбречни прекурсори не успяват да се диференцират и персистиратнеобичайно в постнаталния живот(111, 114, 115). Тези тумори хистологично приличатразвиващи се бъбрециснарушена морфология(116) и мутации в гени, участващи във феталната нефрогенеза, включително WT1 (117-119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) и TP53 (123, 124), са свързани с приблизително 40% от Тумори на Wilms (125). Скорошни проучвания, използващи секвениране на целия геном и целия екзом на тумори на Wilms, идентифицираха нови мутации в гени за риск от рак (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), гени, кодиращи протеини, които медиират хистонови модификации по време на нефрогенеза (BCOR, MAP3K4) (126 ) и miRNA-обработващи гени (121, 122, 128, 129).

КОЛКО ВРЕМЕ НЕОБХОДИМО ЗА ДЕЙСТВАНЕ НА CISTANCHE ПРИ ПАЦИЕНТИ С БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ?

Сред гените, обработващи miPHK, мутации в DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 и XPO5 (кодира експортин 5) са докладвани в нелекувани и лекувани с неоадювантна химиотерапия тумори на Wilms (Фигура 3) (121, 122, 128, 129). ). Около 33% от изследваните тумори на Wilms показват вредни мутации в гените на пътя за обработка на miRNA (128). Повтаряща се мутация на гореща точка (E1147K) в met al-свързващ (Mg2+) остатък на домейна на RNase IIIb на DROSHA, който изглежда е уникален за тумора на Wilms, премахва каталитичната активност на този домейн, което води до непълна разцепване на pri-miRNA и намалено съзряване на miPHK (128). Соматичните горещи точки, засягащи домейна на RNase IIIb на DICER1, нарушават обработката на 5p miRNAs (тези, получени от 5'-рамото на pre-miRNA фибичката) (129) и често се откриват като мутации на "втори удар", които действат в тандем с DICER1 мутации на зародишна линия за индуциране на туморогенеза на Wilms при синдром на DICER1 (разстройство, което повишава чувствителността към различни тумори) (130–132). Остава неясно защо нарушената функция на DICER1 в туморите на Wilms води до персистираща и аберантна нефрогенеза, за разлика от загубата на Dicer1 в миши нефронни прогенитори, което причинява повишена апоптоза и преждевременно спиране на нефрогенезата (72–75). Някои потенциални възможности включват, че активността на генната доза може да бъде от решаващо значение за определяне на клетъчното оцеляване или че мутациите в домейна на RNase IIIb могат да повлияят на специфичността на свързването на miRNA от DICER1.

Мутациите в гените, обработващи miPHK, са свързани с понижаване на регулацията на важни miPHK, включително членове на семействата miR-200 (121) и let-7 (Фигура 3) (121, 129). Нека -7 miPHKs и РНК-свързващият протеин Lin28 функционират съвместно, за да контролират времето на прекратяване на миша нефрогенеза, вероятно чрез регулиране на стимулиращия растежа ген Igf2 (133). Свръхекспресията на Lin28 по време на развитието на бъбреците причинява експанзия на нефрогенни прогенитори, чрез инхибиране на крайната им вълна на диференциация, която кулминира в неопластична трансформация, която силно напомня на човешкия тумор на Wilms (134). Повишен брой ДНК копия на LIN28B и загуба на ДНК копия на let-7a се наблюдават съответно в 25% и 46% от проби от човешки тумор на Wilms (126). В съответствие с тези наблюдения, мутациите на зародишната линия в човешкия DISL3L2 ген, който кодира екзорибонуклеаза, отговорна за разграждането на предварително обработените форми на let-7, причиняват синдром на Perlman и предразположение към тумор на Wilms (135, 136). Синдромът на Perlman е синдром на вроден свръхрастеж, характеризиращ се с макрозомия, полихидрамнион, лицева дисморфология, бъбречна дисплазия и нефробластоматоза (прекурсорна лезия за тумор на Wilms) (137). Сред бебетата със синдром на Perlman, които оцеляват след неонаталния период, 64% развиват тумор на Wilms (138). Интересно е, че пълни или частични делеции на DISL3L2 са открити в около 30% от изследваните спорадични тумори на Wilms (136).

Скорошно проучване засили значението на регулаторната мрежа на miRNA в етиологията на тумора на Wilms. Авторите установяват, че генът на плейоморфния аденом 1 (PLAG1) е един от най-последователно регулираните гени в туморите на Wilms с мутации в гени, обработващи miRNA (125). Ектопичната експресия на PLAG1 в развиващия се миши бъбрек причинява неоплазия, която е придружена от трансактивиране на неговия целеви ген, туморния онкоген на Wilms IGF2. miR-16 и miR-34, които се регулират надолу в туморите на Wilms, бяха идентифицирани като потенциални регулатори на експресията на PLAG1 (125). Таблица 2 обобщава други проучвания, които съобщават за аберантна експресия на специфични miPHK, свързани с етиологията на тумора на Wilms. Интересното е, че тези miPHK могат да функционират като онкогени (наречени oncomiRs) или туморни супресори в условията на развитие на тумор на Wilms, в зависимост от естеството на техните мишени.

MiRNA като потенциални биомаркери и терапевтични средства

Освен тяхното вътреклетъчно местоположение, miPHK също присъстват в значителни количества в биологични течности, включително кръв, плазма, урина, кърма и слюнка (139). Тези циркулиращи миРНК се намират опаковани в стареене в микрочастици (екзозоми, микровезикули и апоптотични тела) (140, 141), конюгирани с AGO (142) или нуклеофосмин 1 протеини (143) или заредени в HDL (144), което ги прави забележителни стабилен дори при неблагоприятни условия, като кипене, екстремни вариации в pH, продължително съхранение и множество цикли на замразяване-размразяване (145, 146). По този начин miPHK подписите в биологични течности могат да отразяват асоциации с физиологични или болестни състояния (147). Заедно тези характеристики правят циркулиращите miPHK привлекателни за използване като неинвазивни биомаркери за диагностика и прогноза на заболяването.

Циркулиращите миРНК могат да бъдат извлечени директно от нефракционирани биологични течности или препарати от извънклетъчни ларни везикули, като се използват налични в търговската мрежа комплекти за екстракция (148) или TRIzol (149). След изолиране miPHK могат да се съхраняват при –70 градуса и да останат стабилни до 1 година (148). Има няколко налични платформи за профилиране на miRNA, включително хибридизация на микрочипове, qPCR и следващо поколение секвениране (150). Microarray и qPCR са най-често използваните методологии за изследване на експресията на известни miRNA (151). И двата метода имат предимствата, че са лесни за използване, сравнително бързи от маркиране на РНК до генериране на данни и относително рентабилни (152). Въпреки това, те разчитат на наличието и точната анотация на miPHK последователности в базите данни за проектиране на сонда и праймер (150). Въпреки че е по-скъпо, секвенирането от следващо поколение позволява едновременно откриване както на известни, така и на нови видове miRNA и предлага висока чувствителност (153). Освен това разделителната способност на единичен нуклеотид на секвенирането от следващо поколение позволява идентифицирането на isomiRs, които са зрели изоформи на miRNA, които се различават от каноничните по дължина, последователност или и двете (154, 155), които променят специфичността на насочване на miRNA ( 156).

Различни проучвания са изследвали потенциала на циркулиращите миРНК като биомаркери за педиатрични бъбречни заболявания (157–160). Например, едно проучване идентифицира 14 miPHK, които са значително повишени в серума на пациенти с тумор на Wilms. Интересно е, че сигнатура, базирана на miR-100-5p и miR-130-3p експресия, може да разграничи тези пациенти от здрави контроли с точност, чувствителност и специфичност (159). Въпреки че констатациите от това проучване и много други проучвания предоставиха убедителна мотивация за изследване на потенциала на циркулиращите миРНК като биомаркери, няколко препятствия в тази област трябва да бъдат преодолени преди широкото клинично приложение. Първо, има относителна липса на консенсус между проучванията, вероятно поради липсата на стандартизирана методология за пречистване (161) и анализ на проби (напр. разлики в платформите за профилиране на miRNA, реф. 162, 163; или разлики в smRNA-Seq библиотеката методи за приготвяне, справка 164). Второ, е липсата на проучвания с голям размер на извадката и подробни изследвания на конкретнизаболявания.Друг важен аспект е, че влиянието на объркващи променливи като възраст, пол и външни фактори (напр. тютюн, алкохол и т.н.) върху профилите на miRNA не е напълно проучено (за задълбочен преглед, моля, вижте реф. 165).

От терапевтична страна няколко лекарства, базирани на miRNA, в момента са в клинични изпитвания, но все още не са получили одобрение от FDA (166, 167). Основните подходи за miPHK терапия включват възстановяване на нивата на miPHK с помощта на миРНК имитатори или инхибиране на специфични miRNAs с помощта на antagomiRs (168). Едно от предизвикателствата, свързани с разработването на терапевтични средства, базирани на miRNA, е идентифицирането на miRNA кандидати за всяко заболяване. Тъй като множество miRNAs са нерегулирани при всяко заболяване, трябва да се извърши внимателен анализ на проби от пациенти в комбинация с in vitro и in vivo анализи, които се отнасят до патофизиологичните механизми, засегнати от въпросните miRNAs, за да се стесни кандидат miPHKn за терапевтична интервенция (168, 169). Друго предизвикателство включва разработването на стратегии за подобряване на in vivo стабилността и специфичното за мястото доставяне на лекарства с минимална токсичност и нецелеви ефекти. Молекулите на РНК са химически нестабилни поради наличието на 2'-хидроксилна група върху пентозния пръстен. За да осигурят по-висока стабилност и защита от нуклеази, присъстващи в серума или ендоцитното отделение на клетките, биотехнологичните компании са генерирали РНК молекули с химически модификации (2′-O-метилова група, фосфоротиоат или заключени нуклеинови киселини) в техния гръбнак (166). Що се отнася до доставянето in vivo, технологиите включват базирани на липиди (напр. липидни наночастици и неутрални липозоми) и дендримери, конюгирани към насочваща част, сред много други стратегии. Основните предизвикателства, свързани със системите за доставяне на miPHK, са имунотоксичността и целево-специфичният афинитет към мястото на заболяването (170). Стратегиите за доставяне чрез различни методи на приложение (интраперитонеални, интравенозни и подкожни инжекции) или чрез използване на вектори, съдържащи специфични за бъбреците и индуцируеми промотори, са успешно използвани за селективно насочване към бъбреците и за избягване на потенциални неблагоприятни ефекти в други тъкани и органи (171, 172). ).

Таблица 2. Списък на miRNAs, променени в тумора на Wilms

Списък на miPHK, анализирани проби/образци, нива на miRNA, наблюдавани в тези проби/образци в сравнение с подходящи контроли, целеви ген, последствия от промените на miRNA и препратки. CAMKK2, калций/калмодулин-зависима протеин киназа киназа 2; CDC7, цикъл на клетъчно делене 7; CDH1, кадхерин 1; CREB1, cAMP-отговор елемент-свързващ протеин 1; EYA1, липсващи очи хомолог 1; E2F3, E2F транскрипционен фактор 3; FRS2, FGF рецепторен субстрат 2; Glut1, глюкозен транспортер 1; IGF1R, IGF1 рецептор; Jag1, назъбен1; MET, мезенхимно-епителен преход; MKNK1, MAPK-взаимодействаща серин/треонин киназа 1; PTEN, фосфатазен и тензинов хомолог; PUMA, p53-регулиран модулатор на апоптозата; р73, туморен протеин р73; SIX1, sineoculis homeobox хомолог 1; TGFBR1, TGF-рецептор 1; WT, тумор на Wilms.

Резюме

Имаше експлозия от информация относно биогенезата на miPHK, регулирането на експресията на miPHK и функцията на miPHK от първоначалното откриване на miPHK през 1993 г. (6, 7). Това е придружено от непрекъснато нарастващо разбиране за това как miPHK функционират както в нормалната физиология, така и в патофизиологията на много заболявания. Стана ясно, че дисрегулацията на експресията на miPHK нарушава ранното развитие на бъбреците и е замесена в патогенезата на развитието на бъбречни заболявания, като CAKUT и тумор на Wilms. С последните разработки в използването на miPHK като биомаркери и като нови лекарствени цели, прозренията за това как miPHK регулират развитието на бъбреците и заболяването са от решаващо значение за разбирането как те могат да бъдат използвани в нови диагностични и терапевтични подходи към тези заболявания. За да се реализират напълно тези усилия, бъдещите проучвания, идентифициращи функцията на специфични miPHK в развитието на бъбреците, са критични, в допълнение към технологиите за оптимизиране на насочването на малки олигонуклеотидни терапевтици към бъбреците

Благодарности

Лабораторията на JH се подкрепя от грантове от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания на NIH (R01DK125015 и R01DK102843). DMC беше подкрепен от наградата за кариерно развитие на мрежата за изследване на нефротичния синдром и постдокторантската стипендия на Консултативния изследователски съвет на Детската болница в Питсбърг. MT беше подкрепен от Лятната изследователска стажантска програма на Университета в Питсбърг (R25DK119180). Фигурите са създадени с BioRender.com. Адрес за кореспонденция до: Jacqueline Ho, Division of Nephrology, Department of Pediatrics, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, USA. Телефон: 412.692.9440; Имейл: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, et al. miRBase: от микроРНК последователности до функциониране. Nucleic Acids Res. 2019; 47 (d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. Повечето тРНК на бозайници са запазени мишени на микроРНК. Genome Res. 2009; 19 (1): 92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Малки заглушаващи РНК: разширяваща се вселена. Nat Rev Genet. 2009; 10 (2): 94–108.

4. Djuranovic S, et al. miRNA-медиирано генно заглушаване чрез транслационна репресия, последвано от мРНК деаденилиране и разпадане.

Наука. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Заглушаване на ген от микроРНК: принос на транслационна репресия и разпад на иРНК. Nat Rev Genet. 2011; 12 (2): 99–110. 6. Lee RC и др. Хетерохронният ген на C. elegans lin-4 кодира малки РНК с антисенс комплементарност към lin-14. клетка.