МикроРНК, получена от екзозома на млякото-2478, потиска меланогенезата чрез пътя Akt-GSK3

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

In-Seon Bae и Sang Hoon Kim

Резюме:Екзозомите участват в междуклетъчната комуникация чрез прехвърляне на молекули от донорни към реципиентни клетки. Екзозомите се намират в различни телесни течности, включително кръв, урина, цереброспинална течност и мляко. Млечните екзозоми съдържат много ендогенни микроРНК молекули. МикроРНК са малки некодиращи РНК и имат важна роля в биологичните процеси. Специфичните биологични функции на млечните екзозоми не са добре разбрани. В това проучване изследвахме ефектите отмлечни екзозомивърху производството на меланин в меланомните клетки и меланоцитите. Открихме товамлечните екзозоми намаляватсъдържание на меланин, активност на тирозиназа и експресия на гени, свързани с меланогенезата, в меланомни клетки и меланоцити. Говежди специфичен miR-2478 в екзозомите инхибира производството на меланин. Открихме, че Rap1a е директен целеви ген на miR-2478 в меланомни клетки и меланоцити. Свръхекспресията на MiR-2478 намалява експресията на Rap1a, което води до понижено регулиране на производството на меланин и експресия на гени, свързани с меланогенезата. Инхибирането на експресията на Rap1a намалявамеланогенезапрез сигналния път Akt-GSK3. Тези резултати подкрепят ролята на miR-2478, получена от млечни екзозоми като регулатор намеланогенезачрез директно насочване на Rap1a. Тези резултати показват, че млечните екзозоми могат да бъдат полезни козмецевтични съставки за подобряванеизбелване.

Ключови думи: меланогенеза;млечна екзозома; miR-2478; Rap1a

herba cistanchesе съставка, инхибираща меланина

1. Въведение

Cosmeceutical е сложна дума, съчетаваща козметика и фармацевтика и се отнася до козметика с функционални съставки, които имат медицински ефекти [1]. В миналото кожата беше подобрена чрез дерматологични процедури, но напоследък интересът към козмецевтичните продукти се засили поради желанието на потребителите да получат тези ефекти чрез козметика. Козметичната индустрия също показа повишен интерес през последните години към използването на нови козмецевтични съставки [ 2]. Функционалната козметика включва продукти, които подпомагат избелването на кожата, като предотвратяват отлагането на меланин върху кожата.

Меланинът, важен елемент, който определя цвета на кожата и косата, предпазва кожата от ултравиолетовите лъчи [3]. Въпреки това, прекомерното образуване на меланин причинява неравномерен тен на кожата, например петна и лунички [4]. Микрофталмичният транскрипционен фактор (MITF) е основен регулатор на развитието на меланоцитите. Тирозиназата (TYR) е най-важният ензим за синтеза на меланин. Процесът на синтез на меланин се индуцира от активиране на TYR чрез MITF, който е важен ензим, участващ в началния етап на процеса на синтез на меланин и използва L-формата на тирозин или DOPA като субстрат за образуване на меланин [5].

МикроРНК (miRs) са къси некодиращи РНК, които участват в много биологични процеси чрез контролиране на посттранскрипционната генна експресия [6]. Проучванията също така разкриха контрола върху биосинтезата на меланин от микроРНК. Например, съобщава се, че miR-143-5p е насочен към Tak1 гена и намалява експресията на MITF, като по този начин инхибира синтеза на меланин [7]. MiR-125b, отрицателен регулатор намеланогенезае доказано, че регулира гена за пигментация SH3BP4 [8], а miR-675 в екзозомите, секретирани от кератиноцитите, инхибирамеланогенезачрез насочване към MITF [9].

Екзозомите са мембранно ограничени везикули с размер 30–200 nm и съдържат ДНК, РНК и пептиди [10]. Вътрешните компоненти на екзозомите могат безопасно да предават информация на съседни или отдалечени клетки, без да се разграждат от ензими в биологични течности, като по този начин засягат микросредата около различни клетки [11].Млечни екзозомиса декстрацелуларни везикули, получени от мляко, които са стабилни в храносмилателните процеси при човека [12]. Екзозомите, извлечени от говеждо мляко, съдържат не само няколко протеини като казеин и лактоглобулин, но и микроРНК, които действат като товар [13–15]. Говеждото мляко съдържа микроРНК, свързани с имунната система, като miR-15b, miR-27b, miR-34a и miR-10. Тези микроРНК са особено изобилни в коластрата [16].

Някои изследвания показват, че компонентите на млякото инхибиратмеланогенезав меланоцитите; например протеини като -лактоглобулин и κ-казеин в млякото регулират меланогенезата [17,18]. Установено е, че супернатантата на Lactobacillus helveticus NS8-ферментирало мляко инхибира UV увреждането и хиперпигментацията на кожата [19]. Все още обаче няма доклад дали микроРНК в говеждото мляко участват в кожатаизбелване, въпреки че 79 микроРНК съществуват вмлечни екзозоми[13]. Следователно, в това проучване, ние изследвахме дали млечните екзозоми, съдържащи микроРНК, инхибират синтеза на меланин в миши и човешки меланомни клетки и меланоцити.

2. Материали и методи

2.1. Клетъчна култура

Миши меланомни клетки B16F10 се култивират в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA). MNT-1 клетки от човешки меланом се отглеждат в минимална есенциална среда (MEM, Hyclone). Всички среди бяха допълнени с 10% феталбовинен серум (FBS, Hyclone, САЩ) и 1% разтвор на пеницилин-стрептомицин. Нормални човешки епидермални меланоцити (NHEM, PromoCell, Хайделберг, Германия) при пасаж номер 5 или 6 се поддържат в среда за растеж на меланоцити (PromoCell). Тези клетки бяха инкубирани при 37 ◦C в условия на влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2.

2.2. Пречистване на екзозоми

Търговското мляко (1 mL) се центрофугира при 2000× g за 10 min, след което супернатантата се центрофугира при 10, 000× g за 10 min. Млечният супернатант се прекарва през 0.45 цт филтър и след това 0.2 цт филтър. Полученият разтвор (300 µL) се смесва с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и 300 µL от разтвора за утаяване на екзозома Exoquick (Systems Biosciences, Пало Алто, Калифорния, САЩ) и се инкубира за 30 минути. Сместа се центрофугира при 10 000 × g за 30 минути, за да се получи екзозомна пелета, която след това се ресуспендира в PBS. Разпределението на размера на екзозомите се определя на Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, Франция). Екзозомите се съхраняват при -80 ◦C за по-нататъшна употреба.

2.3. Криоелектронна микроскопия

Аликвотна част от 3 µL суспензия от пресни екзозоми се адсорбира към перфорирана решетка с нажежен разряд, покрита с въглерод (2/2-3 C C-flat; Protochips, Morrisville, NC, USA), която след това се попива за 3 s при 4 ◦C и замразени чрез потапяне с помощта на Vitrobot Mark IV (Thermo FisherScientific, Лафайет, Колорадо, САЩ). Решетките се съхраняват в течен азот, след което се прехвърлят в държач за крио образци Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, Калифорния, САЩ). Пробите бяха изобразени при номинално увеличение от 29,000× в криоелектронен микроскоп (FEI Tecnai F20 TEM,FEI, Hillsboro, OR, USA), оборудван със стандартен пистолет за полеви емисии (s-FEG) и камера K2Summit (Gatan) при ускоряващо напрежение 200 kV.

2.4. Тест за клетъчна жизнеспособност (WST тест)

Меланомни клетки (B16F10, MNT-1) и човешки меланоцити (NHEM) се посяват при 4 × 103 клетки/ямка в 96-ямкови плаки и се третират смлечни екзозоми(20 и 50 µg/mL) или микроРНК имитатор (РНК двуверижни олигонуклеотиди) за всеки експеримент. В посочените времеви точки жизнеспособността на клетките беше измерена с помощта на комплекта за анализ на подобрена клетъчна жизнеспособност EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Сеул, Корея) съгласно инструкциите на производителя. Абсорбцията се измерва при 450 nm на спектрофотометър за микроплака Vmax (Molecular Devices, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).

2.5. Измерване на съдържанието на меланин

Меланомните клетки и меланоцитите бяха третирани смлечни екзозоми(20 и 50 µg/mL) за 48 часа. След два пъти промиване с ледено студен PBS, клетките се центрофугират при 2500 × g за 10 минути. Клетъчните пелети бяха ресуспендирани при 90 °C за 30 минути в 1 N NaOH, съдържащ 10 процента диметилсулфоксид. Общото съдържание на меланин се измерва на Vmax microplateспектрофотометър (Molecular Devices) при 405 nm.

2.6. Анализ на тирозиназната активност

Меланомните клетки и меланоцитите се инкубират смлечни екзозомиза 48 ч. Клетките се промиват два пъти с PBS и се лизират с PBS, съдържащ 1 процент Triton X -100 и 0.1 mMphenylmethanesulfonyl fluoride. След центрофугиране, супернатантата се събира и прехвърля в 96-плака с ямки. След добавянето на 0.1 ML-3,4-дихидроксифенилаланин, пробите се инкубират при 37 ◦C за 1 час. Тирозиназната активност се измерва на базата на абсорбцията при 475 nm, като се използва спектрофотометър за микроплака (Molecular Devices).

herba cistanches

2.7. Човешки кожни тъкани

Епидермални еквиваленти, съдържащи меланоцити (MelanoDerm, MEL-300B) бяха получени от MatTek (Ashland, MA, САЩ) и бяха поддържани в EPI-100-NMM-113-среда.Млечни екзозомибяха приложени към тъканите на MelanoDerm на дни 1, 3, 7, 9 и 12. PBS беше използван като отрицателна контрола. Тъканите бяха фотографирани на дни 3, 7, 9, 12 и 14. Пигментацията беше измерена чрез сравняване на промените в стойността на L (Adobe PhotoshopCC 2015). Съдържанието на меланин в човешката кожна тъкан се измерва на 14-ия ден чрез анализ на Solvablemelanin. Накратко, тъканите MelanoDerm се солюбилизират с помощта на Solvable (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и се инкубират за една нощ при 60 ◦C. Пробите се разбъркват на вортекс и след това се центрофугират при 16 500 × g за 5 минути. Супернатантата се прехвърля в ямките на 96-плака с ямки и се отчита при 490 nm чрез спектрофотометър.

3. Резултати

3.1. Характеризиране на екзозомите, изолирани от мляко

За да изследваме характеристиките на екзозомите, извлечени от краве мляко, първо измерихме размера на екзозомите чрез динамично разсейване на светлината. В резултат на това е установено, че екзозомите, извлечени от мляко, имат диаметър 80–190 nm (Фигура 1А). Замлечна екзозомапречистване, сместа Exoquick-млечен супернатант се центрофугира, за да се получи млечна екзозомна пелета. Експресията на CD9, TSG101 и HSP70 като екзозомни маркери беше открита в пелети, но тези протеини не присъстваха в супернатанта (Фигура 1А). В допълнение, сферичната морфология и размерът на екзозомите бяха потвърдени чрез криоелектронна микроскопия (Фигура 1B). Установено е, че екзозомите имат кръгла форма с диаметър до 200 nm. След това проучихме дали екзозомите, извлечени от млякото, са поети от клетките. Миши B16F10 клетки се инкубират смлечни екзозомибелязан с липофилно флуоресцентно багрило PKH26. В резултат на това наблюдавахме, че белязаните екзозоми присъстват вътре в клетките (Фигура S1).

3.2. Активността на тирозиназата и производството на меланин, потиснати от млечните екзозоми в B16F10 клетки

След това изследвахме ефекта на извлечените екзозоми върху жизнеспособността на клетките. Както е показано на Фигура 2А, ние разкрихме, че няма значителна разлика в жизнеспособността на клетките, независимо от концентрацията на екзозома.

За изследване на възможните кожни клетки-избелванеефект намлечни екзозоми, клетките бяха третирани с млечни екзозоми. Открихме, че активността на тирозиназата в клетки, изложени на млечни екзозоми при концентрации от 20 или 50 µg/mL, намалява съответно с 43 процента и 59 процента (Фигура 2B). Тъй като намаляването на активността на ензима тирозиназа може да инхибира биосинтезата на меланин, съдържанието на меланин се измерва след третиране с млечни екзозоми. Отбелязахме инхибиране на синтеза на меланин в клетки, изложени намлечни екзозоми(20 или 50 µg/mL) съответно с 45 процента и 55 процента (Фигура 2C). Освен това, експресията на MITF иРНК намалява, тъй като концентрацията на млечни екзозоми се увеличава. Нивото на MITF иРНК намалява с 59 процента в клетките, третирани с 20 µg/mL екзозоми и с 84 процента в клетките, третирани съответно с 50 µg/mL екзозоми (Фигура 2D). Експресията на иРНК на тирозиназа (TYR) също е намаляла с 49 процента и 76 процента в клетките, изложени на тези концентрации на екзозоми (Фигура 2D). Нивата на протеин MITF и тирозиназа също намаляват с концентрацията на млякотоекзозомиувеличен (Фигура 2E). Тези резултати предполагат, че млечните екзозоми инхибират меланогенезата в миши B16F10 клетки.

3.3. Специфичен за говеда miR-2478 от млечни екзозоми потиска меланогенезата

За да се определи дали miR-2478 произлиза отмлечни екзозомипряко засяга меланогенезата, инхибиторът на miR-2478 е трансфектиран в клетките, изложени на млечни екзозоми (50 µg/mL). В присъствието на млечни екзозоми, B16F10 клетки, трансфектирани с themiR-2478 инхибитор, показват значително по-висока тирозиназна активност в сравнение с тази в контролата (Фигура 4А). Съдържанието на меланин също е по-високо в клетките, третирани с miR-2478 инхибитор, отколкото в контролните клетки (Фигура 4В). Експресията на MITF иРНК беше –2.{10}}пъти по-висока в клетките, третирани с инхибитор на miR 2478, отколкото в контролните клетки, а експресията на TYR иРНК беше –2-кратно по-висока, когато miR-2478 беше инхибиран (Фигура 4C ). Нивата на MITF и TYR протеини също се възстановяват в клетките, изложени намлечни екзозомислед като тези клетки бяха трансфектирани с miR-2478 инхибитора (Фигура 4D). Тези резултати предполагат, че miR-2478, получен от млечни екзозоми, директно потиска меланогенезата в миши меланомни клетки.

3.4. Млечните екзозоми потискат меланогенезата чрез Akt-GSK3 пътя

След това проверихме как дамлечни екзозомирегулираммеланогенезаза идентифициране на съответния засегнат път в меланомните клетки. Въпреки че не е известно дали Rap1a директно контролира меланогенезата, се съобщава, че Rap1a инхибира Akt фосфорилирането на ракови клетки [20]. Въз основа на тази информация, ние проучихме дали Rap1a модулира Akt пътя за насърчаване.

В свързаните с актмеланогенезапът, активиран Akt индуцира фосфорилирането на Gsk3 при Ser9 и по този начин го инактивира; тази промяна инхибира транскрипционната активност на MITF и понижава тирозиназата [21,22]. В настоящото изследване ние оценихме експресията на Akt и GSK3 в клетки, третирани с Rap1a siRNA. В тези клетки, активирането на Akt фосфорилирането се увеличава и количеството на pGSK3 също се увеличава (Фигура 7А). GSK3 се инактивира чрез активиране на Akt по зависим от концентрацията начин в клетките, третирани с 20 или 50 µg/mL отмлечни екзозоми(Фигура 7B). Нивата на протеините Akt и GSK3 в клетките, третирани с miR-2478мимиката, са в съответствие с горните резултати (Фигура 7C). След това тествахме дали miR-2478от млечни екзозоми засяга пътя на Akt-GSK3. В присъствието на млечни екзозоми, фосфорилирането на протеините Akt и GSK3 е по-ниско в клетките, третирани с themiR-2478 инхибитора (Фигура 7D). В допълнение, лечението с AKT инхибитора GSK690693 повишава експресията на гени, свързани смеланогенезав клетки, третирани с млечни екзозоми. (Фигура 7E). Тези констатации означават, че miR-2478 вмлечни екзозомирегулира надолу Rap1a и потиска меланогенезата чрез Akt-GSK3 пътя.

цистанче билкаизбелващ ефект върху кожата до антиоксидация

3.8. Млечните екзозоми инхибират меланогенезата в човешки меланомни клетки, меланоцити и меланодермна тъкан

Като се има предвид товамлечни екзозомиинхибиранмеланогенезав миши клетки, след това определихме дали млечните екзозоми са еднакво ефективни в човешки клетки. Първо, жизнеспособността на MNT-1 човешки меланомни клетки и NHEM човешки меланоцити бяха изследвани след инкубиране с 20 или 50 ug/mL млечни екзозоми. Както е представено на Фигура 8А, няма разлика в жизнеспособността. Тирозиназната активност се инхибира съответно с 43 процента и 85 процента в MNT-1 клетки, изложени на 20 ug/mL или 50 ug/mL млечни екзозоми (Фигура 8В). NHEM също беше намален с 34 процента и 66 процента, съответно, чрез лечение с 20 ug/mL или 50 ug/mL млечни екзозоми (Фигура 8B). Освен това, съдържанието на меланин беше измерено в MNT-1 клетки и NHEM, изложени на млечни екзозоми. В резултат на това синтезът на меланин в MNT-1 клетки, изложени на 20 ug/mL или 50 ug/mL отмлечни екзозомибеше инхибирано съответно с 37 процента и 58 процента, а в клетките NHEM лечението с млечни екзозоми възпрепятства синтеза на меланин съответно с 36 процента и 62 процента (Фигура 8C). Освен това изсветляващият кожата ефект намлечни екзозомибеше допълнително потвърдено с помощта на човешки кожни тъкани. След третиране с млечни екзозоми в човешки тъкани, отнизбелване ефектите са наблюдавани на Дни 3, 9, 12 и 14. В резултат открихме, че цветът на кожата в тъканите, изложени на млечни екзозоми, изглежда по-ярък от този в контролните тъкани (Фигура 8D). Степента на пигментация се изчислява като L стойност, която е стойност, представляваща яркост. Пигментацията прогресира по-бавно в кожните тъкани, третирани с млечни екзозоми, отколкото в контролните кожни тъкани (Фигура 8D). Експерименталната група, лекувана смлечни екзозомипоказаха по-малък размер на частиците меланин и ниско количество меланинов пигмент в сравнение с контролната група (Фигура 8E). В резултат на измерване на съдържанието на меланин след 14 дни млечните екзозоми инхибират синтеза на меланин в човешките тъкани (Фигура 8F). Следователно заключихме, че млечните екзозоми инхибиратмеланогенезав човешките клетки и тъкани.

4. Обсъждане

Изследвания върху регулирането на екзозомитемеланогенезасъобщават, че екзозомите, получени от кератиноцити, имат избелващ ефект. Меланоцитите и околните кератиноцити са функционално свързани, за да образуват меланинови единици в епидермиса на кожата [23,24]. Разтворимите фактори, получени от кератиноцитите, регулират меланогенезата на съседните меланоцити. Екзозомите, секретирани от нормални кератиноцити, насърчават меланогенезата чрез регулиране на експресията намеланогенеза-свързани протеини [23–25]. Освен това в aизбелванепроучване, използващо екзозоми, извлечени от клетки, наскоро беше съобщено, че екзозомите, извлечени от стволови/стромални клетки, получени от хуманна мастна тъкан, показват ефикасност за изсветляване на кожата в клетките на миши меланом [26]. Имаше също доклад, че екзозомите, извлечени от растения, имат избелващ ефект. Екстрацелуларните везикули, извлечени от листата и стъблата на растението D. morbifera, показват антимеланогенни ефекти върху миши меланомни клетки и здрава човешка кожа [27]. В нашето проучване беше изследван избелващият ефект на екзозомите, получени от мляко.

В сравнение с екзозомите, извлечени от кръвна плазма или културална течност, екзозомите, получени от мляко, имат предимствата, че не само имат големи количества екзозоми, които могат да бъдат извлечени за единица обем, но и ниска цена [26,27]. защотомлечни екзозомиимат химичен състав, подобен на този на клетъчните мембрани, те проявяват по-ниска имуногенност и цитотоксичност и имат висока биосъвместимост [28,29]. Наскоро, когато млечни екзозоми бяха хранени на DSS (декстран сулфат натриева сол)-индуциран модел на колит мишки, експресията на провъзпалителните цитокини IL-6 и TNF намаля в сравнение с контролната група, като по този начин се намали възпалението и се подобри некротизиращият ентерит [30, 31]. В допълнение, поглъщането на млечни екзозоми в миши модел на остеопороза подобрява артрита чрез увеличаване на костната плътност и намаляване на провъзпалителните цитокини [32,33]. Досега ефектите на млечните екзозоми са фокусирани върху имунологични явления, които намаляват провъзпалителните цитокини и върху развитието на костите, като облекчаване на ентерит и подобряване на остеопороза. В това изследване, освен начина на приеманемлечни екзозоми, беше потвърдено, че когато се прилага върху кожата, той е ефективен върху кожатаизбелване. Това показва, че може да се прилага за лечение на различни заболявания чрез повишаване на физиологичната активност с помощта на млечни екзозоми в бъдеще.

Въпреки че това проучване предполага, чемлечни екзозомиинхибираммеланогенеза, вече е известно, че суроватъчните протеини като казеин, -лактоглобулин и -лакталбумин имат избелващ ефект. -лактоглобулинът намалява активността на тирозиназата в човешките меланоцити [18], а k-казеинът инхибира меланогенезата в миши B16 меланомни клетки [17]. Интересното е, че много от тези компоненти присъстват и в млечните екзозоми. Според протеомерните резултати на млечните екзозоми, казеин, -лактоглобулин и -лакталбумин се разпределят в екзозомите [15,34,35]. Млечните екзозоми съдържат микроРНК, както и протеини. В резултат на miRNA микрочип, използващ млечни екзозоми от Izumi и колеги, miR-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b и miR{{16 }} бяха силно разпространени в млечните екзозоми [13]. В това изследване, с изключение на miR-2478, сред тези микроРНК, miR-1777b, miR-1777a,let-7b и miR-1224 показват няма разлика в активността на тирозиназата от контролната група (Фигура S2). miR-2478 беше най-изобилен вмлечни екзозомии намалена активност на тирозина. Въпреки това, експресията на MITF и TYR гените, свързани с избелването, намалява повече в клетките, третирани смлечни екзозомиотколкото в клетките, третирани само с miR{0}}мимиката. Тези резултати показват, че няколко компонента, включително микроРНК в млечните екзозоми, участват визбелванедействие.

Повечето от микроРНК в млечните екзозоми упражняват биологични функции чрез инхибиране на експресията на целевите гени в реципиентните клетки. В това проучване miR-2478 също инхибира синтеза на меланин чрез насочване към Rap1a като целеви ген. Въпреки че не са микроРНК, получени от мляко, микроРНК, които контролират експресията на гени, свързани с избелването, вече са докладвани. Когато човешкият miR-27a-3p мимик беше приложен към меланоцити на мишка, той инхибира експресията на Wnt3a и по този начин инхибира синтеза на меланин [36], а извънматочната miR-218 инхибира активността на TYR чрез намаляване на експресията на MITF в миши меланомни меланоцити [37]. miR-203 популяризирамеланогенезапрез CREB1/MITF/Rab27apathway чрез насочване към Kif5b в меланом [38]. В млечните екзозоми има 79 микроРНК

микроРНК вмлечни екзозомиполучени от крави [13]. Следователно са необходими допълнителни изследвания на физиологичната активност на млечните екзозоми.

5. Изводи

Нашите открития показват товамлечни екзозомиса кандидати за антимеланогенни средства, които намаляват пигментацията чрез инхибиране на експресията на гени, свързани с меланина (Фигура 10). В клетките на меланома и меланоцитите млечните екзозоми показват инхибиране на TYR и намаляване на съдържанието на меланин в сравнение с отрицателната контрола. В допълнение, тези ефекти са медиирани от miR-2478 отмлечни екзозоми. Следователно млечните екзозоми могат да бъдат полезни за развитието на функционалниизбелванекозметика с ниска цитотоксичност.

цистанчеизбелващ ефект върху кожата до антиоксидация